一种基于MIRA荧光法快速检测GAstV的检测方法

一种基于mira荧光法快速检测gastv的检测方法
技术领域
1.本发明涉及基因工程技术领域，具体为一种基于mira荧光法快速检测gastv的检测方法。


背景技术：

2.鹅星状病毒(gastv)是一种新发的可导致雏鹅以痛风为主要特征的传染性病原，给养鹅业及相关产业带来严重经济损失，然而目前检测gastv的常用方法是pcr，与mira相比该方法具有交叉污染且耗时长等缺点，不适用于大量临床样品的检测。而mira检测技术，具有特异性强、敏感性高、就地操作等优点，能在较短时间内完成病原体检测。
3.基于此，本研究建立了基于mira技术的gastv的检测方法，该方法操作简单，对仪器设备要求不高且二十分钟内就能得到结果，即使偏远地区也能对疫病进行实时监测，为流行病学的调查，掌握病原的传播规律以及防控提供支持。


技术实现要素：

4.(一)解决的技术问题
5.针对现有技术的不足，本发明提供了一种基于mira荧光法快速检测gastv的检测方法，解决了传统的pcr检测方法具有交叉污染且耗时长等，不适用于大量临床样本的检测的问题。
6.(二)技术方案
7.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种基于mira荧光法快速检测gastv的检测方法，包括以下步骤：
8.s1、组织样品的处理：将称取1g的各组织样品，加入1ml pbs放入研磨钵中研磨成匀浆，转移至无菌离心管中，在离心机中以8500rpm/min离心3min；
9.s2、病毒核酸的提取：使用某生化科技有限公司的病毒基因组dna/rna提取试剂盒(离心柱型)提取病毒rna；
10.s3、引物与探针设计：在genbank中检索鹅星状病毒的orf2基因，通过meglign软件分析比对，确定各自的高度特异性保守片段区域，在primer premier 5的辅助下，设计orf2基因特异性mira引物和探针；根据鹅星状病毒orf2基因片段大小为2115bp，在primer premier 5的辅助下设计全长引物，进行pcr扩增；
11.s4、pcr产物回收及纯化：根据sanprep柱式dna胶回收试剂盒说明书提取步骤操作，把扩增产物回收备用；
12.s5、标准质粒的构建：根据pmd
tm
19-t vector cloning kit使用说明书，构建pmd-19t-orf2重组质粒；
13.s6、重组质粒鉴定：取部分培养菌液进行测序服务，并在ncbi网站的blast功能和meglign软件与基因全长进行比对分析；
14.s7、质粒dna小量提取：根据sanprep柱式质粒dna小量抽提试剂盒使用说明书，提
取构建的pmd-19t-orf2重组质粒备用；
15.s8、建立鹅星状病毒荧光检测体系：
16.s81、体系建立：根据dna恒温快速扩增试剂盒(荧光型)使用说明书进行具体操作：首先将准备好的上下游引物、质粒dna、探针、ddh2o加入到含有冻干酶粉的反应管中，随后将b buffer添加到反应管的盖子上，经振荡混匀短暂离心后，迅速将反应管置于荧光定量pcr仪中，使其在最佳反应温度下恒温作用20min左右，每30s采集一次荧光信号，反应结束后，随即将反应产物在紫外光下照射，进行观察分析，进而进行荧光结果检测体系的建立；
17.s82、引物筛选：使用上一步建立的荧光结果检测体系，对鹅星状病毒的orf2基因的mira引物进行筛选，对比结果。
18.优选的，所述步骤s2具体步骤为：
19.s21、用移液器将20ul proteinase k加入一个干净的1.5ml离心管；
20.s22、向离心管中加入200ul血清；
21.s23、加入200ul carrier rna工作液，盖上管盖，涡旋振荡15s混匀；
22.s24、在56℃孵育15min，简短离心以手机附着在管壁及管盖上的液体；
23.s25、加入520ul无水乙醇，此时可能会出现絮状沉淀，盖上管盖并涡旋振荡15s，彻底混匀，在室温下(15-25℃)放置5min；
24.s26、简短离心以收集附着在管壁及管盖上的液体；
25.s27、仔细将离心管中的溶液和絮状沉淀全部转移至rnase-free吸附住cr2，盖上管盖，8000rpm离心1min，弃废液，将吸附住放回收集管中；
26.s28、小心打开吸附柱盖子，加入500ul缓冲液gd，盖上管盖，8000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱放回收集管中；
27.s29、小心的打开吸附柱盖子，加入600ul漂洗液pw，盖上管盖，静置2min，8000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱放回收集管中；
28.s210、重复步骤s29；
29.s211、小心打开吸附柱盖子，加入500ul无水乙醇，盖上管盖，8000rpm离心1min，弃废液；
30.s212、将吸附柱放回收集管中，12000rpm离心3min，使吸附膜完全变干，弃废液；
31.s213、将吸附柱放入一个rnase-free离心管中，小心打开吸附柱的盖子，室温放置3min，使吸附膜完全变干，向吸附膜的中间部位悬空滴加20-150ul rnase-free ddh2o，盖上盖子，室温放置5min，12000rpm离心1min。
32.优选的，所述步骤s3中，pcr体系为20μl，其中mix 10μl，上游引物1μl，下游引物1μl，dna模板1μl，灭菌水7μl。
33.优选的，所述方法还包括步骤s9、灵敏度试验：测量出质粒浓度，根据拷贝数浓度(copies/μl)＝[6.02
×
10
23
×
浓度(ng/μl)
×
10-9
]/[dna长度
×
660]公式，计算拷贝数浓度，以10倍稀释浓度分别稀释orf2基因重组质粒(pmd-19t-orf2)，稀释浓度为100copies/μl、101copies/μl、102copies/μl、103copies/μl、104copies/μl、105copies/μl、106copies/μl、107copies/μl、108copies/μl、109copies/μl并使用灭菌水(ddh2o)作为试验的阴性对照，反应体系使用本试验建立的体系进行灵敏度验证并与qpcr检测技术进行比较。
[0034]
优选的，所述方法还包括步骤s10、特异性试验：使用gocv、gpv、fadv-4的dna、
dtmuv、gpmv和grv的cdna为模板，阴性和阳性对照分别使用ddh2o和gastv的阳性样本，验证mira方法的特异性并将扩增产物在紫外灯下进行观察。
[0035]
优选的，所述方法还包括步骤s11、重复性试验：以重组质粒pmd-19t-orf2的103copies/μl、104copies/μl和105copies/μl为模板，每个浓度设置3个重复，进行组内重复性试验，在不同时间进行3次独立的试验，进行组间的重复性试验，计算变异系数(cv值)，以评价所建立的方法的稳定性。
[0036]
优选的，所述方法还包括步骤s12、临床样本检测：根据dna提取方法进行对临床样本进行dna的提取，采用本研究建立的mira方法对50份样本进行gastv的检测，同时，使用qpcr技术检测方法平行检测，比较两者的检出率情况，评价mira技术的临床应用的实用价值。
[0037]
(三)有益效果
[0038]
本发明提供了一种基于mira荧光法快速检测gastv的检测方法，具备以下有益效果：
[0039]
本发明公开的方法提高了生物学的检测效率，降低了检测门槛，节省了检测时间，并且操作简单，对仪器设备要求不高且二十分钟内就能得到结果，即使偏远地区也能对疫病进行实时监测，为流行病学的调查，掌握病原的传播规律以及防控提供支持。
附图说明
[0040]
图1为本发明pmd-19t-orf2质粒基因pcr扩增结果图；
[0041]
图2为本发明鹅星状病毒荧光引物筛选扩增结果图；
[0042]
图3为本发明鹅星状病毒的mira灵敏度试验结果图；
[0043]
图4为本发明鹅星状病毒的mira灵敏度扩增产物在紫外灯下观察结果图；
[0044]
图5为本发明鹅星状病毒的mira特异性试验结果图；
[0045]
图6为本发明鹅星状病毒的mira特异性扩增产物在紫外灯下观察结果图。
具体实施方式
[0046]
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0047]
本发明提供一种技术方案：一种基于mira荧光法快速检测gastv的检测方法，包括以下步骤：
[0048]
s1、组织样品的处理：将称取1g的各组织样品，加入1ml pbs放入研磨钵中研磨成匀浆，转移至无菌离心管中，在离心机中以8500rpm/min离心3min；
[0049]
s2、病毒核酸的提取：使用某生化科技有限公司的病毒基因组dna/rna提取试剂盒(离心柱型)提取病毒rna，具体为：
[0050]
s21、用移液器将20ul proteinase k加入一个干净的1.5ml离心管；
[0051]
s22、向离心管中加入200ul血清；
[0052]
s23、加入200ul carrier rna工作液，盖上管盖，涡旋振荡15s混匀；
[0053]
s24、在56℃孵育15min，简短离心以手机附着在管壁及管盖上的液体；
[0054]
s25、加入520ul无水乙醇，此时可能会出现絮状沉淀，盖上管盖并涡旋振荡15s，彻底混匀，在室温下(15-25℃)放置5min；
[0055]
s26、简短离心以收集附着在管壁及管盖上的液体；
[0056]
s27、仔细将离心管中的溶液和絮状沉淀全部转移至rnase-free吸附住cr2，盖上管盖，8000rpm离心1min，弃废液，将吸附住放回收集管中；
[0057]
s28、小心打开吸附柱盖子，加入500ul缓冲液gd，盖上管盖，8000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱放回收集管中；
[0058]
s29、小心的打开吸附柱盖子，加入600ul漂洗液pw，盖上管盖，静置2min，8000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱放回收集管中；
[0059]
s210、重复步骤s29；
[0060]
s211、小心打开吸附柱盖子，加入500ul无水乙醇，盖上管盖，8000rpm离心1min，弃废液；
[0061]
s212、将吸附柱放回收集管中，12000rpm离心3min，使吸附膜完全变干，弃废液；
[0062]
s213、将吸附柱放入一个rnase-free离心管中，小心打开吸附柱的盖子，室温放置3min，使吸附膜完全变干，向吸附膜的中间部位悬空滴加20-150ul rnase-free ddh2o，盖上盖子，室温放置5min，12000rpm离心1min；
[0063]
s3、引物与探针设计：在genbank中检索鹅星状病毒的orf2基因(genbank id:mh465468.1)，通过meglign软件分析比对，确定各自的高度特异性保守片段区域，在primer premier 5的辅助下，设计orf2基因特异性mira引物(表1)和探针(表2)；
[0064]
表1 gastv mira引物
[0065][0066]
表2 gastv mira探针
[0067][0068]
根据鹅星状病毒orf2基因片段大小为2115bp，在primer premier 5的辅助下设计全长引物，进行pcr扩增，pcr体系为20μl，其中mix 10μl，上游引物1μl，下游引物1μl，dna模板1μl，灭菌水7μl。反应程序见表3；
[0069]
表3目的片段的pcr扩增程序
[0070][0071]
s4、pcr产物回收及纯化：根据sanprep柱式dna胶回收试剂盒说明书提取步骤操作，把扩增产物回收备用；
[0072]
s5、标准质粒的构建：根据pmd
tm
19-t vector cloning kit使用说明书，构建pmd-19t-orf2重组质粒；
[0073]
s6、重组质粒鉴定：取部分培养菌液进行测序服务，并在ncbi网站的blast功能和meglign软件与基因全长进行比对分析；
[0074]
s7、质粒dna小量提取：根据sanprep柱式质粒dna小量抽提试剂盒使用说明书，提取构建的pmd-19t-orf2重组质粒备用；
[0075]
s8、建立鹅星状病毒荧光检测体系：
[0076]
s81、体系建立：根据dna恒温快速扩增试剂盒(荧光型)使用说明书进行具体操作：首先将准备好的上下游引物、质粒dna、探针、ddh2o加入到含有冻干酶粉的反应管中，随后将b buffer添加到反应管的盖子上，经振荡混匀短暂离心后，迅速将反应管置于荧光定量pcr仪中，使其在最佳反应温度下恒温作用20min左右，每30s采集一次荧光信号，反应结束后，随即将反应产物在紫外光下照射，进行观察分析，进而进行荧光结果检测体系的建立。荧光结果检测体系见表4；
[0077]
表4反应体系
[0078]
组分体系含量abuffer29.4μl上游引物(10μm)2μl下游引物(10μm)2μl探针(10μm)0.6μlddh2o和模板13.5μlbbuffer2.5μl
[0079]
s82、引物筛选：使用上一步建立的荧光结果检测体系，对鹅星状病毒的orf2基因的mira引物进行筛选，对比结果；
[0080]
s9、灵敏度试验：测量出质粒浓度，根据拷贝数浓度(copies/μl)＝[6.02
×
10
23
×
浓度(ng/μl)
×
10-9
]/[dna长度
×
660]公式，计算拷贝数浓度，以10倍稀释浓度分别稀释orf2基因重组质粒(pmd-19t-orf2)，稀释浓度为100copies/μl、101copies/μl、102copies/μl、103copies/μl、104copies/μl、105copies/μl、106copies/μl、107copies/μl、108copies/μl、109copies/μl并使用灭菌水(ddh2o)作为试验的阴性对照，反应体系使用本试验建立的体系进行灵敏度验证并与qpcr检测技术进行比较；
[0081]
s10、特异性试验：使用gocv、gpv、fadv-4的dna、dtmuv、gpmv和grv的cdna为模板，阴性和阳性对照分别使用ddh2o和gastv的阳性样本，验证mira方法的特异性并将扩增产物在紫外灯下进行观察；
[0082]
s11、重复性试验：以重组质粒pmd-19t-orf2的103copies/μl、104copies/μl和105copies/μl为模板，每个浓度设置3个重复，进行组内重复性试验，在不同时间进行3次独立的试验，进行组间的重复性试验，计算变异系数(cv值)，以评价所建立的方法的稳定性；
[0083]
s12、临床样本检测：根据dna提取方法进行对临床样本进行dna的提取，采用本研究建立的mira方法对50份样本进行gastv的检测，同时，使用qpcr技术检测方法平行检测，比较两者的检出率情况，评价mira技术的临床应用的实用价值。
[0084]
实验结果
[0085]
1、基因重组质粒构建
[0086]
1.1、pmd-19t-orf2重组质粒构建
[0087]
鹅星状病毒orf2基因组在pcr扩增之后，针对扩增的片段使用1.5％的琼脂糖凝胶电泳验证，鉴定结果如图1所示。与预期相符的目的基因片段在蓝光切胶仪的辅助下切取目的条带，进行胶回收实验，并与pmd19-t载体连接，转化到dh5α中。
[0088]
1.2、重组质粒鉴定测序
[0089]
与南京擎科生物科技有限公司合作被提供测序服务，测序结果在ncbi的blast网站、genbank基因库和meglign软件的辅助下进行序列比对，结果显示，测序结果与所需目的基因片段的对应率达到100％，表明目的基因重组质粒构建合格，无变异，可作为阳性对照使用。
[0090]
2、orf2基因的引物筛选
[0091]
按照mira技术引物和荧光探针设计原则，使用primer premier 5引物设计软件设计鹅星状病毒orf2基因的上下游引物各5条以及一条荧光探针，鹅星状病毒的引物筛选是按照设计的引物上下游一一对应，以选择最佳引物。扩增结果如图2。
[0092]
3、鹅星状病毒的灵敏度实验
[0093]
鹅星状病毒的orf2基因重组质粒在lb培养液中过夜培养，使用sanprep柱式质粒dna小量抽提试剂盒提取质粒后，以10倍的稀释倍数对提取的重组质粒进行稀释，用mira技术的荧光结果如图3和图4。mira技术荧光结果显示检测鹅星状病毒的灵敏度达到了101copies/μl。
[0094]
4、鹅星状病毒的特异性实验
[0095]
使用dna质粒小量提取试剂盒提取鹅星状病毒orf2基因重组质粒pmd-19t-orf2，用mira技术进行特异性实验。mira技术特异性结果的凝胶电泳鉴定和荧光结果鉴定图如图5、6。结果显示，鹅星状病毒的orf2基因扩增成功，其他的病毒均未出现明显扩增条带。
[0096]
5、鹅星状病毒的重复性实验
[0097]
本研究建立的基于mira技术检测鹅星状病毒的orf2基因，以103copies/μl、104copies/μl和105copies/μl为模板进行组内和组间的重复性试验。荧光显示结果如表5所示，组内变异系数在0.227％-1.279％，组间变异系数在1.005％-4.678％。两者变异系数在5％以内，表明建立的荧光结果的mira技术有较高的稳定性和重复性。
[0098]
表5鹅星状病毒的mira技术荧光检测组内和组间重复性实验
[0099][0100]
6、鹅星状病毒的临床检测
[0101]
对50份临床样本用本研究建立的mira技术检测鹅星状病毒，mira技术荧光检测出22份阳性样本。mira技术荧光检测得阳性率为44％。
[0102]
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
[0103]
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。