一种动物诱食、替抗用饲料添加剂及其制备方法

1.本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及一种动物诱食、替抗用饲料添加剂及其制备方法。


背景技术：

2.长期以来，饲用抗生素对养殖生产效益的贡献匪浅，在饲料中添加抗生素可在某种程度上抑制微生物的生长繁殖、调节免疫、改善消化道的组织结构以促进营养物质的消化吸收和动物生长。但与此同时耐药性等风险俨然存在，此前，农业农村部发布第194号文明确规定2020年12月31日后流通使用的饲料不得含有促生长类药物饲料添加剂，禁抗锤子已然落地。养殖场要维持生产效益就要制定对应的替抗方案，替抗方案的选择既要对标抗生素的功能作用，也要对标抗生素的低成本优势。目前涌现出了很多类型的替抗产品，例如发酵饲料、酶制剂、抗菌肽、酸化剂、微生态制剂、中草药及植物提取物等，但是缺乏具有广谱抑菌、高效、生物安全性高的低成本替抗产品。
3.很多发明和研究指出二烷基硫代亚磺酸酯是一种绿色、无残留的广谱抑菌、杀菌、降低动物疾病产生率、促进动物生长、提升免疫力的理想饲料替抗添加剂。并且可通过气味吸引动物使之产生食欲，从而增加采食量和提高饲料转化率。目前大多依靠从大蒜、洋葱等植物提取获得，例如专利cn103037856a利用从大蒜中提取二烷基硫代亚磺酸酯对抗家禽、单胃动物和反刍动物体内的寄生虫。但是靠从植物中加工提，存在一定的弊端：制备工艺繁琐，提取得率低，制备成本高且二烯丙基硫代亚磺酸酯本身稳定性差，这些不足极大的限制了其在动物饲养领域的应用。
4.由于大蒜、洋葱等植物中二烷基硫代亚磺酸酯是由烷基半胱氨酸亚砜酶催化底物s-烯丙基-l-半胱氨酸亚砜所产生的，故有研究者考虑用生物法获得植物源的烷基半胱氨酸亚砜酶，以期获得高性价比的二烯丙基硫代亚磺酸酯。但是结果显示在大肠杆菌中异源表达会出现重组蛋白包涵体严重的问题，并且酶活低于用化学方法从植物中提取的酶。也有将植物源的烷基半胱氨酸亚砜酶构建到酿酒酵母和毕赤酵母中的例子，但是最后的酶活低于天然的酶。例如专利cn105838729a中运用随机突变的技术将大蒜鳞茎的野生烷基半胱氨酸亚砜酶在枯草芽孢杆菌表达系统和毕赤酵母中进行了表达，最后比酶活较野生型提高了50％，但是在枯草芽孢杆菌和毕赤酵母中的比酶活最高也分别仅仅只有105.34u/mg，173.72u/mg。
5.故如何制备一种具有高稳定性、制作工艺简单、广谱抑菌、高效、生物安全性高的低成本替抗产品是当务之急。


技术实现要素：

6.本发明的目的是解决现有技术中的问题，提供一种动物诱食、替抗用饲料添加剂及其制备方法。利用微生物发酵法获得高产细菌源s-烷基-l-半胱氨酸亚砜裂解酶lcc1，再通过生物催化的方式合成高浓度杀菌物质二烯丙基硫代亚磺酸酯以及蒜味浓郁的诱食性
化合物烯丙基硫醇，达到实现制备稳定性高、成本低的高效诱食性替抗饲料添加剂的目的。
7.本发明的技术方案是：
8.一种动物诱食、替抗用饲料添加剂，包括细菌源s-烷基-l-半胱氨酸亚砜裂解酶lcc1和底物s-烯丙基-l-半胱氨酸、s-烯丙基-l-半胱氨酸亚砜，酶催化两种底物。
9.其中s-烷基-l-半胱氨酸亚砜裂解酶lcc1的蛋白序列为：
10.mkdlvylnyaatsykkfpatiealtaylaenqfmnygrnapllreglplletrqlladffqapsaaqitftnnattslnlalagilqpgdhvittmlehhavarplhllekergisvtyvacqktglldvediqrawrtntkalvmthasnvlgtilpieecfqwaqqkglltvldaaqtagflpikmtqmaidvlaftghkslyglagigglafsergaeavkplmaggtgshsnsfdqpsflpdkfeagtlnslgilslnssikelnkiglaaiqkhertlmqnflnglsglpvtilgtkdvaqtvpvvsitlwnqeetvvaqqlaeqygimtraglhcaplahetagtlatgtlrfsfgwqttpeeitwtihalqelli。
11.底物s-烯丙基-l-半胱氨酸、s-烯丙基-l-半胱氨酸亚砜的分子式分别为c6h
11
no2s、c6h
11
no3s。
12.作为一种优选的技术方案，还包括激活剂plp，s-烷基-l-半胱氨酸亚砜裂解酶lcc1与激活剂plp比例为1000:(1～5)。
13.一种动物诱食、替抗用饲料添加剂的制备方法为：
14.一、菌株构建发酵产酶
15.所述s-烷基-l-半胱氨酸亚砜裂解酶lcc1是通过表达载体在宿主细胞中表达获得；进一步地，宿主细胞可以是大肠杆菌或者毕赤酵母；进一步地，宿主细胞可以是枯草芽孢杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母；进一步地，表达载体可以是pht43、pht01、pht08、pht9、pht10、pyes-dest52、ppic9、ppic9k、phil-s1和ppiczαa等。
16.更进一步地，具体制备过程为：
17.(1)选择生物安全菌株毕赤酵母gs115及整合载体ppic9k实现s-烷基-l-半胱氨酸亚砜裂解酶lcc1的整合表达；
18.(2)将蛋白序列经过密码子优化合成后进行整合表达构建；通过遗传霉素高抗性筛选获得抗生素耐受能力达到1500μg/ml的整合表达菌株，通过对不同发酵培养基、不同发酵工艺进行优化获得高比酶活达5400u/mg；
19.(3)发酵结束后，将发酵液喷雾干燥获得酶粉：发酵液中加入流化剂(w/w)：糊精5～20％，玉米淀粉15～25％，100rpm/min搅拌20～30min；
20.(4)喷雾干燥：进风口温度为150～180℃，出风口温度为70～80℃，蠕动泵转速2000ml/h。
21.为提高蛋白表达量，将蛋白序列经过密码子优化合成后进行整合表达构建；通过遗传霉素高抗性筛选获得抗生素耐受能力达到1500μg/ml的整合表达菌株，说明筛选菌种为多拷贝插入的整合菌株且蛋白表达量显著提高；通过对不同发酵培养基、不同发酵工艺进行优化获得高比酶活达5400u/mg。
22.二、底物制备
23.1、制备s-烯丙基-l-半胱氨酸方法
24.于5：1～4：1的乙醇水溶液中加入终浓度为0.8～4.5mol/l的氢氧化钠颗粒搅拌溶解，加入终浓度为0.4～2.5mol/l的l-半胱氨酸固体，待到完全溶解后加入与半胱氨酸相同
摩尔浓度的溴丙烯，边搅拌边反应5～12h。用乙酸调节溶液的ph为4～6，过滤，于烘箱烘干即得s-烯丙基-l-半胱氨酸。
25.2、制备s-烯丙基-l-半胱氨酸亚砜的方法
26.取“1”中所制得的s-烯丙基-l-半胱氨酸与双氧水按照质量体积比为(1～3)g：(6～2)ml，反应5分钟。加入预冷乙醇，烘干即得s-烯丙基-l-半胱氨酸亚砜。
27.三、生物催化法制备烯丙基硫醇
28.室温条件下，s-烷基-l-半胱氨酸亚砜裂解酶lcc1与底物s-烯丙基-l-半胱氨酸按照(1～10)：(10～1)的比例混匀反应15～30分钟。反应体系中按照酶与plp比例为1000:(1～5)的量加入plp，用以提高酶活，这是基于plp作为s-烷基-l-半胱氨酸亚砜裂解酶lcc1的辅酶，它的存在能够明显提高s-烷基-l-半胱氨酸亚砜裂解酶lcc1的活力。催化反应产生的具有浓郁蒜味的烯丙基硫醇通过气味吸引动物使之产生食欲，从而增加采食量和提高饲料转化率。
29.四、生物催化法制备二烯丙基硫代亚磺酸酯
30.s-烷基-l-半胱氨酸亚砜裂解酶lcc1与底物s-烯丙基-l-半胱氨酸亚砜按照(1～10)：(10～1)的比例混匀20～60分钟，同样的在反应体系中加入激活剂plp，得到二烯丙基硫代亚磺酸酯。
31.五、产品制备
32.将喷雾干燥干粉、s-烯丙基-l-半胱氨酸、s-烯丙基-l-半胱氨酸亚砜和激活剂plp按照(1～10)：(10～1)：(10～1)：(0.001-0.005)的比例混合。产品可用于生产饲料预混料、颗粒饲料，添加量为100～300g/吨饲料。也可使用时加入动物饮用水中，日常添加量为100～300mg/l饮用水。用于治疗由于病原菌引起的动物肠炎腹泻、鸡球虫病、鸡住白细胞虫病、水产养殖中鱼虾蟹诱食及鱼虾蟹病害防治等，用量为1～5g/l，每次用量1～3ml。
33.将发酵液、s-烯丙基-l-半胱氨酸、s-烯丙基-l-半胱氨酸亚砜、激活剂plp、糊精按照(1～50)：(10～1)：(10～1)：(0.001～0.005)：(0.1～0.5)的比例混合形成动物饮用水添加产品。使用时加入动物饮用水中，日常添加量为100～300mg/l饮用水。
34.本发明的有益效果为：
35.(1)与现有技术相比，本发明通过毕赤酵母多拷贝整合表达、发酵优化实现新型s-烷基-l-半胱氨酸亚砜裂解酶lcc1的高活性，比酶活高达5400u/mg，明显高于专利cn105838729a中在枯草芽孢杆菌和毕赤酵母中的比酶活105.34u/mg，173.72u/mg。使用细菌源s-烷基-l-半胱氨酸亚砜裂解酶lcc1并获得高产表达为国内首次。
36.(2)以底物s-烯丙基-l-半胱氨酸亚砜的含量计算，产品对于动物肠道致病菌大肠杆菌、产气荚膜梭菌、金黄色葡萄球菌的mic值分别达11.5μg/ml、2.85μg/ml、5.7μg/ml，对革兰氏阳性和阴性菌都有突出的抑制效果。
37.(3)产品通过动物实验证明，用于肠道病原菌感染的防治具有明显效果，鸡发病率显著降低，肠炎腹泻治愈率高。产物为天然可食化合物且通过生物合成，生物安全性高，可应用于多种饲料产品添加。
38.(4)采用s-烷基-l-半胱氨酸亚砜裂解酶lcc1与底物随用随反应产生二烯丙基硫代亚磺酸酯的方式，简单有效规避二烯丙基硫代亚磺酸酯抗菌活性不稳定的缺陷，在本领域属于首创。
39.(5)采用蒜味浓郁的烯丙基硫醇协同二烯丙基硫代亚磺酸酯增加动物采食量这一技术组合在本领域属于首创。
40.(6)采用常规的发酵操作获得高效低成本的酶，填补了该酶植物同工酶异源表达差难以工业化应用的空白。
附图说明
41.图1为转化子验证图；
42.图2为发酵不同时间点样品比酶活测定；
43.图3为产品对各受试菌种的mic值。
具体实施方式
44.为了使本发明的技术手段、技术特征、发明目的与技术效果易于明白了解，下面结合具体图示，进一步阐述本发明。
45.实施例1：
46.毕赤酵母pichiapastoris gs115的整合表达菌种构建，其中s-烷基-l-半胱氨酸亚砜裂解酶lcc1的蛋白序列为：
47.mkdlvylnyaatsykkfpatiealtaylaenqfmnygrnapllreglplletrqlladffqapsaaqitftnnattslnlalagilqpgdhvittmlehhavarplhllekergisvtyvacqktglldvediqrawrtntkalvmthasnvlgtilpieecfqwaqqkglltvldaaqtagflpikmtqmaidvlaftghkslyglagigglafsergaeavkplmaggtgshsnsfdqpsflpdkfeagtlnslgilslnssikelnkiglaaiqkhertlmqnflnglsglpvtilgtkdvaqtvpvvsitlwnqeetvvaqqlaeqygimtraglhcaplahetagtlatgtlrfsfgwqttpeeitwtihalqelli。
48.(1)将s-烷基-l-半胱氨酸亚砜裂解酶lcc1蛋白序列根据p.pastoris gs115进行密码子优化合成，设计引物，送交生工合成。
49.(2)ppic9k表达载体质粒提取，并用xho i/ecor i双酶切，跑琼脂糖凝胶电泳，并用quick gel extraction kit(全式金)胶回收试剂盒对双酶切后载体dna进行回收。
50.酶切反应体系(100μl)：转化子质粒dna 80μl；xho i 5μl；ecor i 5μl；10
×
buffer 10μl。
51.酶切反应条件：37℃60min。
52.(3)以lcc1-xho i f/lcc1-ecor i r(各20μm)为引物，s-烷基-l-半胱氨酸亚砜裂解酶lcc1基因序列为模板，pcr扩增s-烷基-l-半胱氨酸亚砜裂解酶lcc1基因。
53.pcr反应体系(50μl)：模板dna 0.5μl；lcc1-xho i f 1μl；lcc1-eco r i r 1μl；2.5mm dntps 5μl；5
×
transstartfastpfu buffer 10μl；transstart fastpfu dnapolymerase 1μl；ddh2o补足至50μl。
54.pcr条件：95℃5min；95℃30s，53℃30s，72℃90s，30个循环；72℃
55.5min。
56.对pcr后产物跑tae胶，用胶回收试剂盒回收目的基因。
57.(4)将回收的s-烷基-l-半胱氨酸亚砜裂解酶lcc1基因片段和ppic9k质粒片段进行连接。
58.连接反应体系(10μl)：lcc15.5μl；ppic9k 1.5μl；t4 dna连接酶1μl；5
×
buffer 2μl。
59.连接反应条件：25℃40min。
60.(1)连接产物转化感受态细胞e.coli dh5α。
61.(2)挑取转化子于lb培养基(50μg
·
ml-1
卡那霉素)中，37℃振荡培养12h，并提取质粒dna。
62.(3)xho i/ecor i双酶切转化子质粒ppic9k-lcc1，0.5
×
tbe琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果。
63.(4)用15％甘油保存正确转化子，-20℃备用，同时送交生工进行基因片段全长测序。
64.(5)将含有s-烷基-l-半胱氨酸亚砜裂解酶lcc1基因序列的重组质粒进行sac i单酶切线性化，跑胶，并用胶回收试剂盒进行回收。
65.(6)制作p.pastoris gs115感受态细胞，将线性化后的重组表达载体电转导入毕赤酵母感受态细胞，复苏，涂布ypd平板(200μg
·
ml-1
遗传霉素)。
66.(7)挑取转化子于ypd培养基(200μg
·
ml-1
遗传霉素)30℃振荡培养，并提取基因组。
67.(8)pcr并电泳验证结果，如图1所示1、2号转化子正确，用15％甘油保存正确转化子，-20℃备用。
68.(9)将正确转化子培养液在不同浓度抗性(600、800、1000、1200、1500、
69.2000μg
·
ml-1
遗传霉素)条件下培养，保存耐受高抗性条件下的转化子备用。
70.实施例2：
71.发酵获得高酶活的酶
72.一级种子培养：在ypd平板上挑单菌落至3mlypd培养基，30℃，250rpm，培养12h；
73.二级种子培养：将上述一级种子培养液按3％接种量转接到500ml装液量100ml的bmgy二级种子液中，30℃，220rpm，培养至od
600
到10-12范围；
74.5l发酵罐发酵：将上述二级种子液以10％的接种量接种到5l的发酵罐中，发酵培养基为bsm培养基。控制温度28℃，ph 6.0，溶氧在20％以上。待bsm中甘油耗尽溶氧上升后，流加含有12ml/l(v/v)ptm1的50％(w/v)甘油，待od
600
到125时停止流加甘油，饥饿培养0.5-2h，用8g/(l
·
h)的速率流加含有12ml/l(v/v)ptm1的100％甲醇进行诱导，期间每12h取样测定酶活，由图2可知，诱导96h后获得最高比酶活5400.13u/mg。
75.酶活定义：s-烷基-l-半胱氨酸亚砜裂解酶lcc1每催化1分子s-烯丙基-l-半胱氨酸亚砜发生反应会产生2分子丙酮酸，因此可通过测定丙酮酸的浓度来推算酶活。因此本发明酶活的定义为：在37℃条件下，s-烷基-l-半胱氨酸亚砜裂解酶lcc1催化s-烯丙基-l-半胱氨酸亚砜的反应，每分钟产生lμg丙酮酸定义为1个活力单位(u)。
76.实施例3：
77.病原菌抑菌实验
78.选择三种鸡源致病菌，大肠杆菌、产气荚膜梭菌和金黄色葡萄球菌作为受试菌种。
按照clsi标准进行抑菌实验。采用的方法是在96孔板中运用肉汤比浊稀释法，其原理是以一定浓度的产物与含有测试菌的液体培养基进行一系列的倍数稀释，经培养后观察其是否有肉眼可见的测试菌生长，并将产物能抑制测试菌肉眼可见生长的最低浓度定义为产物的最低(或最小)抑菌浓度(mic)。96孔板每一行有12个孔，根据clsi标准将受试菌液稀释到每孔浓度为5
×
105cfu/ml。之后1～11孔添加菌液，其中第一孔添加190μl菌液，第2-11孔各添加100μl菌液，第11孔不添加药液作为阳性对照，第12孔添加无菌的mh培养基作为空白对照。
79.取酶干粉、s-烯丙基-l-半胱氨酸、s-烯丙基-l-半胱氨酸亚砜和plp按照(1～10)：(10～1)：(10～1)：(0.001-0.05)的比例混合适量，加一定量水完全溶解后，将产物取10μl加入第一个孔后充分吹吸混匀，然后取100μl加入下一孔吹吸混匀，按照2倍稀释法充分稀释，到第10孔吹吸混匀后取100μl打掉，第11孔不做任何处理。按照底物s-烯丙基-l-半胱氨酸亚砜来计算，控制第一个孔的药物浓度为0.023g/ml，则之后的各孔药物浓度依次减半。加样完毕后将96孔板放入37℃恒温培养箱培养16～20h。先观察阳性对照应有细菌生长，阴性对照(空白mh肉汤)应无细菌生长，然后观察供试样品，肉眼可见细菌生长为混浊，无肉眼可见生长为澄清，澄清孔中对应的最低试样浓度判定为mic值。
80.经计算可得若以底物s-烯丙基-l-半胱氨酸亚砜的量来计，如图3所示，能够抑制这三种菌的最低底物浓度即mic值分别为11.5μg/ml、2.85μg/ml、5.7μg/ml。故本产品对于革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均具有优良的抑制效果，但对于金葡和产气荚膜梭菌等革兰氏阳性菌抑制效果更好。
81.实施例4：
82.产品治疗肉食鸡肠炎实验
83.试验动物：患有鸡肠炎的大肉食鸡鸡苗，0日龄饲养至7日龄，共500只。试验药物：替抗产品(本专利产品)、市场产品1、市场产品2、氨苄西林+安普霉素。
84.试验分组：1、3、4组为试验组。2组为药物对照组，使用抗生素。每个重复组20只鸡，每组5个重复。1组按照替抗产品与水1g/l浓度比例配置，集中饮水，连用7天；2组抗生素与水7g/l浓度比例配置，两种抗生素比例为1：1，集中饮水，连用7天；3组市场产品1与水6g/l浓度比例配置，集中饮水，连用7天；4组市场产品2与水0.4g/l浓度比例配置，集中饮水，连用7天；5组不做任何处理，为空白对照。所有实验对象100g饲料兑水200kg，连用7天。
85.测定指标及方法：(1)观察粪便状态。(2)生长指标：每日记录体重变化。分别于用药之前和用药之后，统计饲料消耗量，计算料重比。
86.料重比＝平均日采食量/平均日增重
87.结果：由表1与粪便情况可知，1组本专利产品试验后平均日增重最佳，料重比最低；粪便情况在实验组中属最优，总体疗效最好，总体疗效与抗生素组相当。所选两种市场替抗产品则效果不佳，料重比最低且稀便情况严重。
88.表1试验结果汇总表
[0089][0090]
综上所述仅为本发明较佳的实施例，并非用来限定本发明的实施范围。即凡依本发明申请专利范围的内容所作的等效变化及修饰，皆应属于本发明的技术范畴。