鱿鱼环齿蛋白重组力学功能蛋白的制备方法及应用

本发明属于生物工程和发酵工程领域，更具体地，本发明涉及鱿鱼环齿蛋白重组力学功能蛋白的制备方法及应用。

背景技术：

1、鱿鱼环齿(squid ring teeth，srt)蛋白拥有优良的物理化学性质，如弹性、高机械强度、柔韧性、导电导热性等，这种蛋白质可用来制造植入式传感器、生物降解塑料、自我修复织物等。但一只成年鱿鱼可提取的鱿鱼环齿蛋白质仅有100mg左右。

2、鱿鱼环齿蛋白可从鱿鱼触手吸盘中提取得到，具有高度重复的模块化结构，每个重复模块均包含晶体结构域和非晶体的无定型结构域。晶体结构域含有较多丙氨酸，最终堆叠形成β-sheets结构；无定形部分富含甘氨酸和酪氨酸，最终形成不规则的柔性结构。

3、基于鱿鱼环齿蛋白的重组蛋白的设计和构建不仅有利于重组表达的过程，同时可以整合不同蛋白的结构和功能。利用基因工程的方法可以将类弹性蛋白和鱿鱼环齿蛋白的特征序列连接形成一种新型的重组力学功能蛋白，命名为类弹性蛋白-鱿鱼环齿蛋白(srt-elp)重组蛋白，根据类弹性蛋白的重复拷贝数的不同，可以形成例如srt-elp 12聚体的重组蛋白、srt-elp 24聚体的重组蛋白、srt-elp 36聚体的重组蛋白等(srt-elp36)。

4、srt-elp重组蛋白(例如srt-elp36蛋白)，不仅具有类弹性蛋白的生物相容性等特点，还具备了鱿鱼环齿蛋白弹性、高机械强度等物理化学性质。本领域亟待规模化高效地获得此类重组蛋白，以应用于植入式传感器、生物降解塑料、自我修复织物等领域。

5、但是，srt-elp36蛋白由于为融合串联结构，其氨基酸序列较长、基因序列长、分子量大(192kd)，高效表达存在困难，结构不易伸展，使得其重组表达/高效表达非常困难。本领域目前尚缺乏成功且高效表达该蛋白的先例。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种鱿鱼环齿蛋白重组力学功能蛋白的制备方法及应用。

2、在本发明的第一方面，提供一种提高鱿鱼环齿蛋白-力学功能蛋白在生物合成中的产量的方法，其特征在于，所述方法包括：利用重组大肠杆菌，以iptg诱导重组表达鱿鱼环齿蛋白-力学功能蛋白；所述重组大肠杆菌的胞内包含所述鱿鱼环齿蛋白-力学功能蛋白的表达盒。

3、在一种或多种实施方式中，发酵过程中，首先进行基础培养，待碳源耗尽后起始补糖：在起始补糖至以iptg诱导前的阶段中，调控重组大肠杆菌的比生长速率在0.35～0.85h-1；在iptg诱导之后的阶段，调控比生长速率在0.15～0.36h-1。

4、在一种或多种实施方式中，所述补糖为流加葡萄糖溶液。例如，补加650±100g/l的葡萄糖溶液；较佳地，补加650±50g/l的葡萄糖溶液；，补加650±30g/l的葡萄糖溶液。

5、在一种或多种实施方式中，所述的发酵为≥50l、≥100l、≥200l、≥500l或更大的规模。

6、在一种或多种实施方式中，在起始补糖至以iptg诱导的阶段中，调控重组大肠杆菌的比生长速率在0.45～0.78h-1；在iptg诱导之后的阶段，调控比生长速率在0.16～0.25h-1。

7、在一种或多种实施方式中，以在线活细胞电容值为指标，反馈调控供氧和补糖速率，进而调控比生长速率；较佳地，应用活细胞传感仪测得电容值，以之表征活细胞的浓度，基于此计算比生长速率。

8、在一种或多种实施方式中，所述比生长速率μour如下计算：

9、

10、其中，

11、x＝a·cap             公式1；

12、cap为电容值；较佳地，该电容值由活细胞传感仪测定获得。

13、在一种或多种实施方式中，电容值和菌浓呈现的是正比关系，a作为关系系数，在进行比生长速率的计算时可以约去。

14、在一种或多种实施方式中，发酵起始后6.5±1.5小时，较佳地发酵起始后6.5±1小时，更佳地发酵起始后6.5±0.5小时，进行iptg诱导。

15、在一种或多种实施方式中，在iptg诱导之后的1.5～2.5小时，维持比氧消耗速率qo2水平调节30～50mmol/l/h/cap；较佳地35～45mmol/l/h/cap。

16、在一种或多种实施方式中，所述比氧消耗速率qo2如下计算：

17、qo2＝our/x             公式4；

18、其中，

19、x＝a·cap             公式1；

20、cap为电容值；较佳地，该电容值由活细胞传感仪测定获得。

21、在一种或多种实施方式中，所述碳源为葡萄糖，其在基础培养时浓度为6.5±2g/l；较佳地6.5±1g/l；更佳地6.5±0.5g/l。

22、在一种或多种实施方式中，所述基础培养时，培养基含有13g/l蛋白胨，0.05g/l无水氯化钙，2.5g/l七水硫酸镁，6.67g/l磷酸二氢钾，3.25g/l一水合柠檬酸，6.5g/l葡萄糖；各个组分可上下浮动30％，较佳地浮动20％(更佳地浮动10％或5％)。

23、在一种或多种实施方式中，所述待碳源耗尽后起始补糖包括在培养起始后2～6小时(如3～4小时或3～5小时；更具体如2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5小时)进行补糖。

24、在一种或多种实施方式中，在基础培养时，初始转速为240±40rpm(较佳地240±30rpm，更佳地240±20rpm或240±10rpm)，设置溶氧和转速联动控制、每隔10±3秒(较佳地10±2秒，更佳地10±1秒)进行一次关联，其中溶氧不低于25％。

25、在一种或多种实施方式中，在基础培养时，通气流量0.8±0.1vvm，罐压≤0.05mpa。

26、在一种或多种实施方式中，培养过程中，温度37±1℃(较佳地37±0.5℃)，ph 6.9±0.1(较佳地ph 6.9±0.05)。

27、在本发明的另一方面，提供一种在生物发酵过程中进行在线控制的方法，所述方法包括：在发酵液中接种细胞(如重组细胞或天然细胞)，进行生物发酵；其中，以在线活细胞电容值为指标，反馈调控供氧和补糖速率，进而调控所述细胞的比生长速率；较佳地，应用活细胞传感仪测得电容值，以之表征活细胞的浓度，基于此计算比生长速率。

28、在一种或多种实施方式中，所述比生长速率μour如下计算：

29、

30、其中，

31、x＝a·cap             公式1；

32、cap为电容值；和/或

33、所述比氧消耗速率qo2如下计算：

34、qo2＝our/x             公式4；

35、其中，

36、x＝a·cap             公式1。

37、本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。