一种甘草酸衍生物及其制备方法和在制备抗炎药物方面的应用

1.本发明属于医药技术领域，具体涉及一种甘草酸衍生物或其药学上可接受的盐的制备方法，特别涉及一种甘草酸衍生物或其药学上可接受盐在制备抗炎药物方面的应用。


背景技术：

2.近年来国内甘草资源短缺，企业对甘草的进口需求呈现增长趋势。天然产物提取行业作为十几年的新兴行业，应人民对植物药日益增长的需求和对绿色食品的追求的增加，正在不断扩大，甘草酸就是此行业中的重要一员。
3.甘草是常用大宗中药材，其主要三萜类活性成分为甘草酸(gl)。甘草酸是一种五环三萜类化合物，且具有良好的抑菌，保肝、抗炎，抗过敏，和抗肿瘤等多种生理活性，现甘草酸盐类化合物已是应用临床的保肝类药物主要成分；甘草酸甜度远高于蔗糖，且热量低，是一种新型甜味剂；甘草酸还应用于化妆品行业，主打抗炎功效。然而，甘草酸在临床应用中存在低血钾和假醛固酮增多症等不良反应。因此，在如此大的市场需求下加快了甘草酸衍生物的开发。甘草酸衍生物单葡萄糖醛酸甘草次酸(gamg)和甘草次酸(ga)分别为甘草酸水解一分子葡萄糖醛酸和两分子葡萄糖醛酸的产物，在甘草中含量极低，不仅在吸收性和药理活性表现更优，且没有出现假醛固酮增多症等不良反应，具有更高的药用价值，但是传统提取手段不易获取。
4.为了提高甘草酸的生理活性，改善其临床药用副作用以实现天然甘草成分的高值化利用，以及满足近年来食品工业，临床药用等领域对其日益增长的需求，通过生物转化对的方法，以甘草酸为底物，对其进行结构修饰，大批量制备甘草次酸、单葡萄糖醛酸甘草次酸等衍生物一直是甘草酸研究与开发利用的重点。如何制备高效、无毒、无不良反应的甘草酸衍生物药物是本发明的关键所在。


技术实现要素：

5.本发明要解决的技术问题是一种利用土曲霉菌tmz05首次利用生物转化方法高效制备单葡萄糖醛酸甘草次酸或甘草次酸内酯，甘草新苷摩尔收率最高可达70％，，甘草次酸内酯摩尔收率最高可达90％。甘草新苷无细胞毒性；甘草次酸内酯无细胞毒性，与甘草酸相关活性对比，不仅大剂量时无毒同时对细胞具有增殖作用，且在炎症治疗方面具有显著疗效，甘草次酸内酯组与甘草酸组对比，甘草次酸内酯的抗炎活性明显优于甘草酸及甘草次酸，为炎症疾病提供了新的药物选择。
6.为解决上述问题，本发明提供以下方案：一种甘草酸衍生物甘草次酸内酯，所述的甘草次酸内酯具有下式(1)所示的结构：
[0007][0008]
所述的制备甘草酸衍生物甘草新苷或甘草次酸内酯的方法，其特征在于，包括以下步骤：
[0009][0010]
合成方法为：以甘草酸为底物，在土曲霉tmz05接种量30个菌丝体，发酵液初始ph为6.5，甘草酸浓度5g/l，30℃条件下180r/min摇瓶发酵4天的条件下，甘草酸选择性脱去一个葡萄糖醛酸，形成甘草新苷；以甘草酸为底物，在驯化后的优势菌种tmz05的催化作用下，在土曲霉菌tmz05于土豆液发酵培养基中，接种量30-40个菌丝体，发酵液初始ph为6.0，甘草酸浓度5g/l，35℃条件下180r/min摇瓶发酵6天的条件下，甘草酸脱去2个葡萄糖醛酸后，a环发生内酯化反应，形成甘草次酸内酯；具体分为以下步骤：
[0011]
步骤(1)：将土曲霉菌tmz05，进行常规培养、发酵，发酵液过滤获得湿菌体；所述土曲霉菌，保藏名称：土曲霉菌tmz 05(aspergillus terrus tmz05)，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉大学，保藏日期：2022年5月11日；保藏号为：cctcc no：m 2022605；
[0012]
步骤(2)：以甘草酸为原料，用磷酸缓冲溶液及非水相溶剂配制得到原料溶液；
[0013]
步骤(3)：将步骤(1)湿菌体或用载体固定化后的湿菌体加入到步骤(2)的溶液中进行催化反应；
[0014]
所述的磷酸缓冲溶液浓度为100～150mmol/l，ph为6.0～6.5。所述的原料溶液，其组分中，甘草酸的浓度为5g/l，非水相溶剂体积百分比为5～20％。所述的非水相溶剂为二甲基亚砜或乙醇。
[0015]
所述的制备甘草酸衍生物甘草新苷的方法，其特征在于，包括以下步骤：
[0016]
将土曲霉菌tmz05接种到pda培养基中，180r/min摇床中30℃培养1天，转接2～4％(w％)的种子培养液到发酵培养基中，与种子液培养条件相同，培养1天；土曲霉接种量30个菌丝体，发酵液初始ph为6.5，甘草酸浓度5g/l，30℃条件下180r/min摇瓶发酵4天，甘草新苷摩尔收率最高可达70％。
[0017]
述的制备甘草酸衍生物甘草次酸内酯的方法，其特征在于，包括以下步骤：
[0018]
将土曲霉菌tmz05接种到pda培养基中，180r/min摇床中30℃培养1天，转接2～4％(w％)的种子培养液到土豆液发酵培养基中，与种子液培养条件相同，培养1天；土曲霉菌tmz05接种量30-40个菌丝体，发酵液初始ph为6.0，甘草酸浓度5g/l，35℃条件下180r/min摇瓶发酵6天，甘草次酸内酯摩尔收率最高，可达92％。
[0019]
一种治疗炎症疾病药物，包括权利要求1所述的活性成分为式(1)所示的单葡萄糖醛酸甘草次酸内酯，以及药学上可接受的药用辅料。
[0020]
所述的治疗炎症疾病药物，包括活性成分为式(1)所示的甘草次酸内酯或其盐，以及药学上可接受的药用辅料组合制成临床适用的片剂、胶囊剂、颗粒剂、注射剂。
[0021]
所述的治疗炎症疾病药物，所述甘草次酸内酯盐指甘草次酸内酯与盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、乙酸、乳酸、丙二酸、琥珀酸、戊二酸、马来酸、烷基或芳基磺酸形成的盐。
[0022]
所述的甘草次酸内酯在制备治疗炎症疾病药物的应用，其特征在于，所述炎症疾病包括肺炎、胃炎或胰腺炎。
[0023]
步骤(1)：从来自各甘草产地的土壤样品中分离，富集培养2天，稀释涂布于细菌培养基和真菌培养基中培养2天，选择长势显著菌落接种于甘草酸选择固体培养基培养4天，优选优势生长菌株作为复筛备选菌株。通过18srdna鉴定为土曲霉菌属，将其命名为土曲霉菌tmz05，并进行菌种保藏。
[0024]
步骤(2)：摇床培养：将步骤(1)菌株接种于培养基中，在温度30℃、160rpm转速、培养24小时，获种子培养液。将种子培养液接种于发酵培养基中，摇床发酵24小时。
[0025]
步骤(3)：在步骤(2)发酵液中加入1g/l甘草酸粉，在发酵时间分别为0h、24h、48h、72h、96h、120h取发酵液上清，通过uplc及lc-ms检测筛选目标功能性菌株tmz05。
[0026]
步骤(4)：将土曲霉菌tmz05接种于pda培养基中，在温度30℃、160rpm转速、培养24小时，获种子培养液；接种种子液中30个菌丝体于土豆液发酵培养基中。
[0027]
步骤(5)：以甘草酸为原料，用磷酸缓冲溶液及非水相溶剂配制得到5g/l原料溶液。
[0028]
步骤(6)：将步骤(4)湿菌体或用载体固定化后的湿菌体加入到步骤(5)的溶液中进行催化反应，在温度35℃，ph 6.0，的条件下,180r/min摇瓶发酵6天，通过uplc进行测定，计算转化率。
[0029]
本发明所述化合物，由土曲霉菌种tmz05(保藏编号为cctcc no：m2022605)在非水相中制备甘草新苷与甘草次酸内酯而得。
[0030]
本发明所述的甘草新苷实现高效制备，甘草次酸内酯为首次利用生物转化法合成，此前未有报道。
[0031]
本发明研究甘草酸衍生物对lps诱导的巨噬细胞raw264.7的抗炎作用，以此来验证式(1)(2)所述的甘草新苷、甘草次酸内酯及药学上可接受的盐在制备抗炎药物方面的应用。方法为采用脂多糖(lps)诱导小鼠巨噬细胞(raw264.7)释放一氧化氮(no)模型开展本
发明部分化合物的抗炎活性评价，用griess法测试化合物对no生成的抑制活性。阳性药为地塞米松。甘草新苷及甘草次酸内酯均对lps诱导的小鼠巨噬细胞raw264.7具有显著、无毒的抗炎作用。
[0032]
本发明的有益效果为：
[0033]
1.本发明提供了一种利用土曲霉菌tmz05首次利用生物转化方法高效制备甘草次酸内酯；
[0034]
2.甘草次酸本身具有较强的细胞毒性；甘草新苷无细胞毒性；甘草次酸内酯无细胞毒性且具有一定的细胞增殖作用。本发明所提供的甘草新苷、甘草次酸内酯作为甘草酸衍生物无毒,与甘草酸相关活性对比，不仅大剂量时无毒同时对细胞具有增殖作用，且在炎症治疗方面具有显著疗效，甘草次酸内酯组与甘草酸组对比，甘草次酸内酯的抗炎活性明显优于甘草酸及甘草次酸，为炎症疾病提供了新的药物选择。
[0035]
3.本发明所提供的生物转化制备甘草新苷的方法。土曲霉接种量30个菌丝体，发酵液初始ph为6.5，甘草酸浓度5g/l，30℃条件下180r/min摇瓶发酵4天，甘草新苷摩尔收率最高可达70％，与筛选阶段相比其摩尔收率提高至3倍.
[0036]
4.本发明所提供的生物转化制备甘草次酸内酯的方法。土曲霉菌tmz05于土豆液发酵培养基中，接种量30-40个菌丝体，发酵液初始ph为6.0，甘草酸浓度5g/l，35℃条件下180r/min摇瓶发酵6天，甘草次酸内酯摩尔收率最高，可达90％。
[0037]
5.本发明提供了一株可高效转化甘草酸为甘草新苷及甘草次酸内酯的土曲霉菌株(保藏号：cctcc no：m 2022605)。从来自各甘草产地的土壤样品中分离，富集培养2天，稀释涂布于细菌培养基和真菌培养基中培养2天，选择长势显著菌落接种于甘草酸选择固体培养基培养4天，优选优势生长菌株作为复筛备选菌株。通过18srdna鉴定为土曲霉菌属，将其命名为土曲霉菌tmz05，并进行菌种保藏。
附图说明
[0038]
图1是土曲霉菌tmz05 18srdna进化树分析。
[0039]
图2是土曲霉菌tmz05的平面pda培养基正面样貌。
[0040]
图3是土曲霉菌tmz05的平面甘草酸选择培养基正面面样貌。
[0041]
图4是土曲霉菌tmz05的孢子形态图。
[0042]
图5是土曲霉菌tmz05的菌丝形态图。
[0043]
图6是甘草新苷的质谱图。
[0044]
图7是甘草次酸内酯的质谱图。
[0045]
图8是甘草次酸内酯的1h nmr谱图。
[0046]
图9是甘草次酸内酯的
13
c nmr谱图。
[0047]
图10是甘草次酸内酯的hmbc谱图。
[0048]
图11是甘草酸及甘草酸衍生物对巨噬细胞raw264.7的细胞毒性影响。
[0049]
图12是甘草酸及甘草酸衍生物对lps诱导的巨噬细胞raw264.7的抗炎作用。
[0050]
本发明提供的一种土曲霉菌，保藏名称：土曲霉菌tmz 05(aspergillus terrus tmz05)，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉大学，保藏日期：2022年5月11日；保藏号为：cctcc no：m 2022605。
具体实施方式
[0051]
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制。
[0052]
实施例1
[0053]
制备单葡萄糖醛酸甘草次酸的菌株的筛选与菌种鉴定
[0054]
分别向5份100ml超纯水中加入5g各甘草产地土壤样品，30℃，180r/min条件下进行富集培养，培养时间2天；取各富集液适量，分别稀释涂布于pda培养基和lb固体培养基，30℃恒温培养箱中培养2天；挑选长势显著菌落，接种至空白pda培养基和lb固体培养基，接种方法为平板划线法，培养两天；重复以上步骤，直至得到不同菌株单菌落。于分别挑取生长特征不同的单菌落，分别接种至gl选择固体培养基和pda/lb固体培养基中，接种方式为接种针垂直刺入培养基平面下2mm位置，于30℃培养箱中培养4天。综合评判不同菌株生长态势，优选可以利用gl的菌株最为后续复筛备选菌株，对筛选获得的菌株编号并于超低温冻存保藏。
[0055]
pda培养基：新鲜土豆200g，加1000ml水，煮30min，经4层纱布过滤所得液体，固体培养基中需要另外加入琼脂18g/l，121℃，高压蒸汽灭菌15min，冷却至室温备用。
[0056]
gl选择固体培养基：甘草酸1g/l，琼脂18g/l，121℃，高压蒸汽灭菌15min，冷却至室温备用。
[0057]
lb固体培养基：胰蛋白胨10g/l，酵母膏5g/l，nacl 10g/l，琼脂18g/l，121℃，高压蒸汽灭菌15min，冷却至室温备用。
[0058]
发酵培养基：新鲜土豆液，将新鲜土豆200g切块，加1000ml水，煮30min，经4层纱布过滤所得液体，121℃，高压蒸汽灭菌15min，冷却至室温备用。
[0059]
将保藏的菌株，从冻存管接种到pda培养基中，180r/min摇床中30℃培养1天，转接2～4％(w％)的种子培养液到发酵培养基中，与种子液培养条件相同，培养1天；将甘草酸粉末使用紫外灭菌30分钟，向发酵液中甘草酸粉，至发酵液中甘草酸浓度为1g/l。发酵时间从发酵培养基中甘草酸添加时间开始计算，在发酵时间分别为0h、24h、48h、72h、96h、120h取发酵液上清，转速13000r/min离心10min，取上清，加入等体积色谱纯甲醇，再次相同条件下离心10min，使用0.22mm滤膜过滤上清液，采用uplc及lc-ms技术检测。反应后，经uplc检测，获得5株具有生物转化甘草酸的耐有机溶剂菌株。其中一株菌株具有去糖基化结构修饰甘草酸及内酯化化结构修饰甘草酸的能力，优化后此菌株对底物甘草酸转化为甘草新苷的转化率达到70％，此菌株对底物甘草酸转化为甘草次酸内酯的转化率达到92％。
[0060]
该菌株tmz05与pda培养基上30℃条件下培养3天，菌落表面平坦或接近平坦，菌丝初为白色后逐渐变为土黄色，分生孢子呈土黄色，易脱落，渗出液缺乏，菌落背面呈棕黄色。100倍光学显微镜下观察分生孢子形态，孢子呈球状；分别在10、20、40、100倍光学显微镜下观察菌丝状态，菌丝呈长管状，较多分支，是有隔膜多核菌丝，依据上述特征，菌株tmz05与土曲霉aspergillus terreus最为相似。通过18srdna同源性鉴定及系统发育分析，鉴定此菌株为土曲霉菌，命名为土曲霉菌tmz05。
[0061]
取菌库保藏菌株土曲霉tmz05，挑取孢子接入固体pda平板中，于恒温培养箱(35℃)中培养活化36-72h。挑取已活化的tmz05孢子，转接固体甘草酸筛选平板中，放入30℃恒
温培养箱中培养48-96h；挑取一定量菌丝，接入甘草酸压力液体培养基中，置于摇床180r/min，30℃压力培养24h；精确吸取30-35个菌丝体，加入土豆液体培养基中，放入摇床中培养，时间为24h；将200ml发酵液上清以涂布方式转接至pda上；静置培养3～4天，温度为30℃，以上过程为一个定向进化周期，其所获得菌株即为一代，其余代数菌株同上述方法，以上方法获得tmz05-2的。
[0062]
实施例2
[0063]
土曲霉菌tmz05的发酵及静息细胞的制备
[0064]
将土曲霉菌tmz05的发酵接种到种子培养基中：土豆200.0g/l，葡萄糖8.0g/l，于30℃，200rpm培养24小时。扩大培养基、发酵培养基，其组分和含量均为：发酵培养基：酵母膏2.5g/l，葡萄糖0.5g/l，caco
3 0.5g/l。种子液按0.5％(v/v)接种到扩大培养基、发酵培养基，于30℃，200rpm培养24小时。10000rpm离心15分钟后收集菌体细胞，以生理盐水洗涤l～2次，得土曲霉菌tmz05的静息细胞。
[0065]
以上述相同方法获得土曲霉菌tmz05-2的静息细胞。
[0066]
实施例3
[0067]
将实施例2中的菌体细胞发酵液过滤，得到湿菌体。以二甲基亚砜、甘草酸、磷酸缓冲配置原料溶液，即反应溶液。反应溶液中有机溶剂二甲基亚砜的比例为20％(v/v)，甘草酸5g/l，磷酸缓冲的摩尔浓度为150mmol/l，磷酸缓冲的ph 6.5，蔗糖浓度为50g/l。将上述所得的湿菌体分散于反应溶液中，加入到反应器中，于30℃，200rpm条件下培养4天后，10000rpm离心10分钟得反应溶液上清，uplc检测分析测得甘草酸转化甘草新苷转化率为70％。
[0068]
反应溶液中有机溶剂二甲基亚砜的比例为20％(v/v)，甘草酸5g/l，磷酸缓冲的摩尔浓度为150mmol/l，磷酸缓冲的ph 6.0，蔗糖浓度为50g/l。将上述所得的湿菌体分散于反应溶液中，加入到反应器中，于30℃，200rpm条件下培养6天后，10000rpm离心10分钟得反应溶液上清，uplc检测分析测得甘草酸转化甘草次酸内酯转化率为92％。
[0069]
产物用大孔树脂进行分离，取适量树脂，用乙醇浸泡24h后，除去树脂碎片和杂物。湿法装柱用1l乙醇冲洗，再用蒸馏水洗至无醇味；接行酸碱处理，即先后用体积分数5％的hcl溶液与质量分数2％的naoh溶液分别以2bv/h流速通过树脂柱，并静止置2～4h后，用蒸馏水洗至ph值中性。为避免dmso溶解转化产物降低上样吸附率，所以转化液用5倍体积的去离子水(ph4.0，冰醋酸调节)稀释至dmso《2％后加样。加样量20mg/g湿树脂，加样流速20ml/min。选用甲醇加去离子水作流动相进行洗脱，调整甲醇和去离子水的体积比，在洗脱流速20ml/min时，确定洗脱液中甲醇比例。浓缩干燥：经hplc检测，合并洗脱液，用旋转蒸发仪对其减压真空浓缩，加热温度40℃。最后将固体置于真空干燥箱中，40℃干燥6h。
[0070]
土曲霉菌tmz05非水相中制备甘草新苷及甘草次酸内酯的反应化学式见下式：
[0071][0072]
经核磁共振质谱分析鉴定从nmr图谱上看，获得的结构与预期产物的结构一致。以上结果证实该反应中生成了甘草新苷及甘草次酸内酯。
[0073]
实施例4
[0074]
甘草酸衍生物在抗炎方面的应用
[0075]
以含10％fbs、1％双抗的dmem培养基，将raw264.7细胞置于10cm培养皿中，于37℃、5％co2细胞培养箱培养。将raw264.7细胞以1
×
104的密度接种于96孔板中，培养24h待贴壁后，加入甘草酸、甘草次酸、甘草新苷、甘草次酸内酯(25、50、100、200μm)，在37℃、5％co2细胞培养箱中培养24h，向培养细胞的96孔板中每孔加入10μl的cck8，放入37℃、5％co2细胞培养箱中培养2h，采用全波长酶标仪于450nm波长处检测吸光度值。
[0076]
将raw264.7细胞以1
×
104的密度接种到96孔板中，每孔104个细胞。raw264.7细胞用不同浓度的化合物(25、50、100或200μg/ml)预处理1小时，并与lps(1μg/ml)孵育24小时。收集细胞上清液用于实验。通过griess试剂测定法测量no产生，采用波长酶标仪于540nm波长处检测吸光度值(操作按照碧云天no试剂盒说明书)。
[0077]
统计学方法：计算数据资料以表示，应用spss统计软件进行统计分析，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用t检验，检验水准为α＝0.05。
[0078]
甘草酸衍生物对巨噬细胞raw264.7的细胞活力影响结果表明，与对照组相比，甘草酸高浓度(200μm)时具有细胞毒性；甘草次酸本身具有较强的细胞毒性；甘草新苷无细胞毒性；甘草次酸内酯无细胞毒性且具有一定的细胞增殖作用。图11为甘草酸衍生物对巨噬细胞raw264.7的细胞活力影响。
[0079]
甘草酸衍生物对lps诱导的巨噬细胞raw264.7的抗炎作用与空白组相比，模型组模型显著，证明细胞炎症模型造模成功；与模型组对比，甘草酸及其衍生物具有显著的抗炎作用；甘草次酸内酯组与甘草酸组对比，甘草次酸内酯的抗炎活性明显优于甘草酸及甘草次酸。图12为甘草酸衍生物对lps诱导的巨噬细胞raw264.7的抗炎作用。
[0080]
实施例5
[0081]
片剂的制备
[0082]
处方(以1000片的处方量计)：
[0083]
实施例3中所得甘草次酸内酯纯品60g；
[0084]
蔗糖60g；
[0085]
玉米淀粉80g；
[0086]
硬脂酸镁2g。
[0087]
制备方法：将活性成分与蔗糖、玉米淀粉混合，加水湿润，搅拌均匀，干燥，粉碎过筛，加入硬脂酸镁，混合均匀，压片。平均片重202mg/片，活性成分含量为60mg。
[0088]
本发明未尽事宜为公知技术。
[0089]
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。