本发明属于生物医学领域，具体涉及一种构建mrna体外转录模板的骨架及其在mrna优化设计中的应用。
背景技术：
：：1、mrna疫苗是一种新的疫苗技术，其通过结合分子生物学和免疫学，将mrna转导进体细胞中表达外源抗原进而激活宿主的适应性免疫。早在1990年代，科学家们通过注射mrna进入小鼠体细胞，使小鼠体细胞表达了荧光蛋白、β-半乳糖苷酶和氯霉素乙酰转移酶。1992年，jirikowski等人向糖尿病尿崩症小鼠注射编码催产素和加压素的mrna，结果小鼠在注射后的数小时内未发生尿崩症。此后，mrna疫苗的发展陷入了低谷期。2、近数十年中，研究者们在实验水平对mrna疫苗的安全性、表达效率和工业生产等方面进行了研究和优化。这些进步使mrna疫苗用于肿瘤和病毒感染疾病的预防方面得到优先研发。尤其是近两年新冠病毒的暴发流行使得mrna疫苗技术的发展和在临床上的应用取得了长足的进步。3、mrna疫苗的研发主要是为了提高mrna的稳定性和翻译活性，并减少mrna自身抗原性。目前，除新冠病毒疫苗由于研发的紧迫性，而能够上市外，其它mrna疫苗的研发均受到一定阻碍。究其原因，可能是设计mrna疫苗时过度关注其表达抗原的能力，而忽视了mrna疫苗自身的抗原性及高表达能力可能带来的毒性风险和引起周围宿主细胞凋亡的风险。4、本领域迫切需要开发一种副作用更低且能加快研发的mrna疫苗设计方法。技术实现思路1、本发明的目的在于通过采用免疫相关蛋白的utr增加mrna疫苗的泛用性，同时可减少潜在的副作用，借助泛用性的骨架可进一步加快对多种传染性疾病的研发。2、在本发明的第一方面，提供了一种泛用性骨架的用途，所述泛用性骨架用于构建mrna转录本，其中，所述转录本包括待表达的orf以及位于所述orf两侧的5'-utr区和3'-utr区，其中所述5'-utr区和3'-utr区中1个或2个为泛用性utr。3、在另一优选例中，所述的泛用性utr选自下组：突变的或优化的抗体基因的utr保守序列、突变的或优化的干扰素基因的utr保守序列、或其组合。4、在另一优选例中，所述的mrna转录本包括mrna疫苗中的mrna转录本。5、在另一优选例中，所述泛用性骨架还包含额外的utr区(即泛用性utr之外的其他utr区)。6、在另一优选例中，所述抗体基因的utr保守序列的核苷酸序列如seq id no:1或3所示。7、在另一优选例中，所述抗体基因的utr保守序列包括5'抗体保守序列和3'抗体保守序列。8、在另一优选例中，所述5'抗体保守序列的核苷酸序列如seq id no:1所示。9、在另一优选例中，所述3'抗体保守序列的核苷酸序列如seq id no:3所示。10、在另一优选例中，如seq id no:3所示的序列在不同igl基因中保守。11、在另一优选例中，所述干扰素基因的utr保守序列的核苷酸序列如seq id no:7或9所示。12、在另一优选例中，所述干扰素基因的utr保守序列包括5'干扰素保守序列和3'干扰素保守序列。13、在另一优选例中，所述5'干扰素保守序列的核苷酸序列如seq id no:7所示。14、在另一优选例中，所述3'干扰素保守序列的核苷酸序列如seq id no:9所示。15、在另一优选例中，如seq id no:7或9所示的序列在不同ifna的亚型间保守。16、在另一优选例中，所述泛用性utr包括泛用性5'-utr，泛用性3'-utr。17、在另一优选例中，所述泛用性utr包括：含kozak序列的5'-utr。18、在另一优选例中，所述抗体基因和干扰素基因的3'-utr中at-rich序列被全部或部分剔除。19、在另一优选例中，所述泛用性utr中没有或基本没有at-rich序列。20、在另一优选例中，基本没有at-rich序列指在一个utr中，at-rich序列的数量≤2，更佳地≤1。21、在另一优选例中，所述at-rich序列指富含腺嘌呤和胸腺嘧啶碱基的核酸序列。22、在另一优选例中，所述泛用性utr中的gc含量为44％-64％。23、在另一优选例中，所述泛用性5'-utr的核苷酸序列如seq id no:2或8所示。24、在另一优选例中，所述泛用性3'-utr的核苷酸序列如seq id no:4、5、6、10、11或12所示。25、在另一优选例中，上述核苷酸序列中任意一种核苷酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个(如1-3个)核苷酸并能保留用于优化mrna能力的衍生序列。26、在本发明的第二方面，提供了一种泛用性骨架，所述泛用性骨架具有式i结构：27、z1-z2-z3-z4-z5-z6-z7 (i)28、式中，29、z1、z7为无或酶切位点；30、z2为无或启动子元件；31、z3为5'-utr元件；32、z4为可替换的orf区；33、z5为3'-utr元件；34、z6为polya尾部元件。35、在另一优选例中，所述z1、z7为平末端酶切位点或粘性末端酶切位点。36、在另一优选例中，所述泛用性骨架包括酶切位点、启动子、5'-utr、orf、3'-utr和polya。37、在另一优选例中，所述平末端酶选自下组：alei、aati、alui、bavai、bavbi、ecorv、mlsi、或其组合。38、在另一优选例中，所述平末端酶为alei。39、在另一优选例中，所述z2选自下组：t7启动子、t3启动子、sp6启动子，或其组合。40、在另一优选例中，所述z2为t7启动子。41、在另一优选例中，所述z3和z5中1个或2个为泛用性utr。42、在另一优选例中，所述z3选自下组：突变的或优化的5'抗体保守序列、突变的或优化的5'干扰素保守序列、或其组合。43、在另一优选例中，所述z3选自下组：seq id no:2、seq id no:8、人α珠蛋白的5'-utr、或其组合。44、在另一优选例中，所述z4可替换为选自下组的基因：水蛭素、狂犬病毒g蛋白、登革热病毒e蛋白、结核分支杆菌esat-6蛋白、ag85a蛋白、或其组合。45、在另一优选例中，所述z4可替换为选自下组病原的抗原基因：水蛭素、巨细胞病毒(cmv)、寨卡病毒(zika)、流感病毒(influenza)、呼吸道合胞病毒(rsv)、基孔肯雅病(chikungunya)、狂犬病(rabies)、艾滋病毒(hiv)、埃博拉病毒(ebola virus)、链球菌(streptococci)、疟疾(malaria)、跳跃病病毒(louping ill virus)、岗地弓形虫(toxoplasma gondii)、登革热、鼠疫、黄热病、结核病、单纯疱疹病毒、带状病毒、支原体、衣原体、口蹄疫病毒、绿脓杆菌、或其组合46、在另一优选例中，所述z4被替换为水蛭素基因。47、在另一优选例中，所述z4经过密码子优化。48、在另一优选例中，所述z4的替换方法包括同源重组和酶切。49、在另一优选例中，所述z4的终止密码子为多个终止密码子。50、在另一优选例中，所述z4的终止密码子为2个终止密码子。51、在另一优选例中，所述z5选自下组：突变的或优化的3'抗体保守序列、突变的或优化的3'干扰素保守序列、或其组合。52、在另一优选例中，所述z5选自下组：seq id no:4-6、seq id no:10-12，或其组合。53、在另一优选例中，所述z6的长度较佳地为100nt-150nt，更佳地为110nt-130nt，更佳地为120nt。54、在本发明的第三方面，提供了一种泛用性utr元件，所述泛用性utr元件包括：55、(a)泛用性5'-utr，其中所述泛用性5'-utr的序列选自如seq id no:2或8所示的核苷酸序列或其衍生序列；和/或56、(b)泛用性3'-utr，其中所述泛用性3'-utr的序列选自如seq id no:4、5、6、10、11或12所示的核苷酸序列或其衍生序列。57、在另一优选例中，所述衍生序列是指对上述核苷酸序列中任意一种核苷酸序列任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个(如1-3个)核苷酸并能保留用于优化mrna能力的衍生序列。58、在另一优选例中，所述(a)和(b)可来源于同一转录本。59、在另一优选例中，所述(a)和(b)可来源于不同转录本。60、在本发明的第四方面，提供了一种载体，所述载体含有如本发明第二方面所述的泛用性骨架。61、在另一优选例中，所述载体选自下组：dna、rna、病毒载体、质粒、转座子、其他基因转移系统，或其组合。优选地，所述载体为质粒。62、在另一优选例中，所述载体为puc57-amp载体。63、在本发明的第五方面，提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞含有如本发明第四方面所述的载体，或其基因组中整合有如本发明第二方面所述的泛用性骨架。64、在另一优选例中，所述的宿主细胞包括原核细胞或真核细胞。65、在另一优选例中，所述的宿主细胞选自下组：大肠杆菌、酵母细胞、哺乳动物细胞。66、在本发明的第六方面，提供了一种工程化细胞，所述工程化细胞含有：如本发明第四方面所述的载体，或其基因组中整合有如本发明第二方面所述的泛用性骨架，并且含有目的基因片段。67、在另一优选例中，所述工程化细胞为stable3大肠杆菌感受态细胞。68、在另一优选例中，所述目的基因片段含有同源臂序列。69、在另一优选例中，所述载体或泛用性骨架含有同源臂序列。70、在另一优选例中，所述目的基因片段与所述载体或泛用性骨架发生同源重组。71、在另一优选例中，所述目的基因片段与所述载体或泛用性骨架连接环化。72、在另一优选例中，所述目的基因选自下组：水蛭素、巨细胞病毒(cmv)、寨卡病毒(zika)、流感病毒(influenza)、呼吸道合胞病毒(rsv)、基孔肯雅病(chikungunya)、狂犬病(rabies)、艾滋病毒(hiv)、埃博拉病毒(ebola virus)、链球菌(streptococci)、疟疾(malaria)、跳跃病病毒(louping ill virus)、岗地弓形虫(toxoplasma gondii)、登革热、鼠疫、黄热病、结核疫苗病、单纯疱疹病毒、带状病毒、支原体、衣原体、口蹄疫病毒、绿脓杆菌、或其组合。73、在本发明的第七方面，提供了一种产生用于制备疫苗的优化mrna的方法，包括步骤：74、(a)在适合的条件下，培养如本发明第六方面所述的工程化细胞，从而获得含有转录dna模板的载体的培养物；75、(b)从所述培养物中分离和/或回收(a)中所述载体，并酶切线性化为dna模板；76、(c)将(b)中所述dna模板进行转录，从而获得所述优化mrna；和77、(d)任选地，对步骤(c)获得的优化mrna进行纯化和/或修饰。78、在本发明的第八方面，提供了一种mrna疫苗的制备方法，所述方法包括步骤：79、(i)通过如本发明第七方面所述的方法获得优化mrna；80、(ii)将(i)中获得的优化mrna与药学上可接受的载体混合，从而获得所述mrna疫苗。81、在本发明的第九方面，提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括：82、(a)第一质粒，所述第一质粒含有目的基因；和83、(b)第二质粒，所述第二质粒含有如本发明第二方面所述的泛用性骨架；和84、(c)说明书，所述说明书描述了使用所述第一质粒和第二质粒生产可用于制备疫苗的优化mrna的方法。85、在另一优选例中，所述说明书中还记载了使用第一质粒为模板扩增出带有同源臂序列的第一片段的方法。86、在另一优选例中，所述说明书中还记载了使用第二质粒为模板扩增出带有同源臂序列的第二片段的方法。87、在另一优选例中，所述说明书中还记载了将所述第一片段和所述第二片段通过同源重组连接环化并转入一合适的宿主细胞的方法。88、在另一优选例中，所述说明书中还记载了从所述宿主细胞获得优化mrna的方法。89、在本发明的第十方面，提供了一种mrna疫苗组合物，所述疫苗组合物含有：90、(a)用于表达免疫原的mrna，所述mrna包含如本发明第二方面所述的泛用性骨架；和91、(b)药学上可接受的载体。92、在另一优选例中，所述免疫原选自下组：水蛭素、巨细胞病毒(cmv)、寨卡病毒(zika)、流感病毒(influenza)、呼吸道合胞病毒(rsv)、基孔肯雅病(chikungunya)、狂犬病(rabies)、艾滋病毒(hiv)、埃博拉病毒(ebola virus)、链球菌(streptococci)、疟疾(malaria)、跳跃病病毒(louping ill virus)、岗地弓形虫(toxoplasma gondii)、登革热、鼠疫、黄热病、结核病、单纯疱疹病毒、带状病毒、支原体、衣原体、口蹄疫病毒、绿脓杆菌，或其组合。93、在另一优选例中，所述疫苗组合物中mrna本身还可以充当佐剂。94、在另一优选例中，所述疫苗组合物的剂型选自下组：注射剂、冻干剂。95、在另一优选例中，所述疫苗组合物包括0.01～99.99％的如本发明第二方面所述的泛用性骨架和0.01～99.99％的药学上可接受的载体，所述百分比为占所述疫苗组合物的质量百分比。96、在本发明的第十一方面，提供了一种如本发明第十方面所述的mrna疫苗组合物，或如本发明第六方面所述的工程化细胞的用途，其被用于制备一药物，所述药物用于预防选自下组的病原体：水蛭素、巨细胞病毒(cmv)、寨卡病毒(zika)、流感病毒(influenza)、呼吸道合胞病毒(rsv)、基孔肯雅病(chikungunya)、狂犬病(rabies)、艾滋病毒(hiv)、埃博拉病毒(ebola virus)、链球菌(streptococci)、疟疾(malaria)、跳跃病病毒(louping illvirus)、岗地弓形虫(toxoplasma gondii)、登革热、鼠疫、黄热病、结核病、单纯疱疹病毒、带状病毒、支原体、衣原体、口蹄疫病毒、绿脓杆菌，或其组合。97、应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。当前第1页12当前第1页12