抗炎CD209多肽片段及其抗脂肪性肝病炎症的应用

抗炎cd209多肽片段及其抗脂肪性肝病炎症的应用
技术领域
1.本发明涉及生物工程技术领域，涉及cd209蛋白的一段活性多肽片段的构建及其抗脂肪性肝病炎症及损伤的活性，具体是明确一种cd209的胞内多肽片段的表达及其应用于脂肪性肝病的靶向治疗。


背景技术：

2.代谢相关脂肪性肝病(简称脂肪性肝病)是我国第一大慢性肝病，占所有慢性肝病的50％。其主要包括单纯性脂肪肝和脂肪性肝炎，在发病后期由于肝脏炎症可导致肝细胞损伤和死亡，进而引发肝脏组织纤维化和肝癌发生，严重威胁患者健康。脂肪性肝病在我国高发，发病总人数超过2亿，并且随国民经济和营养水平的提高依然处于快速增长之中。脂肪性肝病的发病机制复杂，其中慢性炎症在促进肝脏脂肪蓄积和炎性损伤中发挥核心作用。在脂肪性肝病发生过程中，固有免疫细胞如巨噬细胞和kupffer细胞等可发生活化，并促进其表面toll-样受体(toll-likereceptor,tlr)通路活化进而释放促炎细胞因子，如tnf-α、il-1β和il-6等，改变肝脏中的糖脂代谢并触发肝细胞损伤，从而介导肝脏中脂肪蓄积和脂肪肝炎的发生。因此，抑制肝脏中慢性炎症的发生可改善脂肪性肝病的病理进程，防止肝脏炎性病变及肝纤维化和肝癌的发生。
3.脂肪性肝病发病过程中，巨噬细胞是一类至关重要的炎症调控细胞。正常条件下，巨噬细胞即有促组织炎症和免疫发生功能，也可发挥免疫抑制和耐受活性，这与其活化的表面受体和信号通路存在密切的联系。我们近期通过研究发现抗炎受体分子cd209特异性表达于肝脏巨噬细胞中，并且在脂肪性肝病发生过程中呈现明显的表达下调，cd209的表达可显著抑制巨噬细胞中促炎免疫受体tlr4的表达，从而抑制巨噬细胞的促炎功能，并增强其免疫抑制活性。


技术实现要素：

4.本发明利用基因重组技术构建一段cd209活性多肽片段。本多肽片段可有效清除巨噬细胞中促炎受体tlr4的表达，从而抑制巨噬细胞中多种促炎细胞因子的分泌，进而减轻肝细胞的脂肪蓄积和炎性死亡。本发明可以为脂肪性肝病的抗炎治疗提供有效的靶向治疗多肽，为脂肪性肝病临床治疗提供新的生物靶向药物。
5.本发明提供了如下技术方案：一种cd209的活性多肽片段的构建序列，其cdna序列和表达的多肽氨基酸序列：
6.1gplvlqllsftllagllvqv
7.21skvpssisqeqsrqdaiyqn
8.41ltqlkaavgelseksklqei
9.61yqeltqlkaavgelpekskl
10.81qeiyqeltrlkaavgelpek
11.101sklqeiyqeltwlkaavgel
12.编码cdna序列：
13.1gggccgctcgttttgcaactgctcagttttaccttgttggctgggcttcttgttcaggtc
14.61agtaaagtacctagtagcataagtcaagagcagagtaggcaagacgctatctatcaaaat
15.121cttactcagctcaaagcggcagtgggcgagttgtctgaaaagtccaaactgcaagaaatt
16.181taccaggaattgactcagctcaaggccgctgttggcgagcttccagagaagtctaaactg
17.241caggaaatataccaagaactcacgaggctcaaggctgccgtgggggaacttccagaaaag
18.301tctaaacttcaagaaatttaccaagaactgacttggctgaaagcggctgtgggggagctt
19.作为本发明的另一方面，本发明提供一种cd209活性多肽片段的表达方法，其包括，利用全基因合成技术合成cd209活性多肽的编码cdna序列，并在限制性内切酶酶切后与线性化的pcdna-flag真核表达载体利用t4连接酶连接，获得重组cd209活性多肽表达质粒；将上述获得的重组质粒转染肝脏分离获得的巨噬细胞。
20.作为本发明所述的cd209活性多肽片段的表达方法的优选方案，其中：所述限制性内切酶包括bamhi、xhoi中的一种或几种。
21.作为本发明所述的cd209活性多肽片段的表达方法的优选方案，其中：所述巨噬细胞为从人外周血分离的巨噬细胞。
22.作为本发明所述的cd209活性多肽片段的表达方法的优选方案，其中：所述转染，将2μg的cd209多肽片段载体与4μl的fugene脂质体试剂及100μlopti-mem培养基混合并孵育15分钟，进而加入至1
×
106巨噬细胞中，并通过2000rpm离心60min转染，转染cdc42多肽表达载体36小时后，检测多肽表达。
23.本发明的有益效果：
24.本发明利用生物工程技术，将一段多肽对应的cdna编码序列克隆至pcdna-flag真核表达载体中。通过pcr和dna测序分析证明重组克隆构建成功，并将此真核表达载体转染到巨噬细胞中细胞，通过免疫印迹明确多肽的表达，证明了多肽可在巨噬细胞中发挥功能。进而利用多种功能手段分析其对巨噬细胞介导的肝脏炎症的抑制作用。在细胞生物学层面证明了此多肽具有拮抗巨噬细胞介导的炎症和抑制肝细胞的脂肪蓄积和炎性死亡的重要活性。
附图说明
25.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：
26.图1为脂肪性肝病组织相比于正常肝组织中cd209发生明显表达下调；
27.图2为肝组织中cd209主要表达于巨噬细胞中；
28.图3为cd209活性多肽片段在巨噬细胞中的转染；
29.图4为cd209活性多肽片段抑制巨噬细胞中tlr4表达；
30.图5为cd209活性多肽片段抑制巨噬细胞中促炎细胞因子表达(**，p《0.01，相比于对照组)；
31.图6为cd209活性多肽片段转导可以抑制肝细胞的脂肪蓄积和炎性死亡(**，p《
0.01，相比于对照组)。
具体实施方式
32.如图1所示，脂肪性肝病组织相比于正常肝组织中cd209发生明显表达下调。
33.从临床获得活检的正常和脂肪性肝病组织各100mg，加入1ml的组织裂解液后在石英匀浆器中充分匀浆，随后小心将匀浆后的样品转移至1.5ml的ep管中，并在13 000g、4℃中离心15min，将上清液利用bca法进行蛋白定量，并取材等量的总蛋白样品加入5
×
上样缓冲液，煮沸5min。将煮沸后的样品各上样40μg至12％sds-page中进行分离，分离结束后，将蛋白样品转膜至pvdf膜中，利用含5％脱脂牛奶的tbst封闭1小时，进而加入1:1000的抗cd209及抗内参蛋白gapdh抗体过夜孵育，利用tbst洗涤3次，每次5分钟；加入1:10000的辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠二抗孵育30分钟，并利用ecl法显影获得的结果。结果表明cd209在脂肪性肝病组织中呈现明显的表达下调(图1)。
34.如图2所示肝组织中cd209主要表达于巨噬细胞中。
35.从临床获得活检的脂肪性肝病组织，用生理盐水洗涤3次去除组织中的血渍，随后在无菌条件下利用手术剪将组织剪成1-2mm3的组织块，进而将组织悬浮于rpmi-1640培养基中，加入无菌终浓度为1mg/ml胶原酶、0.002％dna酶i和0.01％透明质酸酶在37℃中消化2～3小时。随后用70μm的滤器过滤获得单细胞悬液，将细胞悬液重悬于染色缓冲液中，并以流式荧光标记的cd209和cd68抗体室温孵育30分钟，bd流式分析仪中分析cd68与cd209在细胞中的共表达情况，结果表明cd209主要在cd68阳性的巨噬细胞中表达(图2)。
36.如图3-6所示，cd209活性多肽片段的构建及应用步骤包括：
37.第一步，cd209活性多肽片段表达载体构建；
38.利用全基因组合成技术合成cd209活性多肽片段的编码cdna片段，并将上述合成的cdna片段利用bamhi和xhoi限制性内切酶酶切在37℃孵育4小时进行酶切处理，酶切处理后利用dna回收试剂盒回收dna，并与同样经bamhi和xhoi限制性内切酶酶切处理后的pcdna-flag载体以7：1的摩尔比例混合，加入10％体积的10
×
t4 dna连接酶缓冲液，以及1μl t4 dna连接酶，室温孵育1小时。将连接后的样品转化入dh5α感受态细菌中，挑取单克隆细菌进行摇菌并通过pcr鉴定阳性克隆，测序验证克隆序列的正确性。
39.第二步：cd209活性多肽片段转染及表达检测；
40.首先从脂肪性肝病组织中分离cd68
+
/cd45
+
巨噬细胞，依据图2中的方法首先获得脂肪性肝病组织单细胞悬液，并以流式荧光标记的cd68和cd45抗体室温孵育30分钟，并利用bd facsaria流式细胞分选仪分选出cd68
+
/cd45
+
巨噬细胞。
41.在100μl opti-mem培养基中依次加入2μg的cd209多肽片段表达载体或空载pcdna-flag载体及4μl的fugene脂质体试剂，室温孵育15分钟，进而加入从脂肪性肝病组织中分离到的1
×
106cd68
+
/cd45
+
巨噬细胞，将样品转移至6孔板中并置于离心机中，在2000rpm离心60min转染，转染后继续培养单核细胞36小时，收集细胞样品进行免疫印迹检测检测cd209活性多肽的表达。结果表明相比于转染空载载体中，转染cd209活性多肽载体组的巨噬细胞中成功表达cd209活性多肽片段(图3)。
42.第三步：cd209活性多肽片段抑制巨噬细胞中tlr4及其下游促炎细胞因子表达；
43.实施例1：cd209活性多肽片段抑制巨噬细胞中tlr4表达；
44.在上述分别转染空载及cd209活性多肽片段的巨噬细胞中，以流式荧光标记的tlr4抗体室温孵育30分钟，进而利用bd facsaria流式细胞仪分析tlr4在上述2组中的表达差异。结果表明，相比于空载组中，转染cd209活性多肽片段组中的tlr4表达显著下降(图4)。
45.实施例2：cd209活性多肽片段抑制巨噬细胞中促炎细胞因子表达；
46.收集上述分别转染空载及cd209活性多肽片段的巨噬细胞，以rnazol裂解细胞并提取细胞总rna，将1μg总rna利用revertaid逆转录试剂盒按照说明书逆转录成cdna，进而利用takara公司的sybr green pcr master mix进行实时定量pcr检测，将样品在罗氏light cycler480实时定量pcr仪中进行分析，获得结果后利用
△△
ct法分析cd209活性多肽片段表达对促炎细胞因子tnf-α、il-1β和il-6在巨噬细胞中表达的影响。结果表明，cd209活性多肽片段可明显抑制tnf-α、il-1β和il-6在巨噬细胞中的表达(图5)。
47.第四步：cd209活性多肽片段转导可以抑制肝细胞的脂肪蓄积和炎性死亡；
48.在转染空载及cd209活性多肽片段的巨噬细胞中，培养36小时并分别收集上述细胞的上清条件培养基，并将其加入培养的hepg2肝细胞中，培养48小时后，收集细胞分别利用总甘油三酯检测试剂盒和细胞凋亡试剂盒分析对照和cd209活性多肽巨噬细胞条件培养基对肝细胞的脂肪蓄积和死亡的影响。结果表明，cd209活性多肽片段转染后，巨噬细胞诱导肝细胞的脂肪蓄积和炎性死亡能力显著下降(图6)。
49.本发明是基于巨噬细胞介导的肝脏炎症是触发脂肪性肝病中肝细胞脂肪蓄积和死亡的关键机制，发明一种炎症抑制性多肽并靶向表达于巨噬细胞中，从而抑制巨噬细胞中关键促炎受体分子tlr4的表达，显著抑制巨噬细胞的促炎活性，从而保护肝细胞免受炎症诱导的脂肪蓄积和死亡。通过一系列分子和细胞层面的研究，我们发现cd209活性多肽片段可明显抑制促炎受体及其下游促炎细胞因子的表达，从而减缓巨噬细胞介导的慢性炎症，并缓解脂肪性肝病中炎性介导的脂肪蓄积和肝死亡。本发明提供临床前cd209活性多肽特异性改造巨噬细胞进行脂肪性肝病的靶向治疗，对脂肪性肝病的临床治疗及生物靶向药物开发具有重要的意义。
50.应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。