靶向沉默辣椒疫霉氧化固醇结合蛋白1的双链RNA分子及应用

靶向沉默辣椒疫霉氧化固醇结合蛋白1的双链rna分子及应用
技术领域
1.本发明涉及农业生物技术领域，具体涉及一种可以抑制辣椒疫霉氧化固醇结合蛋白1基因表达的双链rna分子，以及该分子在防治辣椒疫霉引起的植物病害上的应用。


背景技术：

2.辣椒疫霉(phytophthora capsici)是一种重要植物病原卵菌，在世界各地均有分布，可侵染茄科、豆科及大多数葫芦科的70多种植物，引起猝倒、萎蔫和根、茎、果实腐烂，从苗期至果期均能发病，造成严重的经济损失。辣椒疫霉引起的辣椒疫病是一种毁灭性病害，可经雨水、土壤和气流等途径传播，造成叶片枯萎、果实腐烂，甚至全株枯死等症状，对作物产量、品质影响极大，严重时可导致减产50％以上。
3.对辣椒疫霉的防治主要依赖于化学防治，但由于杀卵菌剂的种类较少，长期单一使用化学农药已导致辣椒疫霉对多种化学农药产生抗药性，且不断增大剂量施用化学农药对于环境造成严重污染。此外，对辣椒疫霉具有抗性的植物品种资源匮乏，亟需开发新型手段防治辣椒疫霉引起的植物病害。
4.rna干扰(rna interference，rnai)是由双链rna诱发的基因沉默现象，其可以通过阻碍特定基因的转录或翻译来抑制基因表达。rnai在生物体内普遍存在，dna转录形成的双链或发卡结构的rna序列可以被加工为20-30bp之间的小rna，这些小rna通过介导基因沉默复合体特异识别与之互补配对的靶基因dna或mrna序列，造成mrna的切割、翻译抑制或dna甲基化，最终抑制基因的正常表达(fire,a.等.1998.nature.391(6669):806)。rnai技术在植物病害防治方面于近年来取得大量成果，通过直接喷施双链rna分子可以干扰病原菌关键基因从而导致病原菌适合度下降，降低致病力，称为sigs(spray-induced gene silencing)。
5.sigs被用来控制作物病害是近几年来rnai的热点，一般通过双链rna直接干扰病原菌重要基因表达来实现。在大麦叶片上喷施靶向镰刀菌甾醇合成必需基因cyp51以及rnai重要元件dcl和ago基因的双链rna均可显著降低大麦叶片上禾谷镰刀菌的致病力(koch,a.等.2016.plos pathogens.12(10):e1005901；werner,b.t.等.2020.frontiers in plant science.11:476)。在棉花上使用靶向不同棉花曲叶病毒(clcuv)基因的双链rna可以显著降低这些基因的表达，成功控制粉虱传播的clcuv的发病程度(verma,p.等.2018.journal of entomology and zoology studies.6(4):1055-1060)。以上研究说明基于sigs的跨界基因沉默可有效用于植物病害防治。
6.氧化固醇结合蛋白1(orp1)是超高效杀菌剂氟噻唑吡乙酮的作用靶标，pcorp1的氨基酸突变可以导致辣椒疫霉对药剂产生高水平抗药性。经检索，目前未发现基于rna沉默技术防治辣椒疫霉引起的植物病害的相关文献。


技术实现要素：

7.本发明目的在于提供一种可抑制辣椒疫霉氧化固醇结合蛋白1基因表达的双链
rna分子。
8.本发明的第二个目的在于提供上述双链rna分子在抑制辣椒疫霉氧化固醇结合蛋白1基因表达上的用途。
9.本发明的第三个目的在于提供上述双链rna分子在防治辣椒疫霉导致的植物病害上的用途。
10.本发明的第四个目的在于提供含有上述双链rna分子的农药。
11.本发明的第五个目的在于提供含有上述双链rna分子的农药在防治辣椒疫霉引起的植物病害上的应用。
12.本发明的第六个目的在于提供利用上述双链rna分子防治辣椒疫霉导致的植物病害的方法。
13.实现本发明的技术方案如下：
14.一种可以抑制辣椒疫霉氧化固醇结合蛋白1基因表达的双链rna分子，其一条链的序列如seq id no.1所示，另一条链的序列如seq id no.2所示。
15.上述双链rna分子在抑制辣椒疫霉氧化固醇结合蛋白1基因表达上的应用。
16.上述双链rna分子在防治辣椒疫霉引起的植物病害上的应用。
17.含有上述双链rna分子的农药。
18.含有上述双链rna分子的农药在辣椒疫霉引起的植物病害防治上的应用。
19.利用上述双链rna分子防治辣椒疫霉引起的植物病害的方法，包括将含有上述双链rna分子载体的溶液或制剂直接喷洒于植物组织表面或进行土壤处理(如灌根等)。
20.本发明涉及的双链rna分子可以通过原核表达的方式进行生产。
21.本发明涉及的双链rna分子的使用方法：将适合浓度的(如约100nm)双链rna分子水溶液喷施在植物叶片表面或进行植物根际土壤的灌根处理，可有效抑制辣椒疫霉在植物叶片或根茎部的侵染和扩展。
22.上述植物优选为烟草或者辣椒。
23.本发明具有的优点或有益效果：(1)本发明所涉及双链rna分子对辣椒疫霉氧化固醇结合蛋白1的表达表现明显抑制效果，可有效抑制辣椒疫霉对植物的侵染，为辣椒疫霉引起的植物病害防治提供新的有效途径。(2)本发明涉及的双链rna分子对疫霉的氧化固醇结合蛋白1基因的特异性强，理论上能够特异性抑制包括辣椒疫霉在内的多种植物病原疫霉，且不存在抗药性问题。(3)本发明涉及的靶标基因同时也是氟噻唑吡乙酮或类似超高效药剂的作用靶标，可用于因为氨基酸突变而对该类药剂产生抗药性的疫霉群体进行抗药性治理，或者与杀菌剂复配使用延缓该类高抗药性风险药剂的抗药性产生。(4)本发明涉及的双链rna分子对人或动物安全，同时可有效降低化学农药的使用量，不存在环境污染问题，有利于环保。
附图说明
24.图1为本发明涉及双链rna分子的凝胶电泳图。图注：胶图条带由左至右分别是双链rna分子dsorp3、空白载体对照l4440、阴性对照双链rna分子dsgfp和maker。
25.图2为本发明涉及的双链rna分子施用于离体叶片后辣椒疫霉的侵染照片。a双链rna对烟草叶片的保护效果；b双链rna对辣椒叶片的保护效果。图2a中：向离体烟草叶片喷
施dsrna粗提液1d后接种辣椒疫霉游动孢子(104个/ml)3d后发病的烟草叶片(从左至右分别是清水对照、空白载体对照l4440、阴性对照双链rna分子dsgfp和双链rna分子dsorp3)；图2b中：向离体辣椒叶片喷施dsrna粗提液1d后接种辣椒疫霉游动孢子(104个/ml)3d后发病的烟草叶片(从左至右分别是清水对照、空白载体对照l4440和双链rna分子dsorp3)。
26.图3为本发明涉及的双链rna分子施用于离体叶片后接种辣椒疫霉形成的侵染病斑面积柱状图。a双链rna对烟草叶片的保护效果；b双链rna对辣椒叶片的保护效果。图3a中：喷施dsrna粗提液1d后接种辣椒疫霉菌饼3d后发病的烟草病斑直径(从左至右分别是清水对照、空白载体对照l4440、阴性对照双链rna分子dsgfp和双链rna分子dsorp3)。图3b中：喷施dsrna粗提液1d后接种辣椒疫霉菌饼3d后发病的辣椒病斑直径(从左至右分别是清水对照、空白载体对照l4440、和双链rna分子dsorp3)。
27.图4为本发明涉及双链rna分子施用于活体植株后对辣椒疫霉的防效照片。图注：向辣椒植株灌根dsrna粗提液1d后灌根3ml辣椒疫霉游动孢子悬浮液(104个/ml)，7d后辣椒发病情况(从左至右分别是清水对照、空白载体对照l4440、、阴性对照双链rna分子dsgfp和双链rna分子dsorp3)。
28.图5为本发明涉及的双链rna分子施用于活体植株后接种辣椒疫霉所导致的病情指数柱状图。
29.图注：向辣椒植株灌根dsrna粗提液1d后灌根3ml辣椒疫霉游动孢子悬浮液(104个/ml)，7d后辣椒植株病情指数(从左至右分别是清水对照、空白载体对照l4440、阴性对照双链rna分子dsgfp和双链rna分子dsorp3)。
具体实施方式
30.下述实施例中的方法，如果未特别指明，实施例中所用的试剂均为市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员熟知的常规手段。
31.实施例1、本发明涉及的抑制辣椒疫霉氧化固醇蛋白1基因表达的双链rna分子来源
32.(1)本发明的双链rna分子的序列来源于pcorp1的cdna。pcorp1的cdna序列来源于辣椒疫霉的数据库(jgi)中编号为phycascaffold_14:545241-548188的基因。
33.(2)选择pcorp1的cdna序列第924-2479共556个碱基序列作为本发明涉及的双链rna分子的序列。其正义链序列如序列表中序列1所示，其反义链如序列表中序列2所示。
34.(3)将上述序列分别与烟草、番茄、辣椒等辣椒疫霉常见寄主的基因组序列(ncbi)进行比对，检测其对植物基因非特异性沉默的可能性。比对结果显示本发明所涉及的序列与植物基因组序列最大连续匹配均不足10个碱基，且通过序列潜在产生的sirna预测显示上述序列产生的sirnas均不能达到基因沉默的有效长度，排除了沉默寄主植物基因的可能性。
35.实施例2本发明双链rna分子的制备
36.(1)双链rna表达质粒l4440含有两个双向t7启动子，可以在rnaseⅲ缺陷型大肠杆菌内转录生成双链rna。将目的片段通过pcr扩增，扩增引物如表1所示。以辣椒疫霉标准菌株lt1534(doi:10.1094/mpmi-02-12-0028-r)的cdna为模板，将扩增得到的片段酶切连接的方式插入到l4440质粒两个t7启动子之间(sac ii和xba i酶识别位点之间)，通过pcr及
测序验证后，即获得可表达双链rna分子的质粒。
37.表1构建双链rna分子的引物序列
[0038][0039]
(2)将步骤(1)获得可表达双链rna分子的质粒转化入rnaseⅲ缺陷型大肠杆菌菌株ht115中，以诱导表达dsrna。
[0040]
(3)选择pcr验证且测序成功的双链rna分子表达菌株ht115的单菌落，在含有氨苄青霉素的lb液体培养基中摇培过夜后置于-80℃冰箱保存。
[0041]
(4)在带有抗性标记的lb平板上划线双链rna分子表达菌株，蘸取单菌落到5ml液体lb培养基中，37℃200rpm过夜摇培。
[0042]
(5)取500μl摇培菌液到10ml lb液体培养基中，37℃230rpm摇培2.5h左右，至菌液od
600
在0.5-0.8之间。
[0043]
(6)向菌液中加入终浓度为2mm iptg，37℃230rpm摇培8h。
[0044]
(7)从摇培后的菌液中取2ml到无酶离心管中，利用triozol法提取总rna。
[0045]
(8)将提取的rna进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳结果确定双链rna条带大小是否符合预期。如图1所示，本发明所制备的双链rna分子电泳条带清晰，大小为预期目的大小。经过测序表明，获得的双链rna分子，其正义链序列如序列表中序列1所示，其反义链如序列表中序列2所示。
[0046]
实施例3施用本发明涉及的双链rna分子的植物对辣椒疫霉的抗病性评价
[0047]
本专利通过a.双链rna分子直接喷施到寄主植物表面(本生烟和辣椒离体叶片)1d后再接种辣椒疫霉游动孢子，3d后观察并测定叶片病斑直径。b.先用双链rna分子灌根植物，再模拟田间环境对辣椒幼苗进行游动孢子接种，测定辣椒幼苗的病情指数。根据以上两种评价方式来明确双链rna对辣椒疫霉生长发育和致病力的影响。
[0048]
辣椒疫霉bya5菌株(由中国农业大学杀菌剂药理与病原菌抗药性实验室分离，来自于广东白云的发生辣椒疫病的辣椒植株，已经过形态学和分子生物学鉴定，确认为辣椒疫霉)的游动孢子制备如实施例3所述，游动孢子浓度用血球计数板进行计数后调整浓度为105个/ml备用。
[0049]
双链rna的粗提：根据实施例1所述诱导条件，按照100ml体系诱导大肠杆菌原核表达目的dsrna。经诱导后的菌液4℃，4000rpm离心30min收集菌沉。用50ml te缓冲液进行重悬浮，将重悬浮后菌液od
600
调至1.5左右。使用高压细胞破碎仪对菌液以0.5kpa的压强破碎2.5min。破碎后菌液应为澄清透明状，流动性较强。
[0050]
a.双链rna分子直接喷施到寄主植物表面(本生烟和辣椒离体叶片)1d后再接种辣椒疫霉游动孢子，3d后观察并测定叶片病斑直径；
[0051]
采集生长状态相似的6-8周本生烟叶片，使用高温高压灭菌后的20ml喷壶喷施5ml双链rna粗提液到离体本生烟和辣椒叶正，叶背面。待叶片自然晾干后放置于保湿培养皿中。每个dsrna粗提液处理10个叶片。dsrna喷施1d后，接种10μl辣椒疫霉游动孢子悬浮液(104个/ml)到叶片背面置于保湿培养皿中，3d后采用十字交叉法测定病斑直径。根据离体叶片上病斑的平均直径平均双链rna对辣椒疫霉的活性。
[0052]
如图2所示，相对对照，喷施了靶向辣椒疫霉氧化固醇结合蛋白1基因的双链rna分子的叶片上辣椒疫霉侵染形成的病斑显著减小。
[0053]
统计结果见图3，小本发明涉及的双链rna处理叶片后辣椒疫霉的侵染能力明显下降，说明本发明的双链rna分子对辣椒疫霉的生长和致病的抑制作用明显。
[0054]
b.先用双链rna分子灌根植物，再模拟田间环境对辣椒幼苗进行游动孢子接种，测定辣椒幼苗的病情指数。
[0055]
对生长状态相似的6-8周的本生烟植株进行根际土壤的灌根处理，每株约进行3ml双链rna粗提液的处理。1d后灌根3ml辣椒疫霉游动孢子悬浮液(104个/ml)。接种后7d进行病情指数调查，病情指数分级标准参考表2。每个处理约10个生物学重复植株，计算平均病情指数。
[0056]
表2辣椒疫霉发病分级标准
[0057][0058][0059]
结果见图4所示，与喷施无菌水或大肠杆菌菌沉破碎液的对照植株相比，喷施本发明双链rna分子的植株明显更加健康，未出现茎基部的明显缢缩、坏死或植株倒伏。统计结果见图5，喷施本发明双链rna分子的植株的平均病情指数显著低于对照植株，说明喷施本发明双链rna分子显著抑制辣椒疫霉对植株茎基部的侵染。
[0060]
实施例4施用本发明涉及的双链rna分子的植物对辣椒疫霉的防效测定
[0061]
在温室中，采用80孔穴盘种植辣椒苗。待辣椒苗生长1.5个月后，将诱导获得的3ml双链rna分子粗提液直接喷施到植株根茎部。1d后，采用辣椒疫霉游动孢子悬浮液灌根的方式进行接种，用枪吸取浓度为104个/ml孢子悬浮液3ml直接施加在辣椒植株根基部附近的土壤中。接种10d后调查辣椒发病情况，并根据表3统计发病级数(0，1，2，3，4，5级)，计算病
情指数和dsrna粗提液防治效率。
[0062]
防治效率＝(对照组病情指数—处理组病情指数)/对照组病情指数
×
100％
[0063]
如表3所示，喷施本发明双链rna分子后对辣椒疫霉表现46.57％的防效，以上结果说明本发明的双链rna分子可以作为绿色安全的新型农药用于对辣椒疫霉导致的植物病害的防治。
[0064]
表3.为本发明涉及的双链rna分子对辣椒疫病的温室防效试验统计
[0065]