一种植物乳杆菌及其应用的制作方法

no：m 2022604。
15.上述植物乳杆菌lp-ics22保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏日期为2022年5月11日，保藏地址为中国湖北省武汉市武昌区八一路299号。
16.本发明又提供了一种菌剂，包含所述的植物乳杆菌。
17.本发明还提供了所述的植物乳杆菌或所述的菌剂在制备发酵剂中的应用。
18.本发明还提供了所述的植物乳杆菌或所述的菌剂在发酵制备仙人掌低聚糖中的应用。
19.本发明利用植物乳杆菌lp-ics22发酵仙人掌，可一步法制备得到具有优异抗氧化性能的仙人掌低聚糖，具有高效、环保、成本低、活性好等优点，是一种具有广阔应用前景的技术。制备得到的仙人掌低聚糖在减肥、体重管理等方面具有诸多潜在应用。
20.作为一个总的发明构思，本发明还提供了一种仙人掌低聚糖的发酵制备方法，包括仙人掌的破碎、仙人掌发酵液的制备、使用植物乳杆菌lp-ics22进行有氧发酵、仙人掌低聚糖的纯化等过程。
21.具体的，一种仙人掌低聚糖的发酵制备方法，包括步骤：
22.(1)新鲜仙人掌片切块后与缓冲盐液混合，进行破碎打浆处理，得到仙人掌浆液；
23.(2)将所述仙人掌浆液转移至发酵罐中，灭菌，然后将活化后的权利要求1所述的植物乳杆菌菌液接种至所述发酵罐中，通气有氧发酵；
24.(3)步骤(2)得到的发酵液离心取上清液，将所述上清液浓缩后加入无水乙醇，静置收集沉淀物；
25.(4)将所述沉淀物用蒸馏水复溶后进行蒸发浓缩，干燥，得到仙人掌低聚糖粉末。
26.在一优选例中，步骤(1)中，所述仙人掌浆液中，仙人掌的质量百分含量为20％～50％。
27.在一优选例中，步骤(1)中，所述缓冲盐液的ph为5.5～6.5，其中含有0.1g/l(nh4)2so4，0.1g/l kh2po4，0.2g/l nacl，0.02g/l mgso4。这种特制的缓冲盐液更适合本发明植物乳杆菌lp-ics22发酵制备仙人掌低聚糖。
28.在一优选例中，步骤(2)中，所述灭菌具体为：100～105℃加热15～30min。
29.在一优选例中，步骤(2)中，活化后的植物乳杆菌菌液的od600在0.6～0.8之间，接种量为1％～10％。
30.在一优选例中，步骤(2)中，所述发酵罐通气有氧发酵的具体条件为：溶氧量30％～50％，转速100～200rpm，温度30～37℃，发酵时间24～48h。
31.在一优选例中，步骤(3)中，所述离心的条件为：转速3000～8000rpm，离心时间5～10min。
32.在一优选例中，步骤(3)中，将所述上清液浓缩2～8倍后加入2～5倍体积的无水乙醇。
33.本发明还提供了所述的发酵制备方法制备得到的仙人掌低聚糖。
34.本发明还提供了所述的仙人掌低聚糖在制备具有抗氧化活性的药物、食品中的应用。
35.本发明提供的发酵制备方法工艺简单、成本低、提取率高，产品仙人掌低聚糖抗氧化活性好，具有良好的工业化应用前景。
36.本发明筛选出的植物乳杆菌lp-ics22能够高效发酵仙人掌汁，其特异性糖苷酶降解仙人掌中的多糖，使其分子量减小，溶解度增加，抗氧化活性增加。
37.另外利用植物乳杆菌lp-ics22生长中对蛋白质的降解吸收作用，降低了仙人掌浆汁中的蛋白质含量，提高仙人掌低聚糖纯度，减少有机试剂的使用，降低生产成本。
附图说明
38.图1为植物乳杆菌lp-ics22菌落及显微照片，其中：右图为植物乳杆菌lp-ics22菌落形态照片，左图为植物乳杆菌lp-ics22革兰染色后的在油镜下(1000
×
)的显微形态照片。
39.图2为实施例1的仙人掌低聚糖的发酵过程参数测定，其中：a)图为植物乳杆菌lp-ics22生长曲线图，b)图为发酵液ph值的变化曲线图，c)图为发酵液总糖含量变化曲线图，d)图为发酵液还原糖含量变化曲线图。
40.图3为试验例1所测的实施例1的仙人掌低聚糖和对照仙人掌多糖的抗氧化活性图。
具体实施方式
41.下面结合附图及具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的操作方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
42.发明人通过以下方法筛选得到植物乳杆菌lp-ics22菌株：
43.步骤1，新鲜仙人掌片切块后与fj缓冲盐液混合，fj缓冲盐液包含0.1g/l(nh4)2so4，0.1g/l kh2po4，0.2g/l nacl，0.02g/l mgso4，且ph调节至5.5～6.5，所得混合物中仙人掌质量百分含量为20％～50％，进行破碎打浆处理，37℃发酵48h，然后梯度稀释仙人掌发酵液，稀释梯度为10-1
、10-2
、10-3
、10-4
、10-5
、10-6
。将10-4
、10-5
、10-6
稀释液取100μl涂布于mrs培养基平板上，37℃培养48h，挑取单菌落得到分离菌株。
44.步骤2，将步骤1得到的分离菌株接种至2ml无菌的仙人掌汁培养基(含50wt％破碎的仙人掌及50wt％的所述fj缓冲盐液)中，37℃振荡培养24h，制备成发酵液。
45.步骤3，将步骤2中发酵液13000rpm离心2min，使用硫酸苯酚法及dns法测定上清液中的总糖及还原糖含量，筛选出还原糖含量最高的菌株，得到lp-ics22菌株。
46.生物学鉴定：
47.于mrs培养基上划线培养24h获取植物乳杆菌lp-ics22菌株单菌落(参见图1中右图)。挑取细菌进行革兰染色，在油镜(1000
×
)下进行观察(参见图1中左图)。植物乳杆菌lp-ics22菌株的菌落圆形，有光泽，凸起，乳白色。格兰染色阳性，短杆状，细菌单个偶成对。
48.分子生物学鉴定：
49.使用细菌基因组提取试剂盒提取lp-ics22菌株的基因组dna，通过27f(seq id no：1)及1492r(seq id no：2)引物进行pcr获取lp-ics22菌株16s rdna的序列，将其回收连接至t载体上，送至测序公司进行基因测序。将获得的16s rdna的序列(seq id no：3)在ncbi数据库进行blast序列比对，通过进化树分析比对确认其为植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)，保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏日
期为2022年5月11日，保藏地址为中国湖北省武汉市武昌区八一路299号，菌种保藏号为cctcc no：m 2022604。
50.实施例1 利用植物乳杆菌lp-ics22发酵制备仙人掌低聚糖
51.(1)取600g仙人掌切块，加入至2l fj缓冲盐液(ph＝6.5)中，使用破壁机进行打浆处理。fj缓冲盐液含有0.1g/l(nh4)2so4，0.1g/l kh2po4，0.2g/l nacl，0.02g/l mgso4。
52.(2)将步骤(1)得到的浆汁转移至5l发酵罐中，在105℃条件下杀菌15min。
53.(3)将冻存植物乳杆菌lp-ics22菌液划线于mrs固体平板上，37℃培养24h。待长出单菌落后，挑取细菌接种至5ml mrs液体培养基中，200rpm、37℃振荡培养24h。将所得菌液转移至100ml mrs液体培养基中，200rpm、37℃振荡培养，当菌液od600达到0.6～08时，即为活化菌液。
54.将活化后的植物乳杆菌lp-ics22菌液按5％(v/v)的比例接种至步骤(2)的浆汁中。将发酵参数设置为：溶氧量40％、转速200rpm、温度37℃，通气发酵72h。分别于0、3、6、9、12、24、36、48、72h收集发酵液，分别检测发酵液中细菌浓度(图2a)、发酵液ph(图2b)、发酵液总糖含量(图2c)和发酵液还原糖含量(图2d)。
55.(4)将步骤(3)发酵液取出，5000rpm离心10min，取上清液浓缩至料液比为1:6(v/v)，加入无水乙醇至乙醇浓度为80％(v/v)，4℃静置12h后，收集沉淀物。
56.(5)将步骤(4)沉淀物溶解于100ml蒸馏水中，加热浓缩后收集所有糖液进行喷雾干燥，获取仙人掌低聚糖粉末。高效凝胶渗透色谱系统(hpgpc)测定仙人掌低聚糖平均分子量约为1300da。
57.实施例2 利用植物乳杆菌lp-ics22发酵制备仙人掌低聚糖
58.(1)取600g仙人掌切块，加入至2l fj缓冲盐液(ph＝6.0)中，使用破壁机进行打浆处理。fj缓冲盐液含有0.1g/l(nh4)2so4，0.1g/l kh2po4，0.2g/l nacl，0.02g/l mgso4。
59.(2)将步骤(1)得到的浆汁转移至5l发酵罐中，在100℃条件下杀菌30min。
60.(3)将冻存植物乳杆菌lp-ics22菌液划线于mrs固体平板上，37℃培养24h。待长出单菌落后，挑取细菌接种至5ml mrs液体培养基中，200rpm、37℃振荡培养24h。将所得菌液转移至100ml mrs液体培养基中，200rpm、37℃振荡培养，当菌液od600达到0.6～08时，即为活化菌液。
61.将活化后的植物乳杆菌lp-ics22菌液按10％(v/v)的比例接种至步骤(2)的浆汁中。将发酵参数设置为：溶氧量40％、转速150rpm、温度37℃，通气发酵24h。
62.(4)将步骤(3)发酵液取出，5000rpm离心10min，取上清液浓缩至料液比为1:6(v/v)，加入无水乙醇至乙醇浓度为80％(v/v)，4℃静置12h后，收集沉淀物。
63.(5)将步骤(4)沉淀物溶解于100ml蒸馏水中，加热浓缩后收集所有糖液进行喷雾干燥，获取仙人掌低聚糖粉末。高效凝胶渗透色谱系统(hpgpc)测定仙人掌低聚糖平均分子量约为1500da。
64.实施例3 利用植物乳杆菌lp-ics22发酵制备仙人掌低聚糖
65.(1)取900g仙人掌切块，加入至3l fj缓冲盐液(ph＝6.0)中，使用破壁机进行打浆处理。fj缓冲盐液含有0.1g/l(nh4)2so4，0.1g/l kh2po4，0.2g/l nacl，0.02g/l mgso4。
66.(2)将步骤(1)得到的浆汁转移至5l发酵罐中，在105℃条件下杀菌20min。
67.(3)将冻存植物乳杆菌lp-ics22菌液划线于mrs固体平板上，37℃培养24h。待长出
单菌落后，挑取细菌接种至5ml mrs液体培养基中，200rpm、37℃振荡培养24h。将所得菌液转移至100ml mrs液体培养基中，200rpm、37℃振荡培养，当菌液od600达到0.6～08时，即为活化菌液。
68.将活化后的植物乳杆菌lp-ics22菌液按8％(v/v)的比例接种至步骤(2)的浆汁中。将发酵参数设置为：溶氧量40％、转速150rpm、温度37℃，通气发酵48h。
69.(4)将步骤(3)发酵液取出，5000rpm离心10min，取上清液浓缩至料液比为1:6(v/v)，加入无水乙醇至乙醇浓度为80％(v/v)，4℃静置12h后，收集沉淀物。
70.(5)将步骤(4)沉淀物溶解于100ml蒸馏水中，加热浓缩后收集所有糖液进行喷雾干燥，获取仙人掌低聚糖粉末。高效凝胶渗透色谱系统(hpgpc)测定仙人掌低聚糖平均分子量约为1400da。
71.试验例1 仙人掌低聚糖抗氧化活性检测
72.使用实施例1所制备的仙人掌低聚糖配制为1mg/ml的水溶液，作为对照的仙人掌多糖(1mg/ml)采用传统水提醇沉法处理仙人掌片获取。利用碧云天总抗氧化能力检测试剂盒(abts法)检测其总抗氧化能力，利用碧云天总sod活性检测试剂盒(nbt法)检测其超氧自由基清除能力，使用索莱宝dpph自由基清除能力检测试剂盒检测其dpph自由基清除能力，使用索莱宝羟自由基清除能力检测试剂盒检测其羟自由基清除能力。如图3所示，植物乳杆菌lp-ics22发酵所得仙人掌低聚糖能够显著的降低各种自由基的浓度，具有良好的抗氧化活性。
73.此外应理解，在阅读了本发明的上述描述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本技术所附权利要求书所限定的范围。