一种腈水合酶催化乙腈生成乙酰胺的应用的制作方法

1.本发明涉及一种腈水合酶催化乙腈生成乙酰胺的应用，属于生物工程技术领域。


背景技术：

2.腈水合酶(nitrile hydratase，简称nhase，ec 4.2.1.84)，是一类可以催化腈类物质通过水合反应转化为高附加值酰胺类化合物的金属酶，在大宗化学品丙烯酰胺的工业生产上已经被广泛应用。目前，腈水合酶以其绿色环保、反应条件较温和、安全系数高等优势，而逐渐替代传统的化学法，使得酰胺类的生产符合可持续发展和绿色生产理念。
3.腈水合酶通常由α和β两个亚基构成，研究发现，目前已报道的原核生物来源的腈水合酶大都存在稳定性差、催化活性低、催化底物谱窄的问题。也有很多研究尝试对其进行了改造，来提高其相关的性质。但是目前的催化效率不高、底物谱窄等问题仍然限制着腈水合酶进一步的开发和应用。


技术实现要素：

4.针对现有的技术难点及存在的问题，本发明提供了一种表达来源于rhodococcus rhodochrous j1的腈水合酶的重组大肠杆菌bag以及重组大肠杆菌bag在底物催化生产上的应用。
5.本发明的第一个目的是提供一种表达腈水合酶的基因工程菌，所述腈水合酶的α亚基的氨基酸序列如seq id no.1所示，β亚基的氨基酸序列如seq id no.2所示。
6.在一种实施方式中，所述表达载体包括pet-24a(+)。
7.在一种实施方式中，所述宿主细胞包括e.coli bl21(de3)。
8.本发明的第二个目的是提供一种全细胞催化剂，所述全细胞催化剂包含所述基因工程菌。
9.在一种实施方式中，还含有冻干保护剂。
10.在一种实施方式中，所述冻干保护剂包括但不限于海藻糖、脱脂乳粉、甘油和低聚异麦芽糖。
11.本发明的第三个目的是提供一种制备酰胺类物质的方法，以腈类物质为底物，利用所述基因工程菌或所述全细胞催化剂催化生成酰胺类物质。
12.在一种实施方式中，将基因工程菌或全细胞催化剂经过诱导培养后，收集细胞，分批次加入腈类物质，催化获得酰胺类物质。
13.在一种实施方式中，所述诱导培养为将基因工程菌或全细胞催化剂接种于lb培养基培养获得种子液后，接种于诱导培养基，培养至od
600
至0.6-0.8，加入终浓度为0.35～0.45mm的异丙基硫代半乳糖苷以及0.08～0.12g/l的cocl2·
6h2o。
14.在一种实施方式中，所述腈类物质包括异丁腈、正戊腈、丙烯腈、烟腈、2-氰基吡嗪、苯甲腈、肉桂腈、萘甲腈和乙腈。
15.在一种实施方式中，所述酰胺类物质包括异丁酰胺、戊酰胺、丙烯酰胺、烟酰胺、吡
嗪酰胺、萘甲酰、苯甲酰胺、肉桂酰胺和乙酰胺。
16.本发明的第四个目的是提供所述基因工程菌或所述全细胞催化剂在生产酰胺类物质中的应用。
17.在一种实施方式中，所述酰胺类物质包括但不限于异丁腈、正戊腈、丙烯腈、烟腈、2-氰基吡嗪、苯甲腈、肉桂腈、萘甲腈和乙腈。
18.本发明的有益效果：
19.本发明提供了一段rhodococcus rhodochrous基因序列，在宿主e.coli bl21(de3)中表达后，通过纯化得到纯酶。该腈水合酶在ph7.4条件下催化乙腈形成乙酰胺，比活可达261.94
±
9.13u/mg。
20.利用表达来源于rhodococcus rhodochrous j1的腈水合酶的重组大肠杆菌bag进行全细胞催化，以乙腈为底物催化生成乙酰胺，转化率达到58.9％。
21.这对于进一步深入认识腈水合酶的生物催化机理和对其进行改造具有重要意义。
附图说明
22.图1为纯酶的sds-page电泳图，m：蛋白marker，bag全细胞，bag纯酶。
23.图2为来源于r.rhodochrous j1的h-nhase野生型bag对于乙腈催化的比酶活。
具体实施方式
24.实施例1：基因的获得和表达体系的构建
25.将核苷酸序列如seq id no.3所示的腈水合酶编码基因连接至表达载体pet-24a(+)的ndei和ecori之间，将其转化至e.coli jm109中，在lb平板培养后、挑取单克隆由天霖生物科技(无锡)有限公司进行测序验证，得到阳性转化子，从阳性转化子中提取质粒，即为质粒pet24a(+)-bag。
26.实施例2：重组蛋白的纯化
27.1)诱导培养
28.将质粒pet24a(+)-bag转化至大肠杆菌e.coli bl21(de3)，挑取单菌落至5ml lb培养基(胰蛋白胨10.0g/l，酵母提取物5.0g/l，nacl 10.0g/l，卡那霉素终浓度50μg/ml)，37℃、200rpm条件下培养7-8h，得种子液。将种子液按1％(v/v)接种量转接至500ml 2
×
yt培养基(胰蛋白胨16.0g/l，酵母提取物10.0g/l，nacl 5.0g/l，卡那霉素终浓度50μg/ml)，37℃、200rpm条件下培养至od
600
至0.6-0.8，加入终浓度为0.4mm的异丙基硫代半乳糖苷(iptg)以及0.1g/l的cocl2·
6h2o，改变培养温度为25℃，诱导表达12-16h。
29.2)初步提纯
30.使用超声波震荡器使细胞膜上所受张力不均而使细胞破碎。超声功率80％，每次超声震荡4s后停止6s。超声破碎30min后使用离心机收集上清，12000rpm离心30min，得到粗酶液。
31.3)亲和层析
32.初步提纯后，再通过亲和层析法进一步纯化。由于质粒pet24a(+)-bag带有strep标签，因此选择阴亲和层析，层析柱为1ml strep柱。纯化柱用结合缓冲液平衡后，进行上样，然后用结合缓冲液洗去杂蛋白。用洗脱缓冲液进行目的蛋白的洗脱。收集洗脱峰对应的
样品。蛋白浓度使用bradford蛋白浓度检测试剂盒进行定量。采用sds-page检测目的蛋白的纯化质量，检测如图1所示，可见纯化后蛋白条带单一，纯化质量高。
33.实施例3：酶学性质的测定
34.酶活测定
35.腈水合酶的酶活力(u)：单位酶活力定义为25℃下，每分钟催化乙腈生成1μmol乙酰胺所需要的酶量。
36.腈水合酶的比酶活(u/mg)：每毫克腈水合酶所具有的酶活力。
37.用10mm kpb(ph 7.4)溶液将实施例2中的纯酶的浓度稀释至0.1mg/ml，取10μl至1.5ml离心管中，置于25℃金属浴上。向离心管中加入450μl底物(200mm乙腈溶液)，充分涡旋混匀，25℃下反应10min，然后加入500μl纯乙腈溶液进行终止，过0.22μm滤膜。
38.液相检测方法：流动相组成为乙腈：水＝1：2(v/v)，流速为0.6ml/min，检测波长为215nm，柱温为40℃，测定反应体系中产物乙酰胺的生成量。
39.最终测得腈水合酶bag的比酶活为261.94
±
9.4u/mg。(图2)
40.实施例4：bag全细胞催化
41.将质粒pet24a(+)-bag转化至大肠杆菌e.coli bl21(de3)，挑取单菌落至5ml lb培养基(胰蛋白胨10.0g/l，酵母提取物5.0g/l，nacl 10.0g/l，卡那霉素终浓度50μg/ml)，37℃、200rpm条件下培养7-8h，得种子液。将种子液按1％(v/v)接种量转接至500ml 2
×
yt培养基(胰蛋白胨16.0g/l，酵母提取物10.0g/l，nacl 5.0g/l，卡那霉素终浓度50μg/ml)，37℃、200rpm条件下培养至od
600
至0.6-0.8，加入终浓度为0.4mm的异丙基硫代半乳糖苷(iptg)以及0.1g/l的cocl2·
6h2o，改变培养温度为25℃，诱导表达14h后得到50ml的bag细胞。
42.进行全细胞催化乙腈生成乙酰胺实验，控制反应温度在18℃-21℃之间，每次向bag细胞中加入1.5ml乙腈底物(纯度95％)，前10次每隔5min添加一次底物，后17次每隔7-8min添加一次底物。于164min时添加完第27管底物。在230min取样进行了液相检测，进行计算。
43.表1转化率测定
[0044][0045]
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。