靶向沉默辣椒疫霉氧化固醇结合蛋白1的植物表达载体及其应用

1.本发明涉及农业生物技术领域，具体涉及两种具有茎环结构转录本抑制辣椒疫霉氧化固醇结合蛋白1基因表达的植物表达载体，以及这些植物表达载体在防治辣椒疫霉引起的植物病害上的应用。


背景技术：

2.辣椒疫霉(phytophthora capsici)是一种重要植物病原卵菌，在世界各地均有分布，可侵染茄科、豆科及大多数葫芦科的70多种植物，引起猝倒、萎蔫和根、茎、果实腐烂，从苗期至果期均能发病，造成严重的经济损失。辣椒疫霉引起的辣椒疫病是一种毁灭性病害，可经雨水、土壤和气流等途径传播，造成叶片枯萎、果实腐烂，甚至全株枯死等症状，对作物产量、品质影响极大，严重时可导致减产50％以上。
3.对辣椒疫霉的防治主要依赖于化学防治，但由于杀卵菌剂的种类较少，长期单一使用化学农药已导致辣椒疫霉对多种化学农药产生抗药性，且不断增大剂量施用化学农药对于环境造成严重污染。此外，对辣椒疫霉具有抗性的植物品种资源匮乏，亟需开发新型手段防治辣椒疫霉引起的植物病害。
4.rna干扰(rna interference，rnai)是由双链rna诱发的基因沉默现象，其可以通过阻碍特定基因的转录或翻译来抑制基因表达。rnai在生物体内普遍存在，dna转录形成的双链或发卡结构的rna序列可以被加工为20-30bp之间的小rna，这些小rna通过介导基因沉默复合体特异识别与之互补配对的靶基因dna或mrna序列，造成mrna的切割、翻译抑制或dna甲基化，最终抑制基因的正常表达(fire,a.等.1998.nature.391(6669):806)。寄主诱导的基因沉默技术(host-induced gene silencing,higs)是基于rnai的原理，在寄主植物中表达靶向病原物关键基因的沉默载体即higs介体，当病原物入侵寄主植物时，由higs介体剪切加工生成的小rna在转录后水平沉默病原菌重要基因，从而保护植物免受侵染，提高植物对病原物的抗性。higs因其不依赖抗性品种资源而成为理想的植物病害防治策略(koch,a.等.2014.plant biotechnology journal.12:821-831)，已在部分植物-病原菌的互作系统中被成功应用。过去几年相关研究表明higs可以抑制植物病原菌的生长和致病，如应用于大麦上布氏白粉菌的防治(nowara,d.等.2010.the plant cel.22(9):3130-3141)、小麦上条锈菌和镰刀菌的防治(panwar,v.等.2013.plant molecular biology.81(6):595-608；koch,a.等.2014.plant biotechnology journal.12:821-831)、水稻上稻瘟菌的防治(zhang,d.等.2015.plant science.237:24-32)以及棉花上大丽轮枝菌的防治(duan c.g.等.2012.silence.3(1):5)。jahan等人针对致病疫霉4个与致病或细胞结构相关基因分别进行了转基因沉默植物的构建，发现表达靶向pigpb1基因的发卡结构的植物抗病性明显增强，在该转基因植物叶片内鉴定到24-25nt的小rna分子可以靶向pigpb1基因，推测可引起转录后水平对靶基因的沉默(jahan,s.n.等.2015,journal of experimental botany.66(9):2785-2794)。以上研究说明基于higs的跨界基因沉默可有效用于植物病害
防治。
5.氧化固醇结合蛋白1(orp1)是超高效杀菌剂氟噻唑吡乙酮的作用靶标，辣椒疫霉氧化固醇结合蛋白1(pcorp1)的氨基酸突变可以导致辣椒疫霉对药剂产生高水平抗药性，且orp1在疫霉中较为保守。经检索，目前未发现基于rna沉默技术防治辣椒疫霉引起的植物病害的相关文献。


技术实现要素：

6.本发明目的在于提供靶向辣椒疫霉氧化固醇结合蛋白1基因并使其沉默的dna片段，以及可以转录形成具有内含子的发卡结构的可抑制辣椒疫霉氧化固醇结合蛋白1基因表达的植物表达载体。
7.本发明的第二个目的在于提供上述植物表达载体在抑制辣椒疫霉氧化固醇结合蛋白1基因表达上的用途。
8.本发明的第三个目的在于提供上述植物表达载体在防治辣椒疫霉导致的植物病害上的用途。
9.本发明的第四个目的在于提供利用表达上述载体的转基因植物防治辣椒疫霉导致的植物病害的方法。
10.实现本发明的技术方案如下：
11.本发明的靶向辣椒疫霉氧化固醇结合蛋白1基因并使其沉默的dna片段，其特征在于，所述dna片段的序列为序列表中序列1或者序列表中序列2。
12.两种可以转录形成具有茎环结构rna分子的植物表达载体，由seq id no.1或seq id no.2所示的核酸序列分别正、反向插入到对应的植物表达载体构成。
13.优选的，所述植物表达载体是将如式(i)所示编码基因克隆到出发载体，构成可表达靶向辣椒疫霉纤维素合酶3基因并使其沉默的具有反向互补二级结构的rna分子的重组表达载体；seq正向-x-seq反向(i)；式(i)中，所述seq正向的序列为序列表中序列1或者序列表中序列2；所述seq反向的序列与所述seq正向的序列反向互补；所述x是所述seq正向与所述seq反向之间的间隔序列，所述x与所述seq正向及所述seq反向均不互补。
14.所述出发载体为pearlygate100，式(i)中，x为ubc基因内含子或植物丙酮酸磷酸激酶基因内含子，所述ubc基因内含子序列如序列表中序列3的自5’端第3308-3379位核苷酸序列所示。
15.在本发明的一个实施方式中，seq正向-x-seq反向(i)的序列为序列表中序列3的自5’端第2751-3935位核苷酸序列。
16.在本发明的另一个实施方式中，seq正向-x-seq反向(i)的序列为序列表中序列4的自5’端第2753-3821位核苷酸序列。
17.在本发明的一个实施方式中，所述植物表达载体的构建方法为将序列1或2所述的片段先正向插入pentr1a质粒得到重组质粒pentr1a-5’orp，再将序列反向插入pentr1a-5’orp载体的ubc基因内含子的3’端，将得到的重组质粒再利用lr反应，将序列1所示片段正向、ubc基因内含子和序列1所示片段反向依次串联的片段或者序列2所示片段正向、ubc基因内含子和序列2所示片段反向依次串联的片段转入植物表达载体pearlygate100中，得到靶向辣椒疫霉氧化固醇结合蛋白1基因并使其沉默的植物表达载体。
18.将序列表中序列1或者序列表中序列2所述的片段先正向插入pentr1a质粒的酶切位点cla i和ecor i之间，经pcr、测序、酶切、电泳验证后再将序列表中序列1或者序列表中序列2所述片段利用酶切位点sac ii和spe i反向插入pentr1a-5’orp载体的ubc基因内含子的3’端，质粒经验证后保存，再利用lr反应将质粒转入植物表达载体pearlygate100两个attr位点之间(如图1所示)上，获得正反向插入序列表中序列1的片段的重组载体peg::orp3hp和正反向插入序列2的片段的重组载体peg::orp4hp,即获得转入抗辣椒疫病的转基因烟草表达载体。peg::orp3hp载体结构如图2所示，其序列如序列表中序列3所示；peg::orp4hp载体结构如图3所示，其序列如序列表中序列4所示。
19.上述植物表达载体在抑制辣椒疫霉氧化固醇结合1基因表达上的应用。
20.上述植物表达载体在防治辣椒疫霉引起的植物病害上的应用。
21.上述植物表达载体在抑制辣椒疫霉氧化固醇结合1基因表达上的应用。
22.上述植物表达载体在防治辣椒疫霉引起的植物病害上的应用。`
23.利用上述植物表达载体防治辣椒疫霉引起的植物病害的方法，包括将含有上述植物表达载体的溶液或试剂直接喷洒、施用或转化植物的各种组织如原生质体等。
24.本发明涉及的植物表达载体可以通过构建转基因植物进行使用。
25.本发明涉及的植物表达载体的使用方法：通过pcr克隆辣椒疫霉氧化固醇结合蛋白1基因的序列1或序列2所示的片段，借助质粒和片段的连接整合入通用的植物表达载体，随后可以通过根癌农杆菌介导的转化、原生质体转化等方式进行转基因植物的构建。
26.本发明具有的优点或有益效果：(1)表达本发明所涉及植物表达载体的转基因植物对辣椒疫霉氧化固醇结合蛋白1的表达表现明显抑制效果，且能表现对辣椒疫霉的显著抗性，本发明可为辣椒疫霉导致的植物病害的防治提供新的有效途径。(2)本发明涉及的植物表达载体对疫霉的氧化固醇结合蛋白1基因的特异性强，理论上能够特异性抑制包括辣椒疫霉在内的多种植物病原疫霉，且不存在抗药性问题。(3)本发明涉及的转基因植物不表达任何完整的蛋白，对人或动物安全，同时可有效降低化学农药的使用量。(4)本发明涉及的基因靶标同时也是氟噻唑吡乙酮或类似超高效药剂的作用靶标，可用于因为氨基酸突变而对该类药剂产生抗药性的疫霉群体进行抗药性治理，或者与杀菌剂复配使用延缓该类高抗药性风险药剂的抗药性产生。(5)本发明不存在环境污染问题，有利于环保。
附图说明
27.图1.为本发明涉及的植物表达载体pearlygate100的结构示意图。
28.图2.为本发明涉及的植物表达载体1(peg::orp3hp)的结构示意图。
29.图3.为本发明涉及的植物表达载体2(peg::orp4hp)的结构示意图。
30.图4.为稳定表达本发明涉及的植物表达载体1(peg::orp3hp)的转基因烟草的植株对辣椒疫霉的抗性水平测定照片。
31.图注：wt表示野生型本生烟，peg-1/4表示转入空载体pearlygate100的转基因烟草，peg::orp3hp-3/4/5表示转入peg::orp3hp介体的转基因烟草(3个植株株系)。
32.图5.为稳定表达本发明涉及的植物表达载体2的转基因烟草的植株对辣椒疫霉的抗性水平测定照片
33.图注：wt表示野生型本生烟，peg-1/4表示转入空载体pearlygate100的转基因烟
草，peg::orp4hp-1/4/6/8/10/11表示转入peg::orp4hp介体的转基因烟草(6个植株株系)。
34.图6.为表达本发明涉及的植物表达载体1的转基因烟草对辣椒疫霉的抗性水平柱形图。
35.图注：wt表示野生型本生烟，peg-1/4表示转入空载体pearlygate100的转基因烟草(2个植株株系)；peg::orp3hp-3/4/5表示转入peg::orp3hp介体的转基因烟草(3个植株株系)。图a表示烟草植株发病率；图b表示烟草植株病基部辣椒疫霉生物量。
36.图7.为表达本发明涉及的植物表达载体2的转基因烟草对辣椒疫霉的抗性水平柱形图。
37.图注：wt表示野生型本生烟，peg-1/2/4表示转入空载体pearlygate100的转基因烟草(3个植株株系)，peg::orp4hp-1/4/6/8/10/11表示转入peg::orp4hp介体的转基因烟草(6个植株株系)。图a表示烟草植株发病率；图b表示烟草植株病基部辣椒疫霉生物量。
38.图8.为侵染了表达本发明涉及的植物表达载体的瞬时表达烟草植株上辣椒疫霉的氧化固醇结合蛋白1基因的表达量变化情况。
39.图注：peg表示瞬时表达空载体pearlygate100的烟草叶片阴性对照样品，peg::orp3hp表示瞬时表达peg::orp3hp的烟草叶片样品，peg::orp4hp表示瞬时表达peg::orp4hp的烟草叶片样品。
40.图9.为表达本发明涉及的植物表达载体的瞬时表达烟草中产生的靶向辣椒疫霉氧化固醇结合蛋白1的小rna检测情况。
41.图注：buffer表示注射缓冲液的烟草叶片空白对照样品；peg表示瞬时表达空载体pearlygate100的烟草叶片阴性对照样品，peg::orp3hp-1/2/3表示瞬时表达peg::orp3hp的烟草叶片样品(三个重复)，peg::orp4hp-1/2表示瞬时表达peg::orp4hp的烟草叶片样品(两个重复)，reference u6表示烟草内参小rna。
具体实施方式
42.下述实施例中的方法，如果未特别指明，实施例中所用的试剂均为市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员熟知的常规手段。
43.实施例1本发明的抑制辣椒疫霉氧化固醇蛋白1基因表达的序列来源
44.本发明的两种植物表达载体中的序列来源于pcorp1的cdna序列的不同区间，序列如seq id no.1或seq id no.2所示，可以引起不同程度的pcces3的基因沉默，因此均可作为增强植物对辣椒疫霉抗病性的植物表达载体。pcorp1的cdna序列来源于辣椒疫霉的数据库(jgi)中编号为phycascaffold_14:545241-548188的基因。
45.选择pcorp1的cdna序列第924-1479共556个碱基序列序列(序列表中序列1)作为第一个发卡结构的植物表达载体表达序列，第1346-1843共499个碱基序列(序列表中序列2)作为第二个发卡结构的植物表达载体表达序列。所需的扩增引物见表1。以辣椒疫霉cdna为模板，以pcorp1-3-f和pcorp1-3-r为引物扩增得到序列表中序列1所示的片段，以pcorp1-4-f和pcorp1-4r为引物扩增得到序列表中序列2所示的片段。
46.表1目的序列扩增引物序列
47.引物primer序列sequence(5
’‑3’
)pcorp1-3-ftcgtcttcactccgcaat
pcorp1-3-rtctccaggataagcaccactpcorp1-4-ftagcactttgaccgcacctpcorp1-4rgcagaagattcgccgtcta
48.将上述序列1和序列2分别与烟草、番茄、辣椒等辣椒疫霉常见寄主的基因组序列(ncbi)进行比对，检测其对植物基因非特异性沉默的可能性。比对结果显示本发明所涉及的序列1和序列2与植物基因组序列最大连续匹配均不足10个碱基，且通过序列潜在产生的sirna预测显示上述序列产生的sirnas均不能达到基因沉默的有效长度，排除了沉默寄主植物基因的可能性。
49.实施例2本发明植物表达载体的构建
50.扩增本发明涉及序列的引物委托擎科生物合成，序列采用q5 high fidelity dna polymerases(neb)进行扩增获得，分别凝胶电泳回收后进行载体构建。
51.对于发卡结构载体，将序列表中序列1或者序列表中序列2所述的片段先正向插入pentr1a质粒的酶切位点cla i和ecor i之间，经pcr、测序、酶切、电泳验证后再将序列表中序列1或者序列表中序列2所述片段利用酶切位点sac ii和spe i反向插入pentr1a-5’orp载体的ubc基因内含子的3’端，质粒经验证后保存，再利用lr反应将质粒转入植物表达载体pearlygate100两个attr位点之间(如图1所示)上，获得正反向插入序列表中序列1的片段的重组载体peg::orp3hp和正反向插入序列2的片段的重组载体peg::orp4hp,即获得转入抗辣椒疫病的转基因烟草表达载体。peg::orp3hp载体结构如图2所示，其序列如序列表中序列3所示；peg::orp4hp载体结构如图3所示，其序列如序列表中序列4所示。
52.将上述植物表达载体转化入根癌农杆菌菌株gv3101感受态细胞中。
53.实施例3利用本发明涉及的植物表达载体进行转基因植物构建
54.供试植株及菌液：无菌培养的烟草苗，含有本发明涉及的植物表达载体的根癌土壤杆菌菌株gv3101。
55.供试培养基：
56.(1)1/2ms固体培养基：ms(murashige&skoog medium)2.2g，蔗糖30g，搅拌溶解后用naoh调ph至5.6-5.8，加入8g琼脂定容至1l，高温高压灭菌。
57.(2)ms固体(液体)预培养基：ms 4.44g，mes 2.1235g,蔗糖30g,搅拌溶解后用naoh调ph至5.8，加入2.4g植物凝胶(phytogel)，1ml 6-ba(1mg/ml)高温高压灭菌后加入1ml乙酰丁香酮(as,100μm)，1ml萘乙酸(naa,1mg/ml)，液体培养基不加入植物凝胶。
58.(3)筛选培养基(生芽)：ms 4.44g，蔗糖30g，搅拌溶解后用naoh调ph至5.8，加入2.4g植物凝胶(phytogel)，高温高压灭菌，灭菌后加入1ml玉米素(zt,2mg/ml)，100μl吲哚-3-乙酸(iaa,1mg/ml)，1ml特美丁(tim,300mg/ml)，筛选标记1ml草甘膦(5mg/ml)，2ml羧苄青霉素(carbenicillin,cb 50mg/ml)。
59.(4)茎伸长培养基：ms 4.44g，蔗糖30g,搅拌溶解后用naoh调ph至5.8，加入2.4g植物凝胶(phytogel)，高温高压灭菌，灭菌后加入500μl玉米素(zt,2mg/ml)，100μl吲哚-3-乙酸(iaa,1mg/ml)，1ml赤霉素(ga,1mg/ml)，1ml特美丁(tim,300mg/ml),筛选标记1ml草甘膦(5mg/ml)，2ml羧苄青霉素(carbenicillin,cb 50mg/ml)
60.(5)生根培养基：ms 4.44g，蔗糖30g,搅拌溶解后用naoh后调ph至5.8，加入2.4g植物凝胶(phytogel)，高温高压灭菌，灭菌后加入1ml吲哚丁酸(iba，0.5mg/ml)，1ml特美丁
(tim,300mg/ml),筛选标记1ml草甘膦(5mg/ml)，2ml羧苄青霉素(carbenicillin,cb 50mg/ml)。
61.转基因植物构建方法：
62.(1)取一定数量的本生烟种子，用2％的次氯酸钠浸泡15秒，消毒后用无菌水洗涤5-6次，每次需充分洗涤，彻底去除残留的消毒剂，种子洗涤干净后，将种子播在1/2ms平板培养基上。待长出两片子叶后，将发芽种子转入倒有1/2ms培养基的组培瓶中，培养至6-8叶期(一个半月左右)，即获得无菌幼苗可用于组织培养。
63.(2)预培养阶段：将大小适宜的无菌苗取出，取中上部叶位的叶片作为组织培养材料，用剪刀剪成1
×
1cm的方块。将处理好的外植体置于预培养培养基上，培养基上提前铺好灭过菌滤纸，至于黑暗中放置2～3天。
64.(3)准备浸润用农杆菌菌液
65.a.将含有higs介体的根癌土壤杆菌菌株gv3101活化后，取单菌落于2ml lb液体培养基(rifampicin 50μg/ml,getamycin 50μg/ml,kanamycin 50μg/ml，下文将不再赘述)中，28℃200rpm震荡培养24h。
66.b.以1％的接种量接种摇培菌液到100ml lb液体培养基，震荡培养至对数生长中期，od600＝0.6-0.8。
67.c.4000rpm离心10min，菌沉用50ml ms液体培养基洗涤一遍，4000rpm离心10min再次收集菌沉。
68.d.用50ml ms液体培养基悬浮菌体即可用于转化。
69.(4)共培养阶段：将预培养两天后的外植体浸泡于农杆菌侵染液中，浸泡期间需不断震荡，使细菌与叶片组织伤口部位充分接触；共培养10分钟后倒掉侵染液，无菌滤纸吸干外植体表面菌液，置于预培养培养基上(叶背朝下)，黑暗条件25℃共培养2天。
70.(5)芽诱导阶段：将外植体取出置于芽诱导培养基，在光照培养组培间中培养15天左右，每隔一周左右继代培养一次，再转入新的芽诱导培养基中继续进行继代培养，直至外植体发芽完全。
71.(6)芽伸长阶段：经过芽诱导后待外植体发芽，芽长约为1-2cm时转入芽伸长培养基中培养2～3周。
72.(7)生根阶段：当芽伸长至3-5cm时，用无菌的手术剪刀剪掉愈伤组织后将芽插入转移到生根培养基中培养3-4周。
73.(8)土培期：将pcr验证为阳性，且生根旺盛，生长到一定高度的小苗及时转入土盆里。培养至其开花结种，即获得f1代。
74.(9)转基因植物的验证：由于转化载体携带草甘膦抗性基因，可采用含草甘膦的ms培养基培养转基因植物种子以评估转基因植物对草甘膦的抗性，同时结合草甘膦抗性基因和本发明涉及序列的扩增进行转基因验证。
75.结果表明，按照上述方法获得了稳定表达peg::orp3hp的转peg::orp3hp烟草株系peg::orp3hp-3、peg::orp3hp-4、peg::orp3hp-5，稳定表达peg::orp4hp的转peg::orp4hp烟草株系peg::orp4hp-1、peg::orp4hp-4、peg::hnbcesa3hp-6、peg::hnbcesa3hp-8、peg::hnbcesa3hp-10和peg::hnbcesa3hp-11。
76.实施例4转化本发明涉及的植物表达载体的转基因植物的抗病性评价
77.本试验采用辣椒疫霉游动孢子悬浮液灌根接种进行转基因植物的抗病性评价。用移液器向烟草植株茎基部注射3ml 8
×
103个/ml孢子悬浮液进行灌根接种，接种7d后，将植株连根从土壤中拔出，观察植株根茎基部发病情况，如果茎基部出现变褐坏死，剪开茎基部后植株维管束变褐变黑，则断定烟草发病。灌根接种试验对每类转基因烟草至少有8次生物学重复，7d后统计每类转基因植株发病数和平均病情指数，计算平均发病率。
78.统计结果见图4-图7，与野生型和转化空载体的烟草相比，表达本发明涉及的植物表达载体的转基因植物上辣椒疫霉的扩展明显受到抑制，平均病情指数及发病率均显著降低。说明本发明涉及的植物表达载体能有效增强植物对辣椒疫霉的抗病性。同时，peg::orp3hp和peg::orp4hp转基因植物在发病率上无显著差异，说明peg::orp3hp和peg::orp4hp表达载体可以同等水平地诱导植物产生对辣椒疫霉的抗病性。
79.实施例5、转化本发明涉及的植物表达载体的植物上靶向pcorp1的小rna检测及侵染该植物时pcorp1基因表达量检测
80.采用pcr dig probe synthesis kit试剂盒(roche)，通过pcr方式合成特异性dig-dutp的高敏感核酸探针。试验方法如下：利用dnaman软件设计合成靶向pcorp1基因特异性探针所需的引物(见表2)。
81.表2 northern blot探针引物序列
[0082][0083]
探针合成具体试验步骤如下：pcr dig probe synthesis kit试剂盒内试剂置于冰上融化，轻轻涡旋后离心，按一下步骤配置50μl的反应体系，并进行pcr反应。pcr反应体系为template dna 10-100pg，plasmid dna，pcr buffer with mgcl
2 5μl，pcr dig probe synthesis mix 5μl，上游pcr引物10
×
5μl，下游pcr引物10
×
5μl，enzyme mix 0.75μl，water add up to 50μl。pcr条件：95℃2min起始反应95℃30s，60℃30s，72℃40s反应30个循环72℃7min，结束反应。
[0084]
采用trizol法(invitrogen,usa)提取peg::orp3hp或peg::orp4hp转基因烟草的总rna并与已经合成的特异性探针进行杂交，本试验以稳定表达的烟草内源小rna u6为阴性对照，通过northern-blot杂交试验检测在瞬时表达样品中higs介体是否被剪切加工生成特异性的小rna分子。
[0085]
结果如图9所示，在表达本发明涉及的植物表达载体的瞬时表达植物体内均能检测到大量靶向转基因序列的小rna分子，说明本发明涉及的植物表达载体可在植物体内高效产生潜在能诱发靶基因沉默的小rna。
[0086]
收集接种后发病叶片，利用trizol法提取样品总rna，反转录获得cdna，再通过qpcr测定靶基因pcorp1表达量变化。值得注意的是不同植物表达载体中含有靶基因的不同片段正义链和反义链，因而测定瞬时表达后接种发病样品中靶基因表达量时，应避免扩增表达载体中靶基因片段。所以本试验针对不同植物表达载体设计并筛选了测定靶基因表达量所需的引物(见表3)。qpcr引物设计筛选有三个条件：首先是引物扩增序列避开瞬时表达higs介体的靶基因序列，第二是是熔解曲线为单峰，第三是引物扩增效率在90％-110％之间，相关系数r2》0.98。
[0087]
表3测定pcorp1基因表达量所需的引物
[0088][0089]
如图8所示，与对照植物相比，在表达本发明涉及载体peg::orp3hp或peg::orp4hp的瞬时表达植物上生长的辣椒疫霉的orp1基因均表现明显下调，说明本发明涉及的植物表达载体peg::orp3hp和peg::orp4hp可以通过寄主诱导的基因沉默有效介导辣椒疫霉的靶标基因沉默。同时，peg::orp3hp和peg::orp4hp转基因植物在靶标基因沉默效率和靶基因相关小rna产量两方面无显著差异，说明peg::orp3hp和peg::orp4hp表达载体具有同等的基因沉默效率，二者均可以作为靶向辣椒疫霉氧化固醇结合蛋白1基因进行干扰的高效植物表达载体。
[0090]
以上结果说明构建的转基因植物可以通过小rna介导的基因沉默显著增强对辣椒疫霉引起的植物病害的抗性。