一种嗜酸乳杆菌株及其应用

1.本发明涉及生物技术领域，更具体的说是涉及一种嗜酸乳杆菌株及其应用。


背景技术：

2.乳房炎是奶山羊养殖中较为常见并且危害最为严重的疫病，它不仅给奶山羊养殖业造成严重的经济损失，也增加了羊奶及羊奶产品的食品安全问题。引起奶山羊乳房炎的因素多种多样，其中乳腺中大量致病菌的生长繁殖是引发该病的一个重要因素。尤其对于隐性乳腺炎，据流行病学调查显示，我国陕西、山东、云南等地奶山羊隐性乳房炎的平均检出率高达43.7％，其主要病原菌包括凝固酶阴性葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、蜡样芽孢杆菌和链球菌等。同时，有研究表明在临床乳房炎中也分离到金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、链球菌、蜡样芽孢杆菌。乳中的微生物菌群结构紊乱以及致病菌的大量繁殖可能是造成乳房炎的直接因素。因此，对乳腺中病原菌的生长繁殖进行抑制或清除是治疗奶山羊乳房炎的关键所在。
3.抗菌药物的使用一直是预防和治疗乳房炎的主要方法，但是由于缺乏对疾病的深入认知以及科学的用药指导，大量抗生素轮番长期使用，此法虽短期有效，但长期使用会导致越来越多耐药菌株出现，治疗效果不理想。同时有研究表明，抗生素的滥用也使羊的肠道微生物菌群紊乱，极大的降低了机体的免疫防御功能，导致更多条件致病微生物引发各种疾病。此外，接种疫苗也是预防奶山羊乳房炎的一种方式，现有的包括葡萄球菌疫苗、大肠杆菌疫苗和多价苗等，这些疫苗均能有效抑制由于特定病原菌引起的乳房炎。但由于菌株的变异，也会出现免疫逃逸现象。
4.因此，能否开发一种新的抗菌制剂，有效的解决上述技术问题，是本领域技术人员亟需解决的问题。


技术实现要素：

5.有鉴于此，本发明提供了一种嗜酸乳杆菌株及其应用。针对目前奶山羊乳房炎治疗过程中存在的问题，提供一种以嗜酸乳杆菌为有效成分，能够有效抑制奶山羊乳房炎常见致病菌金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌、大肠杆菌的生长繁殖。为奶山羊乳房炎的治疗提供了一个新思路。
6.嗜酸乳杆菌(lactobacillus acidophilus)202211保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。保藏编号：cgmcc no.24772；保藏日期2022年04月26日。
7.为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
8.一种嗜酸乳杆菌株，菌株为嗜酸乳杆菌(lactobacillus acidophilus)202211，保藏编号为cgmcc no.24772。
9.本发明还提供了一种抗菌制剂，包括菌株为嗜酸乳杆菌202211，保藏编号为cgmcc no.24772。
10.本发明还提供了一种发酵方法，使用上述的嗜酸乳杆菌株为嗜酸乳杆菌202211，保藏编号为cgmcc no.24772。
11.本发明还提供了一种畜牧养殖方法，使用嗜酸乳杆菌202211作为抗菌剂施用，保藏编号为cgmcc no.24772。
12.本发明还提供了上述的一种嗜酸乳杆菌株在制备药品中的应用。
13.优选的：药品为兽药。
14.优选的：药品为治疗奶山羊乳房炎的兽药。
15.经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种嗜酸乳杆菌株及其应用，取得的技术效果为利用嗜酸乳杆菌培养物中的抗菌成分，如过氧化氢、细菌素或有机酸等，改变致病菌所在的微环境并抑制致病菌的生长。此外，也为奶山羊乳房炎的临床治疗提供了新的思路和参考依据。
附图说明
16.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
17.图1附图为本发明提供的分离菌株的菌落形态特征图，其中图a为纯化前菌落；图b为纯化后菌落。
18.图2附图为本发明提供的分离菌株的核酸凝胶电泳结果图，其中m-dl 2000marker；1-阴性对照；2-样品。
19.图3附图为本发明提供的分离菌株的16s rrna序列系统进化树图。
20.图4附图为本发明提供的致病菌的菌落形态特征图，其中，a-金黄色葡萄球菌；b-大肠杆菌；c-蜡样芽孢杆菌。
21.图5附图为本发明提供的致病菌的核酸凝胶电泳结果图，其中，a-金黄色葡萄球菌；b-大肠杆菌；c-蜡样芽孢杆菌。
22.图6附图为本发明提供的乳酸菌培养上清的体外抑菌结果图，其中，s.aureus-金黄色葡萄球菌；e.coli-大肠杆菌；b.cereus-蜡样芽孢杆菌；control-mrs培养基(ph＝5.0)；16h-嗜酸乳杆菌培养16h上清；36h-嗜酸乳杆菌培养36h上清。
具体实施方式
23.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
24.本发明实施例公开了一种嗜酸乳杆菌株及其应用。
25.菌株来源：嗜酸乳杆菌是采自青海省某羊厂粪便样品，预处理后进行菌株的筛选、纯化、分离培养和鉴定。金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌、大肠杆菌由本实验室分离鉴定保存。
26.其中，嗜酸乳杆菌株保藏信息：
27.嗜酸乳杆菌(lactobacillus acidophilus)202211保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。保藏编号：cgmcc no.24772；保藏日期2022年04月26日。
28.实验材料：mrs培养基购自青岛高科技工业园海博生物科技有限公司；细菌基因组dna提取试剂盒购自天根生化科技有限公司；tryptone、yeast extract购自thermofisher；、琼脂购自biofrox、nacl购自萍乡市白狮化学试剂有限公司。
29.引物序列表如表1所示，pcr反应体系如表2所示；
30.表1pcr引物序列
[0031][0032]
表2pcr反应体系
[0033][0034]
实施例1
[0035]
乳酸菌的分离鉴定
[0036]
取粪便样品5g于含有50ml高压灭菌生理盐水的锥形瓶中，溶解混匀；以灭菌的生理盐水进行10倍倍比稀释；将合适浓度的液体均匀涂布在mrs固体培养基上(含2％caco3)，倒置于37℃条件下进行厌氧培养。挑选培养皿中具有钙溶圈，圆形凸起，表面光滑，乳白色的可疑乳酸菌单菌落(图1)，接种于无菌的mrs液体培养基中，37℃进行厌氧培养。重复进行细菌的克隆纯化培养，将培养好的菌液与灭菌的50％的甘油1：1混匀后，做好标记，保存于超低温冰箱备用。根据细菌基因组dna提取试剂盒说明书提取细菌总dna。以提取的细菌dna为模板，使用细菌16s rrna通用引物进行基因扩增，于pcr仪进行目的片段的克隆，pcr反应条件如表3所示，将pcr产物进行1％琼脂凝胶电泳检测，符合预期结果后将产物进行测序鉴定(图2)。将测序结果用blast与genbank数据库中已知的菌株进行同源性比对，并进行物种进化分析，以确定菌株种属(图3)。结果显示分离菌株为嗜酸乳杆菌，进行保藏。
[0037]
表3pcr反应条件
[0038][0039]
实施例2
[0040]
乳酸菌对致病菌的抑菌效果
[0041]
将实验室分离鉴定保存的乳房炎致病菌金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和蜡样芽孢杆菌进行细菌复苏并接种于lb固体培养基培养(图4)。挑取菌落提取细菌dna，使用三种不同细菌的特异性引物进行基因扩增，于pcr仪进行目的片段的克隆，pcr反应条件如表4所示，将pcr产物进行1％琼脂凝胶电泳检测，结果显示金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和蜡样芽孢杆菌分别于227bp、468bp和91bp处有特异性条带(图5)。
[0042]
将实施例1得到的嗜酸乳杆菌在37℃厌氧条件下分别培养16h和36h，并以5000r/min离心20min后，取上清液，用0.22μm滤膜过滤备用。将金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和蜡样芽孢杆菌接种于液体lb培养基中培养12h后，取100μl加到6ml的无菌lb液体培养基中。同时实验组加入1ml的嗜酸乳杆菌培养上清，对照组加入1ml的mrs培养基。置于37℃条件下培养12h后，以无菌生理盐水进行十倍倍比稀释，选择合适浓度涂布于lb固体培养基中，37℃条件下培养12h后观察。
[0043]
结果显示，与对照组相比，嗜酸乳杆菌厌氧培养36h后的上清液对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和蜡样芽孢杆菌均具有较好的抑菌作用(图6)。
[0044]
表4pcr反应条件
[0045][0046]
实施例3
[0047]
一种抗菌制剂，包括菌株为嗜酸乳杆菌202211，保藏编号为cgmcc no.24772。可根据剂型加入常规辅料。
[0048]
实施例4
[0049]
一种发酵方法，使用嗜酸乳杆菌株为嗜酸乳杆菌202211，保藏编号为cgmcc no.24772。进行发酵培养；发酵方式可为常规发酵方法。
[0050]
实施例5
[0051]
一种畜牧养殖方法，使用嗜酸乳杆菌202211，保藏编号为cgmcc no.24772作为抗菌剂施用。
[0052]
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
[0053]
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。