FGF10旁分泌通用型人成纤维细胞制剂的制备方法与流程

fgf10旁分泌通用型人成纤维细胞制剂的制备方法
技术领域
1.本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种fgf10旁分泌通用型人成纤维细胞制剂的制备方法。


背景技术：

2.成纤维细胞是动物中最常见的结缔组织细胞，是一种存在于大多数组织中间充质细胞，在组织结构支持中起主要作用，并且能够分泌和应答细胞因子，如成纤维细胞生长因子fgf10等等，参与创面愈合的多个阶段。皮肤成纤维细胞是参与创面修复的主要修复细胞，其功能正常与否直接影响创面肉芽组织生成和创面愈合。以往成纤维细胞增殖障碍是研究的热点，近年来其异质性及其与其他细胞间的通讯正逐渐引起重视。成纤维细胞是真皮中的主要细胞，其负责细胞外基质(extracellular matrix，ecm)蛋白的合成和重塑，是相对“被动”的细胞。然而，真皮成纤维细胞群具有异质性，由不同的细胞亚群组成，在创面环境的应激条件下，成纤维细胞通过分泌或接收多种信号分子参与调节炎症反应和细胞增殖，通过细胞与细胞的直接通讯以及自分泌和旁分泌相互作用调节角质形成细胞、内皮细胞和巨噬细胞的功能，形成良性微环境。
3.一些慢性创面上皮边缘组织过度增生堆积导致无法再上皮化，难愈合创面边缘的角质形成细胞不仅迁移和增殖延迟，而且也丧失了与其他细胞通讯的能力。适当补充外源人成纤维细胞对创面有很好的效果，因为慢性创面中大多数成纤维细胞过早衰老，形态异常和迁移障碍以及由p38-mapk通路上调引起的增殖能力下降，不利于与其他细胞形成良性微环境。
4.人成纤维细胞在创面修复或其他应用过程中，新移植的细胞不能很快与周围组织建立“联系”的微环境，往往导致使用效果较差。成纤维细胞生长因子(fgf)是成纤维细胞接受的最重要的信号之一，其能够调控成纤维细胞的生长、以及其他细胞因子的分泌和调节成纤维细胞与其他细胞交互。但是由于新移植细胞微环境形成较慢，导致细胞也不能有效接受fgf的信号，针对此迫切需要改进成纤维细胞，实现fgf旁分泌生成，促进微环境形成。同时，成纤维细胞往往取自于自体，培养后用于自体，但是该类增殖较慢也影响到细胞的使用，为了解决此问题，可以构建通用型细胞，实现细胞的随取随用。
5.fgf家族由22名成员组成，通过内分泌或旁分泌机制发挥作用。fgf10是旁分泌家族成员，表达起始于肺发育早期，主要通过调控上皮和间充质干细胞增殖、分化及迁移，介导上皮间质细胞间互作，在皮肤成纤维细胞中表达能够促进伤口愈合和组织修复，但其表达受到sprouty 2(spry2)蛋白的抑制。spry2蛋白是一种膜相关蛋白，在组织生长和发育建模中被认为是fgf/egf信号通路的调节器。在许多发育过程中，spry2也被认为是fgf10所介导的rtk通路的拮抗剂，其高表达会抑制成纤维细胞旁分泌fgf10因子，造成成纤维细胞周边组织不容易形成良性微环境。spry2除了通过第55位酪氨酸磷酸化调控fgf10信号通路以外，还可以通过其他结构域调控egf和vegf信号通路。
6.影响细胞移植后微环境形成的还有机体对成纤维细胞的免疫排异，排异不仅造成
移植后的细胞生存时间缩短，还诱发强烈的机体炎症。诸多研究已经证实，通过基因组编辑的方法敲除细胞中i类和ii类mhc可以极大降低免疫排异，该两类mhc复合体种类繁多、基因大，给直接敲除带来诸多不便或敲除效果不好。
7.目前，在医学美容、关节炎、创面治疗或康复保健中使用人成纤维细胞存在免疫排异、fgf10旁分泌弱而不能有效刺激新移植细胞形成良性微环境等问题，至今未能有效解决。


技术实现要素：

8.本发明的目的是提供一种fgf10旁分泌通用型人成纤维细胞制剂的制备方法，制得的细胞制剂实现fgf10旁分泌增强，促进新移植的成纤维细胞快速形成良性微环境，进而提升创面愈合效果或其他功能效果，通过crispr/cas9基因编辑技术改造i类和ii类mhc转录激活因子(nlrc5和ciita)构建通用型细胞，实现细胞随取随用，解决细胞繁殖速度慢和异质性的问题。
9.本发明所述的fgf10旁分泌通用型人成纤维细胞制剂的制备方法，包括以下步骤：
10.(1)ciita基因crispr/cas9敲除载体的构建
11.设计双敲grna序列，然后将双敲grna序列克隆进表达载体，获得pu6grna-cas9-gfp-ciita敲除载体；
12.(2)ciita基因缺陷型人成纤维细胞的构建
13.将pu6grna-cas9-gfp-ciita敲除载体转染人成纤维细胞，得到ciita基因缺陷型人成纤维细胞；
14.(3)spry2基因酪氨酸突变pegrna构建
15.设计spry2基因grna和spry2基因突变模板及反转录引物序列，将spry2基因grna、scaffold序列和spry2基因突变模板及反转录引物序列合成spry2基因酪氨酸突变pegrna；
16.(4)nlrc5基因核定位序列突变pegrna构建
17.设计nlrc5基因grna和nlrc5基因突变模板及反转录引物序列，将nlrc5基因grna、scaffold序列和nlrc5基因突变模板及反转录引物序列合成nlrc5基因核定位序列突变pegrna；
18.(5)fgf10旁分泌通用型人成纤维细胞制剂的获得
19.将pe2系统mrna、spry2基因酪氨酸突变pegrna和nlrc5基因核定位序列突变pegrna混合，然后加入到ciita基因缺陷型人成纤维细胞中进行电转染，筛选，扩大培养，得到fgf10旁分泌通用型人成纤维细胞制剂。
20.步骤(1)中所述的双敲grna序列分别为seq id no.1和seq id no.2。
21.步骤(3)中所述的spry2基因grna为seq id no.3所示的序列，scaffold序列为seq id no.4所示的序列，spry2基因突变模板及反转录引物序列为seq id no.5所示的序列。
22.步骤(3)中所述的spry2基因酪氨酸突变pegrna为seq id no.6所示的序列。
23.步骤(4)中所述的nlrc5基因grna为seq id no.7所示的序列，scaffold序列为seq id no.4所示的序列，nlrc5基因突变模板及反转录引物序列为seq id no.8所示的序列。
24.步骤(4)中所述的nlrc5基因核定位序列突变pegrna为seq id no.9所示的序列。
25.步骤(5)中所述的pe2系统mrna的制备方法是按照pcmv-pe2-p2a-gfp质粒的序列
合成pe2系统mrna。
26.步骤(5)中所述的电转染的时间为48-72h，优选为72h。
27.步骤(5)中所述的筛选是采用hla class i阴性细胞流式细胞仪筛选和fgf10阳性筛选。
28.本发明所述的fgf10旁分泌通用型人成纤维细胞制剂的制备方法，包括以下具体步骤：
29.(1)人成纤维细胞培养
30.分离人眼袋皮肤成纤维细胞并培养，液氮储存，得到人成纤维细胞；
31.(2)ciita基因crispr/cas9敲除载体的构建
32.设计双敲grna序列，构建pu6grna-cas9-gfp-ciita敲除载体，实现对ciita基因高效率敲除；
33.(3)ciita基因缺陷型人成纤维细胞的构建
34.将pu6grna-cas9-gfp-ciita敲除载体转染人成纤维细胞，转染结束后收集的细胞采用流式细胞仪进行分离，分离所得单克隆细胞扩大培养，提取基因组进行测序分析、鉴定，继续扩大培养，即得ciita基因缺陷型人成纤维细胞；
35.(4)spry2基因酪氨酸突变pegrna构建
36.设计spry2基因grna和spry2基因突变模板及反转录引物序列，将spry2基因grna、scaffold序列和spry2基因突变模板及反转录引物序列合成spry2基因酪氨酸突变pegrna，在突变模板实现密码子tac(酪氨酸)变为aac(天冬酰胺)，突变模板及反转录引物序列与grna靶模板的序列一致；
37.(5)nlrc5基因核定位序列突变pegrna构建
38.设计nlrc5基因grna和nlrc5基因突变模板及反转录引物序列，将nlrc5基因grna、scaffold序列和nlrc5基因突变模板及反转录引物序列合成nlrc5基因核定位序列突变pegrna，实现密码子cgccggaag(精氨酸-精氨酸-赖氨酸)变为ggcgggcag(甘氨酸-甘氨酸-谷氨酰胺)，突变模板及反转录引物序列与grna靶模板的序列一致；
39.(6)fgf10旁分泌通用型人成纤维细胞制剂的获得
40.人工合成pcmv-pe2-p2a-gfp(addgene id 132776)质粒中pe2系统mrna，与spry2基因酪氨酸突变pegrna、nlrc5基因核定位序列突变pegrna混合，然后与ciita基因缺陷型人成纤维细胞混合，采用lonza核转仪cm-130程序进行电转，收集细胞，采用hla class i阴性细胞流式细胞仪筛选和fgf10阳性筛选，分选单克隆细胞，扩大培养，然后取样提取基因组进行测序分析，即得人皮肤spry2-nlrc5-ciita缺陷型成纤维细胞即fgf10旁分泌通用型人成纤维细胞制剂；
41.(7)细胞fgf10旁分泌和小鼠皮下组织抑制后良性微环境评判
42.通过cck-8、流式细胞术、western blot、elisa和免疫荧光定位，从分子、细胞和动物三个水平分析spry2-nlrc5-ciita缺陷型人成纤维细胞的功能。
43.步骤(2)中所述的双敲grna序列可以高效的敲除mhc ii类复合体的转录因子。
44.步骤(4)中所述的spry2基因酪氨酸突变pegrna的设计是仅突变抑制fgf10转录的spry2蛋白第55位酪氨酸，抑制该位点磷酸化发生，而不影响该蛋白发挥其他功能。
45.步骤(5)中所述的nlrc5 pegrna融合序列的设计是仅突变启动mhc i类复合体转
录的nlrc5蛋白第132-134位氨基酸，抑制nlrc5结合细胞核dna mhc i类复合体转录，而不影响该蛋白发挥其他功能。
46.本发明不直接表达、敲除或突变fgf10、mhc i和ii类复合体，而是改变其调节因子或转录因子，可以直接一次性有效解决mhc i和ii类复合体类大基因家族调控问题。
47.人sprouty 2(spry2)蛋白(af039843.1)第55位酪氨酸磷酸化对该蛋白调控fgf信号通路至关重要，本发明基于david r.liu《engineered pegrnas improve prime editing efficiency，nature biotechnology，2022,40(3):402
–
410》进行设计grna(seq id no.3)、突变模板及反转录引物(seq id no.5)等序列，送云舟生物科技(广州)股份有限公司合成pegrna，实现密码子tac(酪氨酸)变为aac(天冬酰胺)，scaffold序列为seq id no.4。
48.人nlrc5蛋白(np_001371893.1)第132-134位氨基酸是该蛋白核定位信号的关键氨基酸。因为nlrc5在细胞质中还具有调节nf-κb等信号通路的其他功能，所以本发明仅采用primer-editing技术去除调控mhc-i类复合体转录的功能。对该基因的grna(seq id no.7)、突变模板及反转录引物(seq id no.8)等序列进行设计，送云舟生物科技(广州)股份有限公司合成pegrna(seq id no.9)，实现密码子cgccggaag(精氨酸-精氨酸-赖氨酸)变为ggcgggcag(甘氨酸-甘氨酸-谷氨酰胺)。
49.人ciita蛋白是mhc-ii类复合体的转录因子，其具有转录激活因子和通用型转录因子两方面的功能，在蛋白第18-66位氨基酸是其转录激活功能区。本发明基于中国专利cn107475292a，设计双敲grna序列(seq id no.1和seq id no.2)，构建pu6grna-cas9-gfp-ciita敲除载体，实现对ciita基因高效率敲除，解除其对mhc ii类复合体基因的转录。
50.本发明基于spry2和nlrc5蛋白在细胞内具有多调控路径的特点，利用生物信息学技术分析其结构与特点，从而设计出primer editing基因编辑方案，可以实现促进成纤维细胞旁分泌增强和解除mhc-i类免疫排异，而又不损害蛋白其他调控功能；同时采用基因敲除方案解除mhc-ii类免疫排异，构建通用型成纤维细胞实现细胞现取现用。
51.本发明针对成纤维细胞繁殖慢、个体间免疫排异导致使用不便等问题，使成纤维细胞具有更强fgf10分泌功能、最大限度解除免疫排异特点，利于细胞储存、使用；利于回输机体后细胞微环境尽快形成和发挥作用。
52.本发明构建具备fgf10旁分泌且解除免疫排异的spry2-nlrc5-ciita缺陷的通用型人成纤维细胞，其移植机体后可以更有效促进成纤维细胞群良性微环境的形成，可用于美容、光老化皮肤修复、疤痕修复和烧烫伤治疗等，以及关节炎等疾病的治疗与预防。
53.本发明根据人ciita蛋白的第18-66位氨基酸具有转录激活功能特点，根据生物信息技术及dna核小体特点，设计针对该转录激活区域高效敲除效率的双grna方案，获得ciita基因缺陷型成纤维细胞。
54.本发明采用primer editing基因编辑技术，实现spry2蛋白第55位氨基酸密码子tac(酪氨酸)变为aac(天冬酰胺)，仅解除spry2对fgf10旁分泌抑制，保留其对egf和vegf信号通路的调控。
55.本发明采用primer editing基因编辑技术，实现nlrc5蛋白第132-134位氨基酸密码子cgccggaag(精氨酸-精氨酸-赖氨酸)变为ggcgggcag(甘氨酸-甘氨酸-谷氨酰胺)，仅解除nlrc5启动mhc-i类复合体表达功能，保留其对nf-κb等信号通路的调控。
56.本发明采用primer editing基因编辑技术，实现grna序列与其互补链序列(突变
模板和反转录引物)融合使用。
57.本发明通过crispr/cas9敲除i类和ii类mhc转录激活因子(nlrc5和ciita)解决机体对移植后的异体人成纤维细胞的排异现象。
58.针对人成纤维细胞异体移植后不能快速形成良性细胞微环境及该类细胞繁殖速度慢等问题而开发fgf10旁分泌和通用型细胞。基于生物信息学分析三种关键蛋白结构与功能，创新采用primer editing和crispr/cas9技术改造人成纤维细胞，实现fgf10在细胞中增强分泌，解除mhc i和ii类复合体导致的细胞免疫排异，并保留spry2和nlrc5其他的调控功能，解决目前细胞使用遇到的难题。
59.本发明通过crispr/cas9基因敲除和primer editing基因改造后可以形成通用型人成纤维细胞，可用于人体回输预防或治疗关节炎，或进行医学美容。
60.本发明的有益效果如下：
61.本发明首先通过双grna敲除方案构建ciita基因缺陷型成纤维细胞，而后使用primer editing基因编辑技术同时对spry2和nlrc5两个基因同时碱基突变编辑，通过hlai阴性和fgf10阳性筛选获得单克隆细胞，进一步pcr产物测序验证获得spry2-nlrc5-ciita缺陷型成纤维细胞，并从分子、细胞和动物水平验证其功能。本发明的成纤维细胞制剂的生产，提升了移植细胞形成良性微环境的功能且降低了免疫排异，细胞能做到储存后随取随用，可以用于医学美容、关节炎及其他疾病的防治，并能为类似新型细胞的开发提供参考。
附图说明
62.图1是hla class i阴性细胞流式细胞仪筛选结果图。
63.图2是spry2-nlrc5-ciita缺陷型成纤维细胞测序结果图。
64.图3是spry2-nlrc5-ciita缺陷型成纤维细胞增殖情况图。
65.图4是spry2-nlrc5-ciita缺陷型成纤维细胞凋亡情况图。
66.图5是spry2-nlrc5-ciita缺陷型成纤维细胞衰老蛋白p16表达分析结果图。
67.图6是细胞移植后小鼠组织细胞微环境分析结果图。
68.图7是细胞移植小鼠血清fgf10含量分析结果图。
69.图8是细胞移植后小鼠组织ⅰ型和ⅲ型胶原蛋白表达分析结果图。
70.图9是细胞移植后小鼠组织sod和mda表达分析结果图。
具体实施方式
71.以下结合实施例对本发明做进一步描述。
72.以下实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如《分子克隆实验指南》(第三版，科学出版社，2005)等本领域常用工具书中所述的条件，或按试剂生产厂家所建议的条件进行。
73.实施例1
74.(1)人成纤维细胞培养
75.分离人眼袋皮肤成纤维细胞并培养，储存于液氮中，得到人成纤维细胞。将人成纤维细胞从液氮中取出，然后将取出的细胞冻存管迅速置于42℃水浴中复苏，然后室温1000rpm离心10min去除冻存液，用高糖dmem完全培养基(90％高糖dmem+10％胎牛血清)重
悬细胞，转移至培养瓶中，补充完全培养基后置于37℃co2培养箱中培养。
76.(2)ciita基因crispr/cas9敲除载体的构建
77.设计双敲grna序列(seq id no.1和seq id no.2)，然后将双敲grna序列克隆进表达载体，获得pu6grna-cas9-gfp-ciita敲除载体。
78.(3)ciita基因缺陷型人成纤维细胞的构建
79.根据中国专利cn 107475292 a描述的方法制备ciita基因缺陷型人成纤维细胞，其中电转染改成脂质体转染，步骤为：按照lipofectamine 3000转染试剂说明，将pu6grna-cas9-gfp-ciita敲除载体转染人成纤维细胞，转染结束48h后收集的细胞采用流式细胞仪以gfp荧光标记为筛选marker进行分离，分离所得单克隆细胞扩大培养，提取基因组进行测序分析、鉴定，继续扩大培养，即得ciita基因缺陷型人成纤维细胞。制备过程中所用到的grna和pcr鉴定引物见表1。
80.表1 grna序列和pcr鉴定引物
[0081][0082]
(4)spry2基因酪氨酸突变pegrna构建
[0083]
根据spry2蛋白结构特点和对应的功能，设计将spry2蛋白第55位氨基酸密码子tac(酪氨酸)变为aac(天冬酰胺)，并在www.benchling.com网站设计突变点对应的最优grna序列和对应的突变模板及反转录引物序列，突变模板及反转录引物序列与grna靶向的dna链互补，然后将序列按照5
’‑
grna+scaffold+template&primer-binding site(pbs)+aaaaaa-3’顺序融合排列pegrna，送云舟生物科技(广州)股份有限公司合成spry2基因酪氨酸突变pegrna。
[0084]
(5)nlrc5基因核定位序列突变pegrna构建
[0085]
根据nlrc5蛋白结构特点和对应的功能，设计将nlrc5蛋白第132-134位氨基酸实现密码子cgccggaag(精氨酸-精氨酸-赖氨酸)变为ggcgggcag(甘氨酸-甘氨酸-谷氨酰胺)，并在www.benchling.com网站设计突变点对应的最优grna序列和对应的突变模板及反转录引物序列，突变模板及反转录引物序列与grna靶向的dna链互补，然后将序列按照5
’‑
grna+scaffold+template&primer-binding site(pbs)+aaaaaa-3’顺序融合排列pegrna，送云舟生物科技(广州)股份有限公司合成nlrc5基因核定位序列突变pegrna。
[0086]
(6)pe2系统mrna合成
[0087]
按照pcmv-pe2-p2a-gfp(addgene id 132776)所提供序列送云舟生物科技(广州)股份有限公司合成primer editing 2系统mrna，该系统包括ncas9酶和m-mlv反转录酶，mrna包括5
’‑
cap-非翻译区序列-开放阅读框-非翻译区序列-aaaaa
……
aaa-3’，可以直接在细胞内进行翻译。
[0088]
(7)pe2 mrna+pegrna共转染ciita基因缺陷型人成纤维细胞
[0089]
采用电转方式实现pe2 mrna+pegrna共转染ciita基因缺陷型人成纤维细胞，根据lonza se cell line 4d-nucleofector x kit说明，每个电击杯中加1μg pe2 mrna，90pmol spry2基因酪氨酸突变pegrna和90pmol nlrc5基因核定位序列突变pegrna，以及15μl sf buffer，最终体积17μl，然后加入80μl含有2
×
105个ciita基因缺陷型人成纤维细胞的预热培养基并用移液枪轻柔混匀，室温放置10min后采用cm-130程序电转。电转后轻柔混匀，转移至48孔板中置于co2培养箱进行培养。
[0090]
(8)hla class i阴性细胞流式细胞仪筛选
[0091]
经过基因组编辑后的人成纤维细胞mhc i和ii类复合体缺少表达或表达很大程度弱化，而fgf10实现旁分泌表达。将步骤(7)得到的细胞培养3天后，室温1000rpm离心收集细胞，用pbs磷酸缓冲液清洗细胞三次，然后用90μl pbs重悬(约106个细胞)，根据抗体使用说明，细胞悬液与10μl anti-hla class i抗体[w6/32](ab22432)孵育，然后用100μm过滤膜过滤后上样流式细胞仪分离单细胞置96孔板，然后置于co2培养箱进行扩大培养，细胞分离结果见图1。
[0092]
(9)fgf10表达elisa阳性筛选
[0093]
96孔板每个孔细胞繁殖达到90％融合度时，取每个孔10μl培养基，以同批次野生型成纤维细胞培养基为对照，采用elisa方法分析培养基中fgf10含量，保留差异显著的细胞继续扩大培养，操作如下：
[0094]
参照试剂盒说明(ybs-1326r，上海研谨生物科技有限公司)，设置对照孔和样本孔，各加待测样本10μl，再加样本稀释液40μl；空白孔不加。除空白孔外，对照孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶(hrp)标记的检测抗体100μl，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次(也可用洗板机洗板)。每孔加入底物a、b各50μl，37℃避光孵育15min。每孔加入终止液50μl，15min内，在450nm波长处测定各孔的od值。
[0095]
(10)spry2-nlrc5-ciita缺陷型成纤维细胞测序分析
[0096]
随机选取5株所得spry2-nlrc5-ciita缺陷型成纤维细胞(fgf10旁分泌，mhc i和ii复合体不表达)扩大培养，取1-2
×
106cell提取基因组，利用表1鉴定引物进行pcr，pcr产物回收后连接t载体，然后转化大肠杆菌感受态，挑取单克隆菌进行sanger测序分析，结果如图2所示：抽样检测的spry2-nlrc5-ciita缺陷型成纤维细胞中，spry2和nlrc5基因突变结果与预期一致，ciita基因发生移码突变。
[0097]
(11)细胞功能观察
[0098]
以同批次野生型人成纤维细胞对照，采用细胞计数试剂盒8(cck-8)法检测细胞增殖情况，采用流式细胞术检测细胞凋亡情况，采用western blot检测细胞衰老相关蛋白p16表达情况。具体过程如下：
[0099]
1)细胞增殖检测：按照cck-8试剂盒(型号：ck04-100t，上海研谨生物科技有限公
司)说明，在96孔板中配置100μl的细胞悬液(103个细胞)，将培养板在培养箱预培养12，24，48，60，72小时(37℃，5％co2)，向每孔加入10μl cck溶液，将培养板在培养箱内孵育4小时，用酶标仪测定在450nm处的吸光度。结果如图3所示，野生型和spry2-nlrc5-ciita缺陷型成纤维细胞增殖速度无显著差异。
[0100]
2)细胞凋亡检测：细胞培养达到85％融合时，移除培养液，pbs清洗贴壁细胞3次，用0.25％的胰酶消化细胞，收集于15ml离心管内，1000rpm离心5min，弃上清收集细胞，pbs轻轻重悬后，加入195μl annexin v-fitc结合液，吹打混匀，重悬细胞，加入5μl annexin v，轻轻混匀，避光室温孵育15min，加入10μl pi染色液，轻轻混匀，避光孵育10min，进行流式细胞仪检测。结果如图4所示，野生型和spry2-nlrc5-ciita缺陷型成纤维细胞并无显著的凋亡差异。
[0101]
3)细胞衰老蛋白p16分析
[0102]
①
制冰、配置细胞裂解液(裂解液：蛋白酶抑制剂为1ml：10μl)并预冷。
[0103]
②
收集细胞加入配置裂解液(细胞：配置裂解液为0.2g：1.5ml)。
[0104]
③
蛋白含量定量并sds-page凝胶蛋白电泳。
[0105]
④
转膜：将浓缩胶与分离胶分离，保留分离胶。剪下大约粗细为2-3cm的pvdf膜，长度与分离胶接近，放入甲醇中活化3-5min，根据目标蛋白分子量大小在marker条带上找到对应大概位置，将pvdf膜放在相应位置。转模采用三明治方法，夹子由白到黑为海绵、滤纸、pvdf膜、分离胶、滤纸、海绵，将转膜的夹子夹紧放入转膜槽，放入冰盒，倒入4℃1
×
转模液，由负极向正极跑，打开电源，恒流200ma，转模2.5h。
[0106]
⑤
封闭：将转模后的pvdf膜放入含5％脱脂奶粉的tbst缓冲液中，常温摇床1.5h。
[0107]
⑥
一抗孵育：配置含1％脱脂奶粉的tbst缓冲液，按一抗(p16，ab151303；gapdh，ab9485)说明书的稀释浓度加入一抗，4℃摇床孵育13h。
[0108]
⑦
洗膜：一抗孵育结束，用tbst洗膜，每次5-10min，5次。
[0109]
⑧
二抗孵育：洗膜结束后，配置含1％脱脂奶粉的tbst缓冲液，按二抗(ab205718)说明书的稀释浓度加入二抗，常温摇床孵育1h。
[0110]
⑨
洗膜：二抗孵育结束，用tbst洗膜，每次5-10min，5次。
[0111]
⑩
封膜和曝光：打开暗夹，平铺保鲜膜并固定，按1：1配置发光液(注意避光)，将pvdf膜平铺在保鲜膜上，滴发光液，等其反应5min左右，盖上保鲜膜并去除气泡。进入暗室，如果荧光明显，取出x光片4张，平铺到暗夹中，合上盖子3-5min，取出x光片放入显影液中显影5-10min，取出用清水清洗后再放入定影液中5-10min，取出再次清洗，晾干保存。如果荧光不明显，取出x光片4张，平铺到暗夹中，合上盖子4h，后面操作同上。
[0112]
结果如图5所示，p16蛋白表达水平无明显差异。
[0113]
(12)成纤维细胞微环境形成观察
[0114]
取同批次野生型和spry2-nlrc5-ciita缺陷型人成纤维细胞各106个细胞，无菌环境回输至spf级昆明鼠背部皮下。2周后麻醉处死昆明鼠并分离细胞回输部位组织，固定，制作冷冻切片，采用荧光定位观察组织中神经元(抗体gfap，53-9792-82，invitrogen)、免疫细胞(抗体cd45，56-0451-82，invitrogen)变化。结果如图6显示，在小鼠背部皮下细胞移植部位组织中，spry2-nlrc5-ciita缺陷型人成纤维细胞组的神经元数量明显高于对照组，免疫细胞数量少于对照组，说明spry2-nlrc5-ciita缺陷型人成纤维细胞组细胞微环境形成
较好，并没引起很强的免疫排异反应。
[0115]
(13)小鼠血清多反应性抗体pra和fgf10变化
[0116]
血清多反应性抗体pra反应细胞移植后小鼠机体对细胞的排异反应，其阳性率越高代表排异越强，野生型细胞组和spry2-nlrc5-ciita缺陷型细胞组分别选取12只spf级昆明鼠进行试验。检测采用酶联免疫吸附法(elisa)，按操作说明进行。试剂为购自美国one lambda公司的抗原板(la t1240)，该抗原板包被21种hla-a 抗原，42种hla-b抗原，15种cw抗原，18种hla-dr抗原和7种hla-dq抗原。在terasaki微孔板中分别加入10μl按1：3稀释的野生型细胞移植小鼠血清及spry2-nlrc5-ciita缺陷型人成纤维细胞组血清，室温孵育1h，缓冲液洗4次，再在每孔中加入10μl的1：100酶联抗人igg抗体，室温孵育40min，再洗4次，然后每孔加入10μl底物，37℃避光孵育10～15min，最后每孔加入5μl终止液。酶标仪于630nm波长下读板，并分析结果。fgf10按照步骤(9)进行。结果显示，spry2-nlrc5-ciita缺陷型人成纤维细胞组小鼠血清pra抗体阳性率16.67％(2/12)显著低于野生型细胞组小鼠75.00％(9/12)，而fgf10在血清含量则高于野生型细胞组(图7)。
[0117]
(14)光老化皮肤防治效果观察
[0118]
根据文献(侯绍蔚,米希婷,武晓华,赵爱玲.富血小板血浆对大鼠光老化皮肤中胶原蛋白和氧化应激的影响[j].山西大同大学学报(自然科学版),2021,37(06):68-70+74.)报道的照射方案调整后进行紫外线照射，小鼠背部去毛，并选取背部细胞注射移植部位。取balb/c雄性小鼠随机分为：未处理组、野生型细胞组(紫外线照射+皮下注射人成纤维细胞)和基因缺陷型细胞组(紫外线照射+皮下注射基因缺陷型人成纤维细胞)，第1，2，4周各注射细胞106个，第1周结束后开始每周5次细胞注射部位紫外线照射，第4周结束后，将紫外线照射背部皮肤提取的蛋白(50μg)用10％sds-page不连续凝胶电泳分离，然后转移到硝酸纤维素膜上，5％脱脂牛奶室温封闭1h。然后分别加兔抗collagenⅰ、collagenⅲ和gapdh(1∶1000)一抗，4℃冰箱孵育过夜。后续同p16蛋白western blot检测，结果如图8显示，与野生型细胞组比较，spry2-nlrc5-ciita缺陷型人成纤维细胞组ⅰ型和ⅲ型胶原蛋白表达明显增加。
[0119]
同时检测皮肤中氧化应激标志物mda和sod的变化。取紫外线照射背部皮肤提取的蛋白，然后分别使用试剂盒检测mda和sod的水平。具体操作方法按照试剂盒说明书进行。结果如图9所示，与野生型细胞组比较，spry2-nlrc5-ciita缺陷型人成纤维细胞组能够显著提高sod的活性，减少mda的水平，抑制氧化应激损伤。
[0120]
综上所述，本发明制得的fgf10旁分泌通用型人成纤维细胞与同批次野生型细胞相比，生长速度、细胞衰老凋亡、关键功能因子分泌等无差异；spry2和nlrc5蛋白分别解除fgf10表达抑制和沉默mhc-i类复合体表达，但是不影响spry2对egf和vegf信号通路，以及nlrc5对nf-κb等信号通路的调控。与野生型细胞相比，fgf10旁分泌通用型人成纤维细胞在小鼠皮下组织更易形成良性微环境，在小鼠光老化皮肤防治效果上更好。
[0121]
本发明所构建的spry2-nlrc5-ciita缺陷型人成纤维细胞，可以增强fgf10旁分泌和解除异体细胞移植免疫排异，有利于移植后尽快形成细胞良性微环境，可以为医学美容、关节炎及其他需要细胞移植防治类疾病服务，也为开发类似细胞提供理论支持。