胶原基DPP-IV抑制肽的制备方法及胶原基DPP-IV抑制肽

胶原基dpp-iv抑制肽的制备方法及胶原基dpp-iv抑制肽
技术领域
1.本发明涉及食品加工领域。更具体地说，本发明涉及一种胶原基dpp-iv抑制肽的制备方法及胶原基dpp-iv抑制肽。


背景技术：

2.近年来，全球糖尿病患者持续增加，已成为一个重要的公共健康问题，据国际糖尿病联盟报告，2019年全球约有4.63亿人患糖尿病，预计到2045年，全球糖尿病患者将达到7亿。ii-型糖尿病是糖尿病的主要类型，占糖尿病发病率的90％～95％，主要表现为胰岛素抵抗和(或)胰岛β细胞受损。目前，ii型糖尿病的预防与治疗已引起全球范围内的广泛关注。dpp-iv抑制剂通过抑制dpp-iv的活性，防止胰高血糖素样肽-1裂解，间接调解胰岛素的分泌，缓解ii型糖尿病患者的高血糖症状。虽然源自胶原蛋白的dpp-iv抑制剂被证明是抑制高血糖的潜在底物，并具有较好的抑制效果，但胶原蛋白稳定的三螺旋结构不易被蛋白酶水解，限制了胶原基dpp-iv抑制肽的开发。基于预处理提高dpp-iv抑制肽活性已有报道，但大部分研究集中于预处理原材料(皮和骨)，而对原料中胶原蛋白的影响不显著，此外，常见的预处理如酸和碱虽然价格低廉，但反应条件极端不易控制，且易产生影响水解物品质的产物。因此，高效、绿色的预处理方式修饰胶原蛋白结构以促进dpp-iv抑制肽的提取已成为急待解决的问题。


技术实现要素：

3.本发明的一个目的是提供一种胶原基dpp-iv抑制肽的制备方法及胶原基dpp-iv抑制肽，以解决上述问题。
4.为了实现根据本发明的目的和其它优点，提供了一种胶原基dpp-iv抑制肽的制备方法，包括如下步骤：
5.步骤一，将冻干胶原蛋白用乙酸溶解后，用疏敏性离子液体处理，得疏敏性胶原蛋白；
6.步骤二、将疏敏性胶原蛋白用乙酸复溶后，用间歇式超声波处理，得超声波修饰后的胶原蛋白；
7.步骤三、将超声波修饰后的胶原蛋白用去离子水复溶后，用木瓜蛋白酶进行酶解处理，水解物离心、冷冻干燥，即得。
8.优选的是，所述的胶原基dpp-iv抑制肽的制备方法，步骤一中，将冻干胶原蛋白用乙酸溶解，使胶原蛋白浓度为4～10mg/ml，在25
±
2℃下用磁力搅拌器搅拌10～30min后，将疏敏性离子液体按照疏敏性离子液体体积与冻干胶原蛋白质量比4:10加入胶原蛋白溶液中，再在25～37℃下采用梯度升温结合平板翻转振荡法搅拌1～3h，4500g离心10～30min，收集上清液，旋蒸，然后加入无水乙醇洗涤、离心，重复无水乙醇洗涤、离心操作，直至离心上清液中用folin-phenol试剂检测不到疏敏性离子液体，最后将脱除疏敏性离子液体后的胶原蛋白样品进行冷冻干燥，得疏敏性胶原蛋白
9.优选的是，所述的胶原基dpp-iv抑制肽的制备方法，所述疏敏性离子液体为[emim][ac]。
[0010]
优选的是，所述的胶原基dpp-iv抑制肽的制备方法，所述梯度升温具体包括一次升温至25
±
1℃维持30
±
5min，二次升温至30
±
1℃维持30
±
5min，三次升温至37
±
1℃维持60
±
5min。
[0011]
优选的是，所述的胶原基dpp-iv抑制肽的制备方法，步骤二中，将疏敏性胶原蛋白用乙酸复溶至浓度为4～10mg/ml，在25
±
2℃下用磁力搅拌器搅拌10～30min，再用超声波交替处理胶原蛋白溶液，超声波功率为400
±
100w，超声时间为20
±
10min，处理模式为2秒运行和2秒停止交替进行，处理后冷冻干燥，得超声波修饰后的胶原蛋白。
[0012]
优选的是，所述的胶原基dpp-iv抑制肽的制备方法，步骤三中，将超声波修饰后的胶原蛋白用去离子水复溶至浓度为4～10mg/ml，加入超声波修饰后的胶原蛋白质量的2～4％的木瓜蛋白酶，控制酶解ph为7～8，酶解温度为40～50℃，酶解时间为2～4h，水解物采用超滤离心管分级，截留分子量为0～3kda，离心力为4000～6000g，离心时间为10～20min，将不同分子量的胶原水解物冷冻干燥，得不同分子量的胶原基dpp-iv抑制肽。
[0013]
本发明还提供了一种胶原基dpp-iv抑制肽，其由上述制备方法制备而成。
[0014]
本发明至少包括以下有益效果：
[0015]
第一、本发明的胶原基dpp-iv抑制肽的制备方法，以疏敏性离子液体为促疏水基团暴露方法对胶原蛋白溶液进行疏水基团结构修饰，再通过超声波的空化和剪切效果进行胶原蛋白结构的二次展开，使修饰后的胶原蛋白具有更易被蛋白酶识别的特异位点，且制备的胶原基dpp-iv抑制肽具有分子量小、特异氨基酸含量丰富和活性强等特点。
[0016]
第二、本发明的胶原基dpp-iv抑制肽的制备方法，具有易操作和成本低的特点，且符合绿色制造技术的要求。
[0017]
第三、本发明的方法制备的胶原基dpp-iv抑制肽，是一种预防ⅱ型糖尿病的新型胶原蛋白肽，可有效调节胰岛素分泌，降低血糖水平，同时提高了畜禽屠宰加工产业副产物的综合利用水平。
[0018]
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
[0019]
图1是本发明一个实施例制备的胶原基dpp-iv抑制肽实物图。
具体实施方式
[0020]
下面结合实施例和附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
[0021]
应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
[0022]
需要说明的是，下述实施方案中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
[0023]
实施例1
[0024]
(1)胶原蛋白提取：去除毛发的牛皮经清水洗净后，切成约0.4
×
0.6cm2的小块。取一定质量预处理好的牛皮加入到0.5mol/l的乙酸中，料液比1：10。超声处理后在4℃下溶胀10h。超声处理的条件为400w，30min。溶涨后高速组织捣碎机间隙匀浆，转速为12000r/min。称取一定质量的匀浆液，按料液比为1：20加入0.5mol/l乙酸，调节ph≈1.6，加入占底物质量3％的胃蛋白酶缓慢搅拌提取10h，离心(8000r/min，20min)。上清液中缓慢加入nacl固体，并不断搅拌使其盐析，析出絮状沉淀(nacl的最终浓度为0.8～1mol/l)。静置分层8～12h，然后离心(6000r/min，30min)，收集絮状物。用0.5mol/l的乙酸复溶絮状物，置于0.1mol/l的乙酸溶液中透析24h，然后用蒸馏水透析2.5d，冷冻干燥备用。
[0025]
(2)疏敏性胶原蛋白的修饰：用乙酸复溶2g冻干胶原蛋白至浓度为10mg/ml，在25℃下磁力搅拌器搅拌30min。将离子液体([emim][ac])按照离子液体体积与冻干胶原蛋白质量比4:10加入乙酸复溶的胶原蛋白溶液中，在25～37℃下采用梯度升温结合平板翻转振荡法搅拌2h。具体包括一次升温至25℃维持30min，二次升温至30℃维持30min，三次升温至37℃维持60min。修饰后的胶原蛋白溶液在50℃旋转蒸发至50ml，然后加入4倍体积的无水乙醇，混合均匀后静置1h，4500rpm离心10min，循环操作5次，直至离心上清液中用folin-phenol试剂检测不到离子液体。脱除离子液体后的胶原蛋白样品进行冷冻干燥，贮藏于阴凉干燥处备用。
[0026]
对比例1
[0027]
(1)胶原蛋白提取：去除毛发的牛皮经清水洗净后，切成约0.4
×
0.6cm2的小块。取一定质量预处理好的牛皮加入到0.5mol/l的乙酸中，料液比1：10。超声处理后在4℃下溶胀10h。超声处理的条件为400w，30min。溶涨后高速组织捣碎机间隙匀浆，转速为12000r/min。称取一定质量的匀浆液，按料液比为1：20加入0.5mol/l乙酸，调节ph≈1.6，加入占底物质量3％的胃蛋白酶缓慢搅拌提取10h，离心(8000r/min，20min)。上清液中缓慢加入nacl固体，并不断搅拌使其盐析，析出絮状沉淀(nacl的最终浓度为0.8～1mol/l)。静置分层8～12h，然后离心(6000r/min，30min)，收集絮状物。用0.5mol/l的乙酸复溶絮状物，置于0.1mol/l的乙酸溶液中透析24h，然后用蒸馏水透析2.5d，冷冻干燥备用。
[0028]
(2)疏敏性胶原蛋白的修饰：用乙酸复溶2g冻干胶原蛋白至浓度为10mg/ml，在25℃下磁力搅拌器搅拌30min。将离子液体([bmim][bf6])按照离子液体体积与冻干胶原蛋白质量比4:10将离子液体以4/10(v/w)加入乙酸复溶的胶原蛋白溶液中，在25～37℃下采用梯度升温结合平板翻转振荡法搅拌2h。具体包括一次升温至25℃维持30min，二次升温至30℃维持30min，三次升温至37℃维持60min。修饰后的胶原蛋白溶液在50℃旋转蒸发至50ml，然后加入4倍体积的无水乙醇，混合均匀后静置1h，4500rpm离心10min，循环操作5次，直至离心上清液中用folin-phenol试剂检测不到离子液体。脱除离子液体后的胶原蛋白样品进行冷冻干燥，贮藏于阴凉干燥处备用。
[0029]
对比例2
[0030]
(1)胶原蛋白提取：去除毛发的牛皮经清水洗净后，切成约0.4
×
0.6cm2的小块。取一定质量预处理好的牛皮加入到0.5mol/l的乙酸中，料液比1：10。超声处理后在4℃下溶胀10h。超声处理的条件为400w，30min。溶涨后高速组织捣碎机间隙匀浆，转速为12000r/min。称取一定质量的匀浆液，按料液比为1：20加入0.5mol/l乙酸，调节ph≈1.6，加入占底物质量3％的胃蛋白酶缓慢搅拌提取10h，离心(8000r/min，20min)。上清液中缓慢加入nacl固
体，并不断搅拌使其盐析，析出絮状沉淀(nacl的最终浓度为0.8～1mol/l)。静置分层8～12h，然后离心(6000r/min，30min)，收集絮状物。用0.5mol/l的乙酸复溶絮状物，置于0.1mol/l的乙酸溶液中透析24h，然后用蒸馏水透析2.5d，冷冻干燥备用。
[0031]
(2)疏敏性胶原蛋白的修饰：用乙酸复溶2g冻干胶原蛋白至浓度为10mg/ml，在25℃下磁力搅拌器搅拌30min。将离子液体([bdmim][cl])按照离子液体体积与冻干胶原蛋白质量比4:10加入乙酸复溶的胶原蛋白溶液中，在25～37℃下采用梯度升温结合平板翻转振荡法搅拌2h。具体包括一次升温至25℃维持30min，二次升温至30℃维持30min，三次升温至37℃维持60min。修饰后的胶原蛋白溶液在50℃旋转蒸发至50ml，然后加入4倍体积的无水乙醇，混合均匀后静置1h，4500rpm离心10min，循环操作5次，直至离心上清液中用folin-phenol试剂检测不到离子液体。脱除离子液体后的胶原蛋白样品进行冷冻干燥，贮藏于阴凉干燥处备用。
[0032]
对比例3
[0033]
(1)胶原蛋白提取：去除毛发的牛皮经清水洗净后，切成约0.4
×
0.6cm2的小块。取一定质量预处理好的牛皮加入到0.5mol/l的乙酸中，料液比1：10。超声处理后在4℃下溶胀10h。超声处理的条件为400w，30min。溶涨后高速组织捣碎机间隙匀浆，转速为12000r/min。称取一定质量的匀浆液，按料液比为1：20加入0.5mol/l乙酸，调节ph≈1.6，加入占底物质量3％的胃蛋白酶缓慢搅拌提取10h，离心(8000r/min，20min)。上清液中缓慢加入nacl固体，并不断搅拌使其盐析，析出絮状沉淀(nacl的最终浓度为0.8～1mol/l)。静置分层8～12h，然后离心(6000r/min，30min)，收集絮状物。用0.5mol/l的乙酸复溶絮状物，置于0.1mol/l的乙酸溶液中透析24h，然后用蒸馏水透析2.5d，冷冻干燥备用。
[0034]
(2)疏敏性胶原蛋白的修饰：用乙酸复溶2g冻干胶原蛋白至浓度为10mg/ml，在25℃下磁力搅拌器搅拌30min。将离子液体([bmim][bf4])按照离子液体体积与冻干胶原蛋白质量比4:10加入乙酸复溶的胶原蛋白溶液中，在25～37℃下采用梯度升温结合平板翻转振荡法搅拌2h。具体包括一次升温至25℃维持30min，二次升温至30℃维持30min，三次升温至37℃维持60min。修饰后的胶原蛋白溶液在50℃旋转蒸发至50ml，然后加入4倍体积的无水乙醇，混合均匀后静置1h，4500rpm离心10min，循环操作5次，直至离心上清液中用folin-phenol试剂检测不到离子液体。脱除离子液体后的胶原蛋白样品进行冷冻干燥，贮藏于阴凉干燥处备用。
[0035]
对比例4
[0036]
(1)胶原蛋白提取：去除毛发的牛皮经清水洗净后，切成约0.4
×
0.6cm2的小块。取一定质量预处理好的牛皮加入到0.5mol/l的乙酸中，料液比1：10。超声处理后在4℃下溶胀10h。超声处理的条件为400w，30min。溶涨后高速组织捣碎机间隙匀浆，转速为12000r/min。称取一定质量的匀浆液，按料液比为1：20加入0.5mol/l乙酸，调节ph≈1.6，加入占底物质量3％的胃蛋白酶缓慢搅拌提取10h，离心(8000r/min，20min)。上清液中缓慢加入nacl固体，并不断搅拌使其盐析，析出絮状沉淀(nacl的最终浓度为0.8～1mol/l)。静置分层8～12h，然后离心(6000r/min，30min)，收集絮状物。用0.5mol/l的乙酸复溶絮状物，置于0.1mol/l的乙酸溶液中透析24h，然后用蒸馏水透析2.5d，冷冻干燥备用。
[0037]
(2)疏敏性胶原蛋白的修饰：用乙酸复溶2g冻干胶原蛋白至浓度为10mg/ml，在25℃下磁力搅拌器搅拌30min。将离子液体([emim][ac])按照离子液体体积与冻干胶原蛋白
质量比1:10加入乙酸复溶的胶原蛋白溶液中，在25～37℃下采用梯度升温结合平板翻转振荡法搅拌2h。具体包括一次升温至25℃维持30min，二次升温至30℃维持30min，三次升温至37℃维持60min。修饰后的胶原蛋白溶液在50℃旋转蒸发至50ml，然后加入4倍体积的无水乙醇，混合均匀后静置1h，4500rpm离心10min，循环操作5次，直至离心上清液中用folin-phenol试剂检测不到离子液体。脱除离子液体后的胶原蛋白样品进行冷冻干燥，贮藏于阴凉干燥处备用。
[0038]
对比例5
[0039]
(1)胶原蛋白提取：去除毛发的牛皮经清水洗净后，切成约0.4
×
0.6cm2的小块。取一定质量预处理好的牛皮加入到0.5mol/l的乙酸中，料液比1：10。超声处理后在4℃下溶胀10h。超声处理的条件为400w，30min。溶涨后高速组织捣碎机间隙匀浆，转速为12000r/min。称取一定质量的匀浆液，按料液比为1：20加入0.5mol/l乙酸，调节ph≈1.6，加入占底物质量3％的胃蛋白酶缓慢搅拌提取10h，离心(8000r/min，20min)。上清液中缓慢加入nacl固体，并不断搅拌使其盐析，析出絮状沉淀(nacl的最终浓度为0.8～1mol/l)。静置分层8～12h，然后离心(6000r/min，30min)，收集絮状物。用0.5mol/l的乙酸复溶絮状物，置于0.1mol/l的乙酸溶液中透析24h，然后用蒸馏水透析2.5d，冷冻干燥备用。
[0040]
(2)疏敏性胶原蛋白的修饰：用乙酸复溶2g冻干胶原蛋白至浓度为10mg/ml，在25℃下磁力搅拌器搅拌30min。将离子液体([emim][ac])按照离子液体体积与冻干胶原蛋白质量比7:10加入乙酸复溶的胶原蛋白溶液中，在25～37℃下采用梯度升温结合平板翻转振荡法搅拌2h。具体包括一次升温至25℃维持30min，二次升温至30℃维持30min，三次升温至37℃维持60min。修饰后的胶原蛋白溶液在50℃旋转蒸发至50ml，然后加入4倍体积的无水乙醇，混合均匀后静置1h，4500rpm离心10min，循环操作5次，直至离心上清液中用folin-phenol试剂检测不到离子液体。脱除离子液体后的胶原蛋白样品进行冷冻干燥，贮藏于阴凉干燥处备用。
[0041]
对比例6
[0042]
(1)胶原蛋白提取：去除毛发的牛皮经清水洗净后，切成约0.4
×
0.6cm2的小块。取一定质量预处理好的牛皮加入到0.5mol/l的乙酸中，料液比1：10。超声处理后在4℃下溶胀10h。超声处理的条件为400w，30min。溶涨后高速组织捣碎机间隙匀浆，转速为12000r/min。称取一定质量的匀浆液，按料液比为1：20加入0.5mol/l乙酸，调节ph≈1.6，加入占底物质量3％的胃蛋白酶缓慢搅拌提取10h，离心(8000r/min，20min)。上清液中缓慢加入nacl固体，并不断搅拌使其盐析，析出絮状沉淀(nacl的最终浓度为0.8～1mol/l)。静置分层8～12h，然后离心(6000r/min，30min)，收集絮状物。用0.5mol/l的乙酸复溶絮状物，置于0.1mol/l的乙酸溶液中透析24h，然后用蒸馏水透析2.5d，冷冻干燥备用。
[0043]
(2)疏敏性胶原蛋白的修饰：用乙酸复溶2g冻干胶原蛋白至浓度为10mg/ml，在25℃下磁力搅拌器搅拌30min。将离子液体([emim][ac])按照离子液体体积与冻干胶原蛋白质量比4:10加入乙酸复溶的胶原蛋白溶液中，在25～37℃下采用梯度升温结合平板翻转振荡法搅拌2h。具体包括一次升温至25℃维持60min，二次升温至30℃维持30min，三次升温至37℃维持30min。修饰后的胶原蛋白溶液在50℃旋转蒸发至50ml，然后加入4倍体积的无水乙醇，混合均匀后静置1h，4500rpm离心10min，循环操作5次，直至离心上清液中用folin-phenol试剂检测不到离子液体。脱除离子液体后的胶原蛋白样品进行冷冻干燥，贮藏于阴
凉干燥处备用。
[0044]
对比例7
[0045]
(1)胶原蛋白提取：去除毛发的牛皮经清水洗净后，切成约0.4
×
0.6cm2的小块。取一定质量预处理好的牛皮加入到0.5mol/l的乙酸中，料液比1：10。超声处理后在4℃下溶胀10h。超声处理的条件为400w，30min。溶涨后高速组织捣碎机间隙匀浆，转速为12000r/min。称取一定质量的匀浆液，按料液比为1：20加入0.5mol/l乙酸，调节ph≈1.6，加入占底物质量3％的胃蛋白酶缓慢搅拌提取10h，离心(8000r/min，20min)。上清液中缓慢加入nacl固体，并不断搅拌使其盐析，析出絮状沉淀(nacl的最终浓度为0.8～1mol/l)。静置分层8～12h，然后离心(6000r/min，30min)，收集絮状物。用0.5mol/l的乙酸复溶絮状物，置于0.1mol/l的乙酸溶液中透析24h，然后用蒸馏水透析2.5d，冷冻干燥备用。
[0046]
(2)疏敏性胶原蛋白的修饰：用乙酸复溶2g冻干胶原蛋白至浓度为10mg/ml，在25℃下磁力搅拌器搅拌30min。将离子液体([emim][ac])按照离子液体体积与冻干胶原蛋白质量比4:10加入乙酸复溶的胶原蛋白溶液中，在25～37℃下采用梯度升温结合平板翻转振荡法搅拌2h。具体包括一次升温至25℃维持30min，二次升温至30℃维持60min，三次升温至37℃维持30min。修饰后的胶原蛋白溶液在50℃旋转蒸发至50ml，然后加入4倍体积的无水乙醇，混合均匀后静置1h，4500rpm离心10min，循环操作5次，直至离心上清液中用folin-phenol试剂检测不到离子液体。脱除离子液体后的胶原蛋白样品进行冷冻干燥，贮藏于阴凉干燥处备用。
[0047]
本发明实施例1将提取的牛皮胶原蛋白采用离子液体([emim][ac])处理，添加量为4/10(离子液体/胶原蛋白，v/w)，梯度升温结合平板翻转振荡法搅拌2h，具体包括一次升温至25℃维持30min，二次升温至30℃维持30min，三次升温至37℃维持60min，制备疏敏性胶原蛋白；对比例1～3分别为采用([bmim][bf6])，([bdmim][cl])和([bmim][bf4])处理胶原蛋白，其它步骤同实施例1，制备疏敏性胶原蛋白。对比例4～5，离子液体的添加量分别为1/10和7/10(离子液体/胶原蛋白，v/w)，其它步骤同实施例1，制备疏敏性胶原蛋白。对比例6～7，梯度升温结合平板翻转振荡法搅拌2h，具体包括一次升温至25℃分别维持30min和60min，二次升温至30℃分别维持60min和30min，三次升温至37℃分别维持30min和30min，其它步骤同实施例1，制备疏敏性胶原蛋白。
[0048]
《表面疏水性》
[0049]
对实施例1和对比例1～7的疏敏性胶原蛋白样品进行表面疏水性测定。将离子液体处理的胶原蛋白用0.5mol/l乙酸配置制成1.0mg/ml胶原蛋白溶液，并稀释至不同的浓度(1mg/ml、0.5mg/ml和0.25mg/ml)。采用1-苯胺基萘-8-磺酸(ans)荧光反应，计算表面疏水性指数。
[0050]
表1疏敏性胶原蛋白表面疏水性测定结果
[0051][0052]
由表1可知，四种离子液体中，[emim][ac]可明显提高胶原蛋白的表面疏水性。结合本发明限定的平板翻转振荡法搅拌后，胶原蛋白的表面疏水基团暴露明显加强。
[0053]
实施例2
[0054]
(1)超声波二次修饰疏敏性胶原蛋白：采用实施例1制备的疏敏性胶原蛋白，用乙酸复溶2g至浓度为10mg/ml，在25℃下磁力搅拌器搅拌30min。使用超声波交替处理胶原蛋白液，超声功率为400w，超声时间为20min，处理模式为运行2秒，间歇2秒交替进行。处理后胶原蛋白冷冻干燥，真空包装，贮藏于阴凉干燥处备用。
[0055]
(2)胶原基dpp-iv抑制肽的制备：将超声波二次修饰后的胶原蛋白用去离子水复溶至浓度为7mg/ml，加入超声波二次修饰后的胶原蛋白质量的4％的木瓜蛋白酶，控制酶解ph为7，酶解温度为50℃，酶解时间为4h。将水解物采用超滤离心管分级，截留分子量为1kda和3kda，离心力为6000g，离心时间为20min。不同分子量的胶原水解物冷冻干燥，置于阴凉干燥处备用。
[0056]
对比例8
[0057]
(1)超声波处理胶原蛋白：冻干的牛皮胶原蛋白，未进行疏敏性离子液体处理，用乙酸复溶2g至浓度为10mg/ml，在25℃下磁力搅拌器搅拌30min。使用超声波交替处理胶原蛋白液，超声功率为400w，超声时间为20min，处理模式为运行2秒，间歇2秒交替进行。处理后胶原蛋白冷冻干燥，真空包装，贮藏于阴凉干燥处备用。
[0058]
(2)胶原基dpp-iv抑制肽的制备：将超声波处理后的胶原蛋白用去离子水复溶至浓度为7mg/ml，加入超声波二次修饰后的胶原蛋白质量的4％的木瓜蛋白酶，控制酶解ph为7，酶解温度为50℃，酶解时间为4h。将水解物采用超滤离心管分级，截留分子量为1kda和3kda，离心力为6000g，离心时间为20min。不同分子量的胶原水解物冷冻干燥，置于阴凉干燥处备用。
[0059]
对比例9
[0060]
(1)胶原基dpp-iv抑制肽的制备：采用实施例1制备的疏敏性胶原蛋白，不进行超声波二次展开，直接用去离子水复溶至浓度为7mg/ml，加入疏敏性胶原蛋白质量的4％的木瓜蛋白酶，控制酶解ph为7，酶解温度为50℃，酶解时间为4h。将水解物采用超滤离心管分级，截留分子量为1kda和3kda，离心力为6000g，离心时间为20min。不同分子量的胶原水解物冷冻干燥，置于阴凉干燥处备用。
[0061]
对比例10
[0062]
(1)胶原基dpp-iv抑制肽的制备：将牛皮胶原蛋白直接用去离子水复溶至浓度为7mg/ml，加入牛皮胶原蛋白质量的4％的木瓜蛋白酶，控制酶解ph为7，酶解温度为50℃，酶解时间为4h。将水解物采用超滤离心管分级，截留分子量为1kda和3kda，离心力为6000g，离心时间为20min。不同分子量的胶原水解物冷冻干燥，置于阴凉干燥处备用。
[0063]
本发明实施例2将提取的牛皮胶原蛋白经疏敏性离子液体修饰后，再采用超声波二次展开，结合木瓜蛋白酶制备dpp-iv抑制肽；对比例8提取的牛皮胶原蛋白仅进行超声波处理，结合木瓜蛋白酶制备dpp-iv抑制肽；对比例9提取的牛皮胶原蛋白仅进行疏敏性离子液体修饰，结合木瓜蛋白酶制备dpp-iv抑制肽；对比例10提取的牛皮胶原蛋白，未进行结构修饰直接采用木瓜蛋白酶制备dpp-iv抑制肽。
[0064]
《水解度》
[0065]
对实施例2和对比例8～10的胶原基dpp-iv抑制肽样品进行水解度测定。将实施例2及对比例8～10的胶原水解物用蒸馏水复溶后，转移到试管中与opa试剂反应，并在340nm下测量吸光度，根据公式(1)计算水解度。
[0066][0067]
式中a1和a2分别为胶原蛋白水解物和未水解的胶原蛋白在340nm处的吸光度。m是蛋白质的摩尔质量(da)，d是稀释因子。ε是opa在340nm(6000m-1cm-1)处的摩尔消光系数，c是蛋白质浓度，n是每个蛋白质分子的肽键总数。
[0068]
《dpp-iv抑制率》
[0069]
通过dpp-iv抑制率测定来评价对本发明实施例2及对比例8～10胶原水解物的降糖效果。将本发明实施例2及对比例8～10的胶原蛋白水解物(0.5mg/ml)与底物(gly-pro-pna)混合，37℃下孵育后加入dpp-iv酶液，测定在405nm处的吸光度，根据公式(2)计算dpp-iv抑制率。
[0070][0071]
式中s1和s2分别为胶原蛋白水解物和100mm ph 8.0tris-hcl反应溶液随时间变化吸光度变化斜率。
[0072]
《氨基酸含量》
[0073]
胶原水解物氨基酸组成与其功能密切相关，疏水性氨基酸易与dpp-iv酶活性位点结合，抑制其活性。将实施例2及对比例8～10胶原水解物加入6m的盐酸在110℃条件下水解24h，超纯水定容至50ml后取1ml溶液脱酸至干燥后加入1ml样品缓冲液，溶液经0.22μm滤膜过滤后装入液相小瓶中上机测定氨基酸含量。
[0074]
《分子量分布》
[0075]
实施例2及对比例8～10胶原水解物的分子量分布采用配备有紫外检测器的依利特eclassical 3100型高效液相色谱，使用tskgel2000 swxl型凝胶色谱柱(300mm
×
7.8mm)，以乙腈∶水∶三氟乙酸(体积比为45∶55∶0.1)作为流动相，在进样量10μl，流速0.6ml/min，柱温37℃的条件下，于波长220nm处测定吸光度。使用细胞色素c(12 362da)、抑肽酶(6 511.4da)、杆菌肽(1 423da)、亮抑酶肽(475.59da)、丙谷二肽(146.145da)作为标准品，以分子量对数(lg mw)为纵坐标，以样品保留时间为横坐标建立标准曲线，计算样品分子量分布。
[0076]
(1)胶原基dpp-iv抑制肽水解度和dpp-iv抑制活性结果
[0077]
表2胶原基dpp-iv抑制肽水解度和dpp-iv抑制活性结果
[0078][0079]
水解度是评估蛋白水解效率的重要表征，通过水解度的测量对本发明实施例2及
对比例8～10水解程度进行观察。由表2可知，对比例10胶原蛋白的水解度为14.3％，对比例8的胶原蛋白的水解度为17.6％，说明超声处理后促进了胶原蛋白的水解。实施例2的水解度显著高于对比例8～10。通过对比，疏敏性离子液体耦合超声波处理提高了胶原蛋白酶解过程中肽键的断裂程度，说明疏敏性离子液体耦合超声波处理胶原蛋白可促进其水解，结合预处理方法是成功的。
[0080]
实施例2不同分子量胶原水解物的dpp-iv抑制率均明显高于对比例8～10，说明疏敏性离子液体耦合超声波处理可提高胶原水解物的降糖能力。通过对比，疏敏性离子液体耦合超声波处理可实现dpp-iv抑制率的改善。
[0081]
表3胶原基dpp-iv抑制肽氨基酸含量
[0082][0083][0084]
胶原水解物氨基酸组成与其功能密切相关，疏水性氨基酸易与dpp-iv酶活性位点结合，抑制其活性。由表3可知，实施例2的疏水性氨基酸含量明显高于对比例8～10，说明疏敏性离子液体耦合超声波处理后增加了木瓜蛋白酶对胶原蛋白疏水性残基的切割。通过对
比，采用疏敏性离子液体耦合超声波处理胶原蛋白促进dpp-iv相关肽片段的释放是可靠的。
[0085]
表4胶原基dpp-iv抑制肽分子量分布
[0086][0087]
小分子量胶原水解物的dpp-iv抑制能力更强，由表4可知，对比例8的胶原水解物分子量分布主要集中于小于5kda，对比例10的胶原水解物分子量分布与对比例8的差异不明显，对比例9和实施例2mw《1kda的水解物的含量明显增加，尤其是实施例2，说明疏敏性离子液体耦合超声波处理促进小分子量水解物的生成，通过将超声波和离子液体相结合增加胶原的水解进程是可靠的。
[0088]
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。