双金属位点纳米酶及其制备方法和应用

1.本发明涉及流感病毒防控技术领域，特别是涉及一种双金属位点纳米酶及其制备方法和应用。


背景技术：

2.病毒引发的传染性疾病严重威胁人类健康，不仅造成大量感染和死亡，并严重扰乱了人类正常生活和社会经济活动的运转；流感病毒虽然危害相对较小，但也具有非常强的传染性，并且有潜在的禽流感突变为高危致病亚型的可能性，因此同样严重威胁人类健康。目前针对病毒感染有效的治疗药物较少，疫苗接种是药物防控病毒的重要手段，但是由于病毒亚型众多，变异速度快，导致疫苗免疫频频失败；因而采取环境消毒、阻断传播等综合性的生物安全防控措施更为有效。


技术实现要素：

3.基于此，有必要提供一种能够阻断病毒传播的双金属位点纳米酶及其制备方法和应用。
4.一实施例提供的一种双金属位点纳米酶，其活性中心包括两个金属原子，两个所述金属原子之间的距离为
5.在一些实施例中，两个所述金属原子包括过渡金属原子和/或贵金属原子中的一种或两种。
6.在一些实施例中，两个所述金属原子包括mg、mn、fe、co、ni、cu和 zn中的一种或两种。
7.在一些实施例中，所述双金属位点纳米酶为立方体结构；
8.可选地，所述立体结构的长度为40～100nm，所述立体结构的宽度为40～100 nm，所述立体结构的高度为40～100nm。
9.在一些实施例中，两个所述金属原子占所述双金属位点纳米酶的质量百分比为0.4～1.2％。
10.在一些实施例中，所述双金属位点纳米酶中还包括碳原子、氮原子和氧原子，所述碳原子与所述氮原子形成碳氮纳米材料，各所述金属原子分别与两个所述氮原子和两个所述氧原子形成配位键。
11.在一些实施例中，所述氮原子和所述氧原子的总数量为4～10个，所述氮原子和所述氧原子的数量比为2:(2～3)。
12.一实施例提供的双金属位点纳米酶的制备方法，包括如下步骤：
13.将双核配合物包覆于mofs材料内，在惰性气氛下进行热解。
14.在一些实施例中，所述双核配合物的结构为：
15.mm'l
·
xn16.其中，m、m’表示金属原子；l表示位于金属原子周围的配体，x表示用于平衡整体电
荷的抗衡离子，n表示使配合物整体呈电中性所需要的抗衡离子的数目。
17.在一些实施例中，所述配体包括的配位原子的数量为6～12个，所述配位原子包括碳、氮、氧、磷和硫中的一种或多种，所述配体中的结构单元包括卡宾、吡啶、吡咯、氨基、席夫碱、羟基、羧基和羰基中的一种或多种。
18.在一些实施例中，所述mofs材料包括zif-8和zif-67中的一种或多种；和/或所述惰性气体包括氮气和氩气中的一种或多种。
19.在一些实施例中，进行热解时，包括如下条件中的至少一项：
20.(1)热解温度为300～1000℃；
21.(2)热解时间为0.5～4h。
22.一实施例提供的上述的双金属位点纳米酶在消杀含有囊膜类病毒中的应用。
23.在一些实施例中，所述含有囊膜类病毒包括流感病毒。
24.一实施例提供的上述的双金属位点纳米酶在制备空气净化系统中的应用。
25.上述的双金属位点纳米酶及其制备方法和应用，该双金属位点纳米酶的活性中心包括两个金属原子，以两个金属原子为活性中心的双金属位点纳米酶能够发挥脂质氧化酶活性破坏流感病毒的囊膜结构从而发挥抗病毒活性，并且在低温条件下其抗病毒活性不受影响；双金属位点纳米酶发挥脂质氧化酶活性，其抗病毒的机理不受病毒突变的影响，因而能够有效阻断流感病毒的传播。
附图说明
26.图1为一实施例提供的fe2onc纳米酶的形貌图；
27.图2为一实施例提供的pd2onc纳米酶的形貌图；
28.图3为一实施例提供的co2onc纳米酶的形貌图；
29.图4为一实施例提供的fe2onc纳米酶类氧化酶活性测试结果；
30.图5为一实施例提供的其它双金属位点纳米酶类氧化酶活性测试结果；
31.图6为一实施例提供的fe2onc纳米酶类过氧化物酶活性测试结果；
32.图7为一实施例提供的其它双金属位点纳米酶类过氧化物酶活性测试结果；
33.图8为一实施例提供的fe2onc纳米酶抗流感病毒活性的评价结果示意图；
34.图9为一实施例提供的fe2onc纳米酶抗流感病毒活性稳定性的评价结果示意图；
35.图10为一实施例提供的fe2onc纳米酶的脂质氧化酶活性测定示意图；
36.图11为一实施例提供的tem观察fe2onc纳米酶对病毒结构影响示意图；
37.图12为一实施例提供的fe2onc纳米酶应用于空气净化系统的测试结果示意图。
具体实施方式
38.为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
39.除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具
体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
40.可以理解的是，本文中，以开放式描述的技术特征中，包括所列举特征组成的封闭式技术方案，也包括包含所列举特征的开放式技术方案。
41.本文中，涉及到数值区间，如无特别说明，上述数值区间内视为连续，且包括该范围的最小值及最大值，以及这种最小值与最大值之间的每一个值。进一步地，当范围是指整数时，包括该范围的最小值与最大值之间的每一个整数。此外，当提供多个范围描述特征或特性时，可以合并该范围。换言之，除非另有指明，否则本文中所公开之所有范围应理解为包括其中所归入的任何及所有的子范围。
42.本文中的温度参数，如无特别限定，既允许为恒温处理，也允许在一定温度区间内进行处理。所述的恒温处理允许温度在仪器控制的精度范围内进行波动。
43.在本文中，涉及数据范围的单位，如果仅在右端点后带有单位，则表示左端点和右端点的单位是相同的。比如，40～100nm表示左端点“40”和右端点“100”的单位都是nm。
44.本文所使用的术语“和/或”、“或/和”、“及/或”的可选范围包括两个或两个以上相关所列项目中任一个项目，也包括相关所列项目的任意的和所有的组合，所述任意的和所有的组合包括任意的两个相关所列项目、任意的更多个相关所列项目、或者全部相关所列项目的组合。
45.流行性感冒简称流感(influenza)，是由流感病毒(influenza virus)引起的一种急性呼吸道人畜共患传染病。流感病毒可分为a型、b型和c型流感病毒，其中a型流感病毒对人类的威胁最大。
46.流感病毒的结构由内到外包括核酸、基质蛋白和包膜三部分，其中包膜中除了含有磷脂分子外，还具有两种重要的糖蛋白，即血凝素和神经氨酸酶，分别负责病毒的入侵和释放；流感病毒主要通过呼吸道传播，传播速度快，致病性强严重威胁着人类的生命健康。
47.目前疫苗接种是防控流感病毒的重要手段，但是由于流感病毒亚型众多，变异速度快，导致疫苗免疫频频失败；因而采取环境消毒、阻断传播等综合性的生物安全防控措施更为有效，特别是提高对公共环境中的空气净化效率对流感病毒的防控具有重要意义。
48.一实施例提供的双金属位点纳米酶，其活性中心可以包括两个金属原子，两个所述金属原子之间的距离可以为
49.以两个金属原子为活性中心的双金属位点纳米酶能够发挥脂质氧化酶活性破坏流感病毒的囊膜结构从而发挥抗病毒活性，并且在低温条件下其抗病毒活性不受影响；双金属位点纳米酶发挥脂质氧化酶活性，其抗病毒的机理不受病毒突变的影响，因而能够有效阻断流感病毒的传播。
50.在一些实施例中，两个所述金属原子可以包括过渡金属原子和/或贵金属原子中的一种或多种。例如，两个金属原子均属于过渡金属原子，或者两个金属原子均属于贵金属原子，或者两个金属原子一个属于过渡金属原子、一个属于贵金属原子，具体不做限定。
51.在一些实施例中，两个金属原子可以包括mg、mn、fe、co、ni、cu和 zn中的一种或两种。两个金属原子可以相同，也可以不同，具体不作限定。
52.在其中的一些实施例中，所述双金属位点纳米酶可以为立方体结构。
53.具体地，所述立体结构的长度可以为40～100nm；例如，可以为40nm、50 nm、60nm、70nm、80nm、90nm或100nm等，具体不做限定。所述立体结构的宽度可以为40～100nm；例如，
可以为40nm、50nm、60nm、70nm、80nm、 90nm或100nm等，具体不做限定。所述立体结构的高度可以为40～100nm；例如，可以为40nm、50nm、60nm、70nm、80nm、90nm或100nm等，具体不做限定。
54.在其中的一些实施例中，两个所述金属原子占所述双金属位点纳米酶的质量百分比可以为0.4～1.2％；例如，可以为0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、 0.9％、1.0％、1.1％或1.2％等，具体不做限定。
55.在其中的一些实施例中，所述双金属位点纳米酶中还可以包括碳原子、氮原子和氧原子，所述碳原子与所述氮原子形成碳氮纳米材料，各所述金属原子分别与两个所述氮原子和两个所述氧原子形成配位键。
56.可选地，所述氮原子和所述氧原子的总数量可以为4～10个，例如，可以为 4个5个、6个、7个、8个、9个或10个等，具体不做限定。所述氮原子和所述氧原子的数量比可以为2:(2～3)；例如，可以为2:2、2:2.5或2:3等，具体不做限定。
57.一实施例提供的双金属位点纳米酶的制备方法，包括如下步骤：将双核配合物包覆于mofs材料内，在惰性气氛下进行热解。
58.在一些实施例中，所述双核配合物的结构可以为：
59.mm'l
·
xn60.其中，m、m’表示金属原子；l表示位于金属原子周围的配体，x表示用于平衡整体电荷的抗衡离子，n表示使配合物整体呈电中性所需要的抗衡离子的数目。当n＞1时，多个抗衡例子的种类可以相同，也可以不同。
61.在其中的一些实施例中，所述配体包括的配位原子的数量为6～12个，例如，可以为6个、7个、8个、9个、10个、11个或12个等，具体不做限定。所述配位原子可以包括碳、氮、氧、磷和硫中的一种或多种。所述配体中的结构单元可以包括卡宾、吡啶、吡咯、氨基、席夫碱、羟基、羧基和羰基中的一种或多种。
62.在一些实施例中，所述mofs材料可以包括zif-8和zif-67中的一种或多种。
63.在一些实施例中，所述惰性气体可以包括氮气和氩气中的一种或多种。
64.在一些实施例中，进行热解时，热解温度可以为300～1000℃；例如，可以为300℃、400℃、500℃、600℃、700℃、800℃、900℃或1000℃等，具体不做限定。
65.在一些实施例中，进行热解时，热解时间可以为0.5～4h；例如，可以为0.5 h、1h、1.5h、2h、2.5h、3h、3.5h或4h等，具体不做限定。
66.一实施例提供的双金属位点纳米酶在制备消杀含有囊膜类病毒的介质中的应用。其中，消杀含有囊膜类病毒的介质可以是指涂覆有双金属位点纳米酶的过滤网或吸附球等，具体不做限定。
67.在一些实施例中，所述含有囊膜类病毒可以包括流感病毒；所述流感病毒可以为h1n1亚型流感病毒。
68.一实施例提供的双金属位点纳米酶在制备空气净化系统中的应用。将双金属位点纳米酶应用于空气净化系统中，能够显著提高空气净化系统对空气中流感病毒的过滤效果，从而为流感病毒的防控提供了新的策略。
69.下述结合具体实施例对本发明的双金属位点纳米酶及其制备方法和应用进行详细说明。
70.需要说明的是，下述实施例中tmb表示3,3',5,5'-四甲基联苯胺、mda表示丙二醛、tem表示透射电子显微镜。
71.实施例1、双金属铁纳米酶的制备
72.所用的双核铁配合物的化学式为fe2(c
24h26
n4o2)cl2，其结构式为：
[0073][0074]
制备方法为：将850mg zn(no3)2·
6h2o和双核配合物8mgfe2(c
24h26
n4o2)cl2溶解于水后，加入2-甲基咪唑水溶液中，室温搅拌12h，离心分离，甲醇洗涤，烘干得到fe2l@zif-8粉末。在流动的氮气气氛下，以5℃/min 的速度升温至900℃，保温2h，自然降至室温，得到fe2onc纳米酶，金属 fe占fe2onc纳米酶的质量百分比为0.8％。fe2onc纳米酶的形貌如图1所示。
[0075]
由图1中左侧部分可以看出fe2onc纳米酶为立方体结构，由图1中右侧部分可以看出fe2onc纳米酶中金属活性位点是独立存在的。
[0076]
实施例2、双金属钯纳米酶的制备
[0077]
所用的双核钯配合物的化学式为pd2(c
24h26
n4o2)cl2，其结构式为：
[0078][0079]
制备方法为：将850mg zn(no3)2·
6h2o和15mg双核配合物 pd2(c
24h26
n4o2)cl2溶解于水后，加入2-甲基咪唑水溶液中，室温搅拌12h，离心分离，甲醇洗涤，烘干得到pd2l@zif-8粉末。在流动的氮气气氛下，以5℃/min 的速度升温至900℃，保温2h，自然降至室温，得到pd2onc纳米酶，金属 pd占pd2onc纳米酶的质量百分比为0.9％。pd2onc纳米酶的形貌如图2所示。
[0080]
由图2中左侧部分可以看出pd2onc纳米酶为立方体结构，由图2中右侧部分可以看出pd2onc纳米酶中金属活性位点是独立存在的。
[0081]
实施例3、其它双金属纳米酶的制备
[0082]
所用的双核配合物的化学式为mm
′
(c
24h26
n4o2)cl2，其中m-和m
′
可以分别独立地选
自mg、fe、co、ni、cu、zn、pt、mn等金属元素；以双核钴配合物为例co2(c
24h26
n4o2)cl2，其结构式为：
[0083][0084]
制备方法为：将850mg zn(no3)2·
6h2o和8mg双核配合物 co2(c
24h26
n4o2)cl2溶解于水后，加入2-甲基咪唑水溶液中，室温搅拌12h，离心分离，甲醇洗涤，烘干得到co2l@zif-8粉末。在流动的氮气气氛下，以5℃/min 的速度升温至900℃，保温2h，自然降至室温，得到co2onc纳米酶，金属 co占co2onc纳米酶的质量百分比为0.8％。co2onc纳米酶的形貌如图3所示。
[0085]
由图3中左侧部分可以看出co2onc纳米酶为立方体结构，由图3中右侧部分可以看出co2onc纳米酶中金属活性位点是独立存在的。
[0086]
实施例4、fe2onc纳米酶类氧化酶活性测试
[0087]
取2mg fe2onc纳米酶分散于1ml水溶液中，再将其稀释成0.2mg/ml，取10μl至样品板内，再依次加入95μl醋酸盐缓冲溶液、5μl tmb，将样品板放入酶标仪中进行测试，平行测试三次，取平均值。652nm处吸光度强度随时间的变化如图4所示。
[0088]
由图4可以看出，在fe2onc纳米酶及氧气的作用下，随着时间的延长，反应体系的吸光强度逐渐增强。
[0089]
实施例5、mm
′
onc纳米酶类氧化酶活性测试
[0090]
取2mg mm
′
onc纳米酶(分别为mn2onc、fenionc、cu2onc和co2onc) 分散于1ml水溶液中，再将其稀释成0.2mg/ml，取10μl至样品板内，再依次加入95μl醋酸盐缓冲溶液、5μl tmb，将样品板放入酶标仪中进行测试，平行测试三次，取平均值。652nm处吸光度强度随时间的变化如图5所示。
[0091]
如图5所示，在不同纳米酶及氧气作用下，随着时间的延长，反应体系的吸光强度随时间逐渐增强。
[0092]
实施例6、fe2onc纳米酶类过氧化物酶活性测试
[0093]
取2mg fe2onc纳米酶分散于1ml水溶液中，再将其稀释成0.005mg/ml，取10μl至样品板内，再依次加入95μl醋酸缓冲溶液、5μl tmb及1.5μl过氧化氢(30％)溶液，将样品板放入酶标仪中进行测试，平行测试三次，取平均值。652nm处吸光度强度随时间的变化如图6所示。
[0094]
由图6可以看出，在fe2onc纳米酶及过氧化氢的作用下，随着时间的延长，反应体系的吸光强度逐渐增强。
[0095]
实施例7、mm
′
onc纳米酶类过氧化物酶活性测试
[0096]
取2mg mm
′
onc纳米酶(分别为mn2onc、fenionc、cu2onc和co2onc) 分散于1ml水溶
液中，再将其稀释成0.2mg/ml，取10μl至样品板内，再依次加入95μl醋酸缓冲溶液、5μl tmb及1.5μl过氧化氢(30％)溶液，将样品板放入酶标仪中进行测试，平行测试三次，取平均值。652nm处吸光度强度随时间的变化如图7所示。
[0097]
由图7可以看出，在不同纳米酶及过氧化氢作用下，随着时间的延长，反应体系的吸光强度逐渐增强。
[0098]
实施例8、fe2onc纳米酶抗流感病毒活性的评价
[0099]
称取适量的fe2onc纳米酶于15ml离心管中，加入适量的h2o，超声10 min。分别配置成5mg/ml、2.5mg/ml、1.25mg/ml、0.625mg/ml的fe2onc 纳米颗粒悬液。取20μl上述配置好的不同浓度的fe2onc纳米酶分别与180μl 纯化的h1n1亚型的流感病毒和细胞毒在室温条件下作用 15min/30min/60min/90min后，分别检测h1n1亚型流感病毒和细胞毒的血凝效价(ha)和组织半数感染量(tcid
50
)的变化，以不含fe2onc纳米酶作为对照组进行平行测定，结果如图8所示，图8中**p＜0.01差异极显著。其中，细胞毒指经细胞培养扩增的hini亚型流感病毒。
[0100]
如图8中a和b所示，与对照组相比，fe2onc纳米酶与纯化的h1n1亚型流感病毒作用后，即可使病毒的ha效价显著下降，具有显著的抗病毒活性；即使fe2onc纳米酶的浓度低至62.5μg/ml时，其与纯化的h1n1亚型流感病毒作用15min时，即可使病毒的ha效价显著下降，作用90min时可使病毒的 ha效价和tcid50滴度均降为0。
[0101]
如图8中c和d所示，fe2onc纳米酶对经细胞毒，即细胞扩增的h1n1 亚型流感病毒，同样具有显著的抗病毒活性；即使fe2onc纳米酶的浓度低至 62.5μg/ml时，其与细胞毒作用90min后可使病毒的ha效价和tcid50滴度均显著下降。
[0102]
实施例9、fe2onc纳米酶抗流感病毒活性稳定性的评价
[0103]
称取适量的fe2onc纳米酶于15ml离心管中，加入适量的h2o，超声10 min。分别配置成5mg/ml、2.5mg/ml、1.25mg/ml、0.625mg/ml的fe2onc 纳米颗粒悬液。取20μl上述配置好的不同浓度的fe2onc纳米酶分别与180μl 纯化的h1n1亚型流感病毒在37℃、4℃条件下作用90min后，检测h1n1亚型流感病毒的血凝效价(ha)的变化，以不含fe2onc纳米酶作为对照组进行平行测定，结果如图9所示，图9中**p＜0.01差异极显著。
[0104]
如图9所示，与对照组相比，fe2onc纳米酶与纯化的h1n1亚型流感病毒在37℃或4℃条件下作用90min后，具有显著的抗病毒效果。表明fe2onc纳米酶可发挥稳定的抗病毒活性，不受温度的影响；即使fe2onc纳米酶的浓度低至62.5μg/ml时，其与纯化的h1n1亚型流感病毒在4℃条件下作用90min 时，可使病毒的ha效价降为0。
[0105]
实施例10、fe2onc纳米酶的脂质氧化酶活性测定
[0106]
称取适量的fe2onc纳米酶于15ml离心管中，加入适量的h2o，超声10 min。分别配置成5mg/ml、2.5mg/ml的fe2onc纳米颗粒悬液。取20μl上述配置好的不同浓度的fe2onc纳米酶分别与180μl纯化的h1n1亚型流感病毒(病毒浓度为1mg/ml)在室温条件下作用90min后，检测丙二醛含量变化，以不含fe2onc纳米酶作为对照组进行平行测定，结果如图10所示，图10中 **p＜0.01差异极显著。
[0107]
如图10所示，与对照组相比，fe2onc纳米酶与纯化的h1n1亚型流感病毒作用90min后，mda含量增加，表明fe2onc具有脂质氧化酶活性。
[0108]
实施例11、tem观察fe2onc纳米酶对病毒结构影响
[0109]
称取适量的fe2onc纳米酶于15ml离心管中，加入适量的h2o，超声10 min。配置成5mg/ml的fe2onc纳米酶悬液。取20μl上述配置好的fe2onc 纳米酶与180μl纯化的h1n1亚型的流感病毒(病毒浓度为1mg/ml)在室温条件下作用90min后，对病毒进行负染色，tem观察病毒形貌变化，结果如图 11所示，其中标尺为100nm。
[0110]
图中control是指没有经纳米酶处理的病毒对照组，由图11可以看出， fe2onc纳米酶处理后的h1n1亚型流感病毒的结构完整性被不同程度地破坏，fe2onc纳米酶可发挥脂质氧化酶活性破坏病毒囊膜结构，从而对h1n1亚型流感病毒具有显著的抗病毒作用。
[0111]
实施例12、fe2onc纳米酶应用于空气净化系统
[0112]
称取适量的fe2onc纳米酶于15ml离心管中，加入适量的无水乙醇，超声10min。分别配置成80mg/ml、40mg/ml、20mg/ml、10mg/ml的fe2onc 纳米颗粒悬液。取25μl上述配置好的不同浓度的fe2onc纳米酶分别加载到无纺布和纱布(两层)，风干，加入200μl纯化的h1n1亚型流感病毒，室温作用2h，收集无纺布或纱布置于1.5ml ep管中，8000rpm离心5min收集病毒，检测病毒血凝效价(ha)和组织半数感染量(tcid50)的变化，以不含fe2onc 纳米酶作为对照组进行平行测定，结果如图12所示。
[0113]
图12中a表示fe2onc加载至无纺布中的示意图；图12中b和c表示利用ha效价和tcid
50
滴度评价加载至无纺布中的fe2onc的抗流感病毒效果；图12中d表示fe2onc加载至纱布中的示意图；图12中e和f表示利用ha 效价和tcid
50
滴度评价加载至纱布中的fe2onc的抗流感病毒效果，其中****p ＜0.0001差异极显著。
[0114]
如图12所示，加载至无纺布或纱布中的fe2onc可使h1n1亚型流感病毒的ha效价和tcid50滴度均显著下降，具有显著的抗病毒效果，特别是当 fe2onc纳米酶的浓度达到1mg/cm2时，其可使病毒的ha效价和tcid50滴度均降为0。表明fe2onc纳米酶可发挥脂质氧化酶活性破坏病毒囊膜结构，从而对h1n1亚型流感病毒具有显著的抗病毒作用。将其加载至无纺布或纱布中仍能发挥抗病毒活性。因此可将fe2onc纳米酶作为一种新型的抗流感病毒材料应用于空气净化系统中，以提高空气净化系统对流感病毒的过滤效果，从而为流感病毒的防控提供新的策略。
[0115]
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
[0116]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。