用于降低血尿酸的包含微生物的组合物及其应用的制作方法

本发明涉及微生物，具体涉及含有枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)、罗伊氏乳杆菌(lac～bacillus reuteri)、酪酸梭菌(clostridium butyricum)的一种或一种以上的组合，用于降低血尿酸的药品或其它产品。

背景技术：

1、高尿酸血症可能发展为痛风、肾病、尿路结石、心血管紊乱、脑血管紊乱等。正常生理状态下，人体内尿酸总量约1200mg，尿酸的排泄主要有两种途径，2/3左右通过肾脏以尿液形式排出，1/3以肠道形式排泄的。人体内尿酸，主要是嘌呤核酸类物质代谢产生的，嘌呤核酸的来源，主要有两个方面，一类是食源性嘌呤核酸的摄入，如富含嘌呤核酸的动物内脏，海鲜，以及啤酒等，均会导致血液尿酸的升高，还有一类是体内细胞新陈代谢过程中细胞凋亡后，嘌呤核酸物质被降解生成的尿酸，如实体瘤病人在放化疗过程中，肿瘤消亡会释放大量核酸物质，从而引起严重的高尿酸血症。对于非放化疗的高尿酸血症患者，尿酸产生过多，则多是与食源性的嘌呤核酸摄入增多密切相关。嘌呤类化合物包括嘌呤碱基，嘌呤核苷和嘌呤核苷酸。通过限制嘌呤摄入的饮食方式来防治高尿酸血症与痛风，在医学界已达成广泛共识，写入《中国肾脏疾病高尿酸血症诊治的实践指南》。然而，在生活中严格限制这些成分的摄入是非常困难的，因为饮食中非常美味的动植物细胞、食物调味剂中均含有嘌呤前体类成分，特别是海鲜、动物的肉的嘌呤含量都比较高。严格限制嘌呤核酸摄入的饮食方式，将会严重影响病人的生活质量。

2、目前，临床常用的治疗高尿酸血症药物主要包括抑制尿酸产生或促进尿酸排泄的两类化药，但大部分患者对化药都有着不同程度的副反应，导致相当一部分患者无药可用。因此，必须开发一种疗效可靠、毒副作用小的治疗方式。

3、益生菌作为人体肠道重要的菌群成员，在高尿酸血症治疗上与药物相比更有优势，如何筛选到具有降低血尿酸功能的益生菌株成为目前研究的热点。大冢制药公司的专利 (cn1812801a)公布了一组发酵乳酸杆菌和一株酵母菌具有分解肌苷和鸟苷的功能和降低血尿酸的功能，然而该菌在降解肌苷和鸟苷时会产生尿酸，尿酸在肠道中的浓度升高同样可能会被肠道吸收导致高尿酸血症，因此不是理想的降低血尿酸的益生菌种。大连医科大学的杨殿斌等人，报告筛选到一株植物乳杆菌(dm9218)具有降低肌苷和鸟苷的能力，然而，其并没有测试研究该菌对核苷酸是否有降解能力。众所周知，食物中的核酸物质(主要包括dna和rna)首先被肠道中的核酸酶降解为核苷酸(或脱氧核苷酸)，核苷酸再被核苷酸酶分解为核苷(或脱氧核苷)和磷酸，核苷酸(或脱氧核苷) 也是很容易被吸收入血导致高尿酸血症的，因此，能降解核苷酸和核苷，才能更好的防止食源性嘌呤前体的吸收。日本明治公司(专利号：cn102747004b)开发的一种格氏乳杆菌具有肌苷和鸟苷的分解能力，并已开发为酸奶上市销售；然而，最近该菌种在高尿酸血症病人中的临床研究结果显示，其降血尿酸效果并不显著(hisashi yamanaka， modern rheumatology，2019，vol.29,no.1,146–150)。上海交通大学的杨虹等人的文章(金方，杨虹，微生物学通报，2018,45(8):1757-1769)与嘉兴益诺康公司的专利(cn 108486007)均公开了一种降嘌呤核酸的干酪乳杆菌(zm15)，其具有降解核苷的作用，且在高尿酸大鼠模型上观察到了降低血尿酸的效果。此外，张彦新等人还将尿酸氧化酶构建进入乳酸菌，构建具有降尿酸能力的工程益生菌，以期望降低肠道中的尿酸含量，达到将血尿酸的效果。

4、然而，本技术发明人在分析已公开发表的降解嘌呤前体的益生菌研究结果时，发现部分研究在表述降解能力时描述模糊(如表述为降解核苷的百分比，但是没有明确时间；或表述为降解底物的速度/g菌体，但是没有明确菌体是湿重还是干重，且所有研究中的反应条件也不尽相同)，相互之间不具有可比性。此外还发现，绝大多数科学研究和专利在评估益生菌降解核苷酸时，采用的是将培养好的微生物经离心收集，将微生物菌体加入到只含有嘌呤前体(核苷或核苷酸)底物的缓冲液中，测试益生菌的降解核苷酸或核苷的能力。这种测试方法存在一个严重的缺陷，活的微生物每时每刻都需要营养物质维持自己的生存，在营养物质缺乏的环境中，微生物为生存，会被胁迫消化吸收某些正常状态下不利用的营养物质，然而，一旦当营养物质丰富时，微生物是不会优先利用这些营养物的，因此，通过这种只含有核苷酸底物的反应体系筛选到的益生菌，进入人体后，在肠道丰富的营养物质条件下，益生菌可能并不消化分解核苷酸，因而筛选出的益生菌株在实际应用中不具有效果。

5、因此，有必要筛选出更多能在人体肠道环境中具有分解嘌呤/嘌呤前体能力，同时有助于肠道菌群向相对健康的方向进行平衡的细菌。

技术实现思路

1、针对现有技术的现状及存在的不足，本发明的目的在于提供一种用于降低血尿酸的包含微生物的组合物。本发明人在让有胃肠道不适的人员服用调理胃肠道的微生物活菌制品，即含有枯草芽孢杆菌纳豆亚种菌株的纳豆或一种含酪酸梭菌的oct微生物制剂时，意外发现，服用这两种菌的任何一种，不仅改善了患者的胃肠不适，还发现患者血尿酸降低。通过模拟肠道条件包括低氧环境、含胆盐、和含胰酶的条件进一步筛选，获得了降解嘌呤类化合物和降低血尿酸效果更好的菌种。并用高尿酸血症的模型小鼠对筛选到的菌种及其组合物进行降低血尿酸的功能测试。本发明提供的组合物可用于开发控制血尿酸的新型益生菌食品或药物。

2、为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

3、第一方面，本发明提供一种可口服的用于降低血尿酸的包含微生物的组合物，包含枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)、罗伊氏乳杆菌(lactobacillus reuteri)、酪酸梭菌 (clostridium butyricum)中的至少一种。

4、在优选的实施方式中，上述组合物中的枯草芽孢杆菌、罗伊氏乳杆菌、酪酸梭菌可在含嘌呤类化合物的培养基上生长，嘌呤类化合物包括但不限于鸟嘌呤、鸟嘌呤核苷、鸟嘌呤核苷酸，腺嘌呤、腺嘌呤核苷、腺嘌呤核苷酸，黄嘌呤、黄嘌呤核苷、黄嘌呤核苷酸，次黄嘌呤、次黄嘌呤核苷(肌苷)、次黄嘌呤核苷酸(肌苷酸)中的至少一种。

5、在优选的实施方式中，上述组合物中的枯草芽孢杆菌、罗伊氏乳杆菌、酪酸梭菌可在模拟肠道条件下降解嘌呤类化合物，所述模拟肠道条件包括低氧环境、含胆盐、和含胰酶的条件，嘌呤类化合物包括但不限于鸟嘌呤、鸟嘌呤核苷、鸟嘌呤核苷酸，腺嘌呤、腺嘌呤核苷、腺嘌呤核苷酸，黄嘌呤、黄嘌呤核苷、黄嘌呤核苷酸，次黄嘌呤、次黄嘌呤核苷(肌苷)、次黄嘌呤核苷酸(肌苷酸)中的至少一种。

6、在优选的实施方式中，上述组合物中的枯草芽孢杆菌为保藏编号cctcc no:m2022444的枯草芽孢杆菌纳豆亚种kbsn-2(bacillus subtilis subsp.natto)、罗伊氏乳杆为保藏编号cgmcc no.18700的罗伊氏乳杆菌株klr-3(lactoacillus reuteri)、酪酸梭菌为保藏编号cctcc no:m 2022598的酪酸梭菌kcbu-1(clostridium butyricum)。

7、在优选的实施方式中，上述组合物中包含枯草芽孢杆菌纳豆亚种kbsn-2、罗伊氏乳杆菌株klr-3、酪酸梭菌kcbu-1中至少2种菌株。

8、在优选的实施方式中，上述组合物中包含枯草芽孢杆菌纳豆亚种kbsn-2、罗伊氏乳杆菌株klr-3和酪酸梭菌kcbu-1。

9、在优选的实施方式中，上述组合物中各菌株为等量混合。

10、第二方面，本发明提供一种酪酸梭菌，其分类名称为酪酸梭菌(clostridiumbutyricum) kcbu-1菌株，于2022年5月11日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为cctcc no:m 2022598；保藏地址为中国.武汉.武汉大学。

11、第三方面，本发明提供了一种食品，其包含第一方面所述的组合物。

12、第四方面，本发明提供了一种食品添加剂，其包含第一方面所述的组合物。

13、第五方面，本发明提供了一种微生物制剂，其包含第一方面所述的组合物。

14、第六方面，本发明提供了一种保健品，其包含第一方面所述的组合物。

15、第七方面，本发明提供第一方面所述的组合物、第二方面所述的酪酸梭菌或罗伊氏乳杆菌在制备减少肠道嘌呤吸收的药物或食品中的应用，所述罗伊氏乳杆菌为保藏编号cgmcc no.18700的罗伊氏乳杆菌株klr-3(lactobacillus reuteri)。

16、第八方面，本发明提供第一方面所述的组合物、第二方面所述的酪酸梭菌或罗伊氏乳杆菌在制备预防和治疗高尿酸血症和/或痛风的药物或食品中的应用，所述罗伊氏乳杆菌为保藏编号cgmcc no.18700的罗伊氏乳杆菌株klr-3(lactobacillus reuteri)。

17、在优选的实施方式中，上述应用中，所述的药物是供口服的剂型。

18、在优选的实施方式中，上述应用中，所述的药物的口服剂量为罗伊氏乳杆菌活菌数≧105cfu/天，枯草芽孢杆菌孢子数≧105cfu/天，酪酸梭菌活菌数≧105cfu/天。

19、优选地，上述应用中，所述剂型是选自于下列所构成的群组：溶液、悬浮液、乳剂、粉末、锭剂、丸剂、糖浆、口含锭、片剂、口嚼胶、浓浆以及胶囊。

20、优选地，上述应用中，所述的食品，包括普通食品，保健食品，或特殊医学用途配方食品。

21、第九方面，本发明提供第一方面所述的组合物或第二方面所述的酪酸梭菌在降低饮食品中嘌呤类化合物的应用。

22、第十方面，本发明提供一种抑制饮食品来源嘌呤类化合物摄入的方法，其包括使饮食品的原料或中间产品与第一方面所述的组合物、第二方面所述酪酸梭菌或罗伊氏乳杆菌和/或其处理物接触的工序，所述罗伊氏乳杆菌为保藏编号cgmcc no.18700的罗伊氏乳杆菌株klr-3(lactobacillus reuteri)。

23、第十一方面，本发明提供一中降低饮食品中嘌呤类化合物的制造方法，其包括使饮食品的原料或中间产品与第一方面所述的组合物、第二方面所述酪酸梭菌或罗伊氏乳杆菌和/或其处理物接触的工序，所述罗伊氏乳杆菌为保藏编号cgmcc no.18700的罗伊氏乳杆菌株klr-3(lactobacillus reuteri)和/或其处理物接触的工序。

24、本发明的有益效果

25、本发明从市场上购买来自中国、日本和马来西亚的可食用纳豆产品、稻草、健康成人粪便、土壤等中分离菌株。挑取可以在含嘌呤类化合物及尿酸的培养基平板上生长的菌落。经过16s rdna测序和纳豆发酵试验鉴定获得枯草芽孢杆菌纳豆亚种；或使用酪酸梭菌筛选培养基，经16s rdna测序鉴定，选取序列比对结果为酪酸梭菌的菌株。在嘌呤类化合物的培养基中分别接种这些菌株以及来自实验室种子库保存菌株罗伊氏乳杆菌klr-1、klr-3、klr-4，观测其生长状况。最终获得可在降嘌呤类化合物的能力上可以完美互补的kbsu-2与klr-3以及kcbu-1。其中，kbsu-2 分离自纳豆产品，kcbu-1分离自健康成人粪便。通过在高尿酸血症模型小鼠上进行菌株组合的功效验证，发现降解腺嘌呤速度最快的kbsu-2，降解嘌呤核苷和核苷酸能力最强的klr-3，以及丁酸产量最高的kcbu-1，形成的三联菌株或两联菌株组合物与单一菌株之间降血尿酸的效果有显著性差异，其中形成的三联菌株降血尿酸的效果最好，二联菌株次之，且3种二联菌株之间降血尿酸的效果没有显著性差异。此外，本发明提供的三联菌株组合物与临床化药治疗方式相比，降血尿酸的能力相当，无毒副作用，安全性更高，具有广阔的应用前景。

26、本发明筛选获得的酪酸梭菌(clostridium butyricum)kcbu-1菌株具有较强的产丁酸能力，其代谢产物丁酸和/或丁酸盐可作为肠道细胞的能源物质，可调节肠道健康，抑制炎症。

27、本发明筛选到的枯草芽孢杆菌纳豆亚种kbsn-2菌株，是好氧菌，通过消耗肠道氧气，可能促进厌氧菌kcbu-1和兼性厌氧菌klr-3在肠道中的存活与生长，也有利于其他肠道厌氧菌的生长。