Claudin18.2单克隆抗体及其制备方法和用途与流程

claudin 18.2单克隆抗体及其制备方法和用途
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，特别是涉及claudin 18.2单克隆抗体及其制备方法和用途。


背景技术：

2.claudin 18.2蛋白是位于细胞膜上的一个跨膜蛋白，在多种肿瘤尤其是消化系统肿瘤及其转移瘤中发现高表达。近年来，其特异性抗体claudiximab(zolbetuximab/imab362)在最新的临床试验中取得了显著的成功，claudin 18.2蛋白有望成为某些特定恶性肿瘤靶向治疗的分子靶点。但是目前市场上没有western blot用途的可以用于小鼠和大鼠样本的claudin 18.2的鼠源单克隆抗体。


技术实现要素：

3.鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种claudin 18.2单克隆抗体及其制备方法和用途，填补现有技术的空白。
4.本发明一方面提供了杂交瘤细胞株hoo57-claudin 18.2,保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：cgmcc no.45150。
5.本发明另一方面提供通过上述杂交瘤细胞株hoo57-claudin 18.2分泌产生的claudin18.2单克隆抗体。
6.进一步地，所述claudin 18.2单克隆抗体为igg1。
7.本发明另一方面提供claudin 18.2单克隆抗体在用于制备检测样品中claudin 18.2的制剂中用途。
8.进一步地，所述检测是为免疫印迹法或者免疫组化分析法。
9.本发明另一方面提供了一种检测样品中claudin 18.2的试剂盒，所述试剂盒中含有上述claudin 18.2单克隆抗体。
10.本发明另一方面提供了上述claudin 18.2单克隆抗体的制备方法，所述方法包括以下步骤：
11.1)提供免疫原：采用氨基酸序列如seq id no.1所示的多肽作为免疫原并与载体蛋白交联获得交联免疫原；
12.2)制备杂交瘤细胞：用交联的免疫原免疫动物，取免疫动物的脾脏与小鼠骨髓瘤细胞融合制备杂交瘤细胞并培养；
13.3)制备单克隆抗体：将杂交瘤细胞，打入小鼠腹腔内，从腹水中提取单克隆抗体。
14.进一步地，所述seq id no.1所示的多肽经过进一步修饰获得述seq id no.2所示的多肽，将seq id no.2所示的多肽与载体蛋白交联。
15.进一步地，载体蛋白为匙孔血蓝蛋白(klh)或牛血清白蛋白(bsa)。
16.进一步地，所述交联免疫原n端通过交联剂将其巯基与载体蛋白氨基共价交联。
17.进一步地，所述交联免疫原与免疫佐剂混合乳化后，在小鼠背部通过多点皮下注
射，并经二次以上加强免疫，血清的效价大于1∶20000。
18.进一步地，所述提取单克隆抗体的方法为现有技术，本领域技术人员可以通过现有知识知晓如何提取。
19.进一步地，所述方法包括步骤4)对单克隆抗体进行纯化。
20.进一步地，所述纯化包括蛋白g亲和纯化以及肽亲和纯化。
21.如上所述，本发明的claudin 18.2单克隆抗体及其制备方法和用途，具有以下有益效果：
22.本发明提供的claudin 18.2单克隆抗体能够有效的识别claudin 18.2。
23.细胞名称：杂交瘤细胞
24.保藏时间：2022年04月29日
25.保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
26.保藏编号：cgmcc no.45150
27.保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
附图说明
28.图1为western blot图，泳道b检测的约17kda的条带即为claudin 18.2蛋白信号。
具体实施方式
29.多肽，其序列为：tqdlynnpvt(seq id no.1)。用此多肽制备的抗claudin 18.2单克隆抗体可以在免疫印迹(western blot)及免疫组化(ihc)分析中特异识别组织或细胞中的天然claudin 18.2蛋白。抗claudin 18.2抗体是通过以下步骤获得的：
30.步骤一：多肽序列的分析和设计：利用abdesigner软件对claudin 18.2蛋白的氨基酸序列进行抗原表位分析，主要评估亲水性，抗原性，表面可能性，柔性区等指数，再结合过去制备抗体的实际经验，最终确定claudin 18.2蛋白32-42位10个氨基酸作为合成多肽氨基酸序列，序列为tqdlynnpvt(seq id no.1)。
31.步骤二：多肽合成和交联：利用act396全自动多通道多肽合成仪合成目的多肽，并采用质谱进行鉴定；
32.为增强多肽的抗原性，将claudin 18.2多肽与载体蛋白klh采用sulfo-smcc交联法进行交联。
33.步骤三：多肽免疫和杂交瘤的制备：将交联后的claudin 18.2-klh与弗氏佐剂混合乳化，在balb/c小鼠背部进行皮内注射免疫，并反复加强免疫，至取血检测抗体效价达到标准时加强免疫。
34.步骤四：：杂交瘤制备：加强免疫三天后处死小鼠，取脾脏研磨，与小鼠骨髓瘤细胞按10：1比例混合，peg融合。依次用hat与ht培养基进行培养，有限稀释法得到单克隆，用间接elisa放检测上清od值，挑选高od值的单克隆细胞株细胞株，扩大培养。
35.步骤五：制备腹水：balb/c小鼠腹腔注射灭菌石蜡油，7天后向腹腔注射制备好的杂交瘤。7天待小鼠腹部隆起，抽取小鼠腹水。
36.步骤六：抗体纯化：分离小鼠腹水，采用protein a纯化全抗体后，进一步采用肽亲和纯化，得到目标抗体。
37.抗claudin 18.2单克隆抗体是通过以下步骤鉴定的：将所获得的claudin 18.2抗体作为一抗，采用标准的免疫印迹方法用于检测抗原，确认该抗体能够与变性后的天然claudin18.2蛋白相互作用。
38.以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。须知，下列实施例中未具体注明的工艺设备或装置均采用本领域内的常规设备或装置。此外应理解，本发明中提到的一个或多个方法步骤并不排斥在所述组合步骤前后还可以存在其他方法步骤或在这些明确提到的步骤之间还可以插入其他方法步骤，除非另有说明；还应理解，本发明中提到的一个或多个设备/装置之间的组合连接关系并不排斥在所述组合设备/装置前后还可以存在其他设备/装置或在这些明确提到的两个设备/装置之间还可以插入其他设备/装置，除非另有说明。而且，除非另有说明，各方法步骤的编号仅为鉴别各方法步骤的便利工具，而非为限制各方法步骤的排列次序或限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容的情况下，当亦视为本发明可实施的范畴。
39.实施例
40.1)多肽序列的分析和设计
41.利用abdesigner软件对claudin 18.2蛋白的氨基酸序列进行抗原表位分析，主要评估亲水性，抗原性，表面可能性，柔性区等指数，再结合过去制备抗体的实际经验，考虑氨基酸结构复杂程度，易氧化程度，合成难度，氨基酸类别和分布等，最终确定claudin 18.2蛋白32-42位10个氨基酸作为合成多肽氨基酸序列，序列为tqdlynnpvt(seq id no.1)。同时，为保证后期多肽交联载体蛋白以及肽亲和纯化，在n末端增加一个半胱氨酸c，最终待合成多肽序列为ctqdlynnpvt(seq id no.2)
42.2)多肽合成和交联
43.合成：act396全自动多通道多肽合成仪，按照编制好的程序自动合成目的多肽，将合成后的多肽溶于50％乙睛，采用质谱仪进行鉴定，确认所获得的多肽为目的多肽。
44.交联：sulfo-smcc作为交联剂将载体蛋白klh与合成多肽进行交联：取10mg klh溶于0.5ml超纯水中；取3mg sulfo-smcc溶于0.5ml超纯水中，用3m naoh调ph值7左右。在混匀情况下，把sulfo-smcc溶液逐滴缓慢加入klh溶液中，室温下旋转混匀反应物30min。将反应好的sulfo-smcc/klh混合液上样到预先用平衡缓冲液(0.05m pb，ph6.0)平衡过30min的sephadex g25柱中，收集浅灰色洗脱液，即活化的sulfo-smcc/klh溶液。用200ul pbs(ph7.3)溶解2mg交联多肽，把0.2体积的sulfo-smcc/klh复合物溶液加入到多肽溶液中，调ph值到7.3，室温振摇4小时，-70℃冷冻后，用冻干机冻干24小时后备用。通过ellman法检测交联前后多肽巯基确定多肽交联效率，偶联率为98.4％。
45.3)多肽免疫和抗血清制备
46.将交联好的klh-多肽100μg溶于100μl磷酸缓冲液(0.01m pbs)中，加入等体积弗氏完全佐剂充分乳化(至在水中不扩散为准)。采用鼠龄6周，体重20-25g的健康balb/c小鼠进行免疫，进行背部皮内注射免疫，至少要注射3点以上。首次免疫2周后，将100μg多肽溶于100μl磷酸缓冲液(0.01m pbs)中，与等量的弗氏不完全佐剂充分乳化后进行皮内免疫，作
为第一次加强免疫，要求背部皮内注射免疫，至少要注射3点以上。第二次免疫2周后，进行第二次加强免疫，方法和要求同第一次加强免疫。1周后，取尾血，用未交联的合成多肽包被酶标板，间接elisa法检测免疫血清效价。重复加强免疫和效价测定，直至血清效价达到1∶10000以上。效价达到要求后，取100ug多肽溶于0.5ml磷酸缓冲液(0.01m pbs)中，腹腔注射，作为加强免疫。
47.4)杂交瘤细胞制备
48.(1)细胞融合：加强免疫三天后小鼠眼球取血，处死小鼠。75％酒精浸泡消毒，超净工作台内取小鼠脾脏，200目钢筛研磨，加dmem定容至10ml。用吸管吹打研磨下来的脾脏，使其分散成单个细胞。取10ul混合液计数，算出脾细胞总数。按骨髓瘤细胞：脾细胞1:10加入对应量的骨髓瘤细胞，混合均匀，1000r/min离心5分钟并弃上清。轻弹混合后的细胞使其松弛分散，并置于37℃水温的水浴锅中。用吸管加入1ml peg1500，边加边搅动，1min完成。继续搅拌1min，轻轻搅起peg，静置90s。加入1ml无血清dmem，边加边搅拌，搅起peg，中止反应。加入40ml无血清dmem，边加边搅动，1000rpm/min离心5min，洗掉peg，并弃上清。
49.(2)细胞培养筛选：用2ml融合细胞培养液轻轻将底部融合细胞吹起，并且用hat培养液(hat溶于含15％小牛血清的dmem)定容到50ml。平均分配到已经含有饲养细胞的96孔板中，100μl/孔。5天后将96孔板里面的上清弃掉，换成新配制的hat培养液(hat溶于含15％小牛血清的dmem)。换液3天后，每孔取100ul上清放入已经包好抗原的elisa板上，用间接elisa法检测上清阳性值。取阳性值高的孔更换hat培养液，一天后复检。复检阳性孔用ht培养液(ht溶于含15％小牛血清的dmem)进行有限稀释，平均分配到已经含有饲养细胞的96孔板中，100μl/孔。一个星期后检测孔板阳性值，取阳性高的单克隆用含15％小牛血清的dmem进行亚克隆。当阳性单克隆亚克隆后，孔板上清的阳性率达到100％，取孔板阳性值高、细胞团面积大的细胞株扩大培养，并且将获得的杂交瘤细胞送至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号：cgmcc no.45150。
50.5)单克隆抗体的制备
51.于打细胞前一周，取3只健康8周龄balb/c雌鼠，每只腹腔注射1ml石蜡油。待细胞处于对数期，将细胞瓶里的细胞吹下来计数，取3*106个细胞，装入离心管中1000r/min离心5min。弃掉上清，加入5ml灭菌的磷酸缓冲液(0.01m pbs)，用移液枪吹散细胞，补30ml磷酸缓冲液(0.01m pbs)，1000r/min离心5min。向离心管中加3ml磷酸缓冲液(0.01m pbs)，混合均匀，每只小鼠腹腔注射1ml混合液。注射一周后，断颈处死小鼠，75％酒精浸泡消毒，用剪刀剪开腹部上皮，注射器插入腹腔挑起腹腔膜，吸取腹水至离心管中，3500r/min离心5min。收集上清，与结合缓冲溶液按1:1混合，0.45um滤头过滤。
52.6)抗体亲和纯化
53.(1)igg纯化：用液器将50％的protein-a sepharose混悬液10ml加到30ml层析柱中，去掉顶盖和底帽，液体流出后的柱床体积即为5ml，然后用25ml去离子水冲洗3遍。取出对应的血清10ml，与2ml pbs混合后加入30ml层析柱中，旋转混合器上室温(20-25℃)混旋1小时，让血清样品流出。再用20ml纯化洗液洗层析柱3次，加入10ml洗脱液进行洗脱。
54.(2)肽亲和纯化：在层析柱中加入1ml sulfo-link凝胶悬液(0.5ml凝胶)，待柱内液体流干，用4ml偶联缓冲液冲洗层析柱。用1ml偶联缓冲液溶解合成的claudin 18.2多肽，并加入层析柱，再加入1ml偶联缓冲液至层析柱中，室温颠倒混匀1小时。用6ml偶联缓冲液
冲洗层析柱，然后加入3ml封闭液，室温混匀1小时。冲洗层析柱3次，然后向层析柱内加入6ml igg及3ml pbs，室温颠倒混匀1小时。用pbs冲洗层析柱3次，然后用2ml洗脱液洗脱。将所获得的纯化抗体装入透析袋内4℃透析。透析过夜，然后4000rpm
×
35min离心除沉淀，收集上清。用间接elisa法测定抗体效价效价为1：32000并用bradford法测定蛋白浓度，浓度为1.023mg/ml。
55.7)免疫印迹分析
56.按照标准方法配制sds-page凝胶，将5μl蛋白浓度为5mg/ml的裂解液依次加样，恒压80v约30分钟，待样品跑过浓缩胶基本呈一条直线时，改换160v电压，电泳至溴酚蓝指示剂完全跑出分离胶(约60分钟)时终止电泳，采用电转膜方法恒压100v电转80分钟转膜至pvdf膜。将所获得的claudin 18.2抗体作为一抗，采用浓度为1.25μg/ml与上述转膜得到的抗原在室温下杂交1小时，然后用hrp标记的羊抗兔抗体在室温下杂交1小时，采用ecl显色法进行显色，在暗室中用x片进行显色和曝光，得到免疫印迹结果如图1。
57.结果表明：制备获得的claudin 18.2单克隆抗体能够有效的识别claudin 18.2。
58.以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法、组合物的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。