不对称的D-A型近红外二区荧光分子及其制备方法和应用

本发明属于有机荧光探针领域，具体涉及一类不对称的d-a型近红外二区荧光分子及其制备方法和应用。

背景技术：

1、荧光成像技术因其高时空分辨率、非侵入性、可实时检测、高灵敏度的特点被广泛地应用于生物医学研究和临床中[angew.chem.int.ed.engl.2021,60,7476-7487；chem.sci.2020,11,8157-8166]。近红外二区(nir-ii，1000-1700nm)荧光成像相较于可见光(400-700nm)以及近红外一区(700-900nm)成像具有更深的组织穿透深度、更少的光子散射和组织自发荧光，因此在生物成像中更具有优势[nat.commun.2017,8,15269；nat.mater.2016,15,235-242；angew.chem.int.ed.engl.2021,60,16294-16308]。近年来，各种近红外二区荧光分子也相继被开发出来，包括无机纳米材料、有机共轭聚合物以及有机小分子荧光探针，其中，有机小分子荧光探针具有明确的化学结构，结构简单，并且可以通过调节分子的结构来对探针的光物理性能和生物性质进行优化，生物相容性高，安全性好，在生物应用方面更具有潜力[angew.chem.int.ed.engl.2018,57,7483-7487；nat.commun.2020,11,3102]。

2、近年来，一系列的有机小分子荧光探针相继地被开发出来，从探针的分子结构上可以分为花菁类、供体-受体-供体(d-a-d)型、bodipy类以及罗丹明类[acs materialsletters 2020,2,905-917；acs materials letters 2019,1,418-424]。具有d-a-d骨架的探针与其他类型的有机小分子荧光探针相比，斯托克斯位移更大，同时，光物理稳定性优异，因此，在体内荧光成像方面更具有优势。迄今为止，已经采用了多种分子工程策略来提高d-a-d型荧光探针的生物成像性能。一方面，在分子中引入屏蔽基团以及侧基能减少分子间相互作用从而显著增强荧光亮度，具有aie特性的nir-ii荧光探针同样也具有出色的荧光亮度[front chem.2021,9,739802；j.am.chem.soc.2021,143,17136-17143；mater.today bio.2021,10,100087]。另一方面，通过开发具有红移发射波长的荧光探针能减少生物背景信号和光散射，进而使成像效果获得极大的提升，因此，许多工作都是致力于开发具有更广泛的吸收和发射波长的荧光探针，而这主要是通过增加供体的电子密度和降低受体的电子密度来实现[nat.commun.2018,9,1171；j.med.chem.2019,62,2049-2059；j.am.chem.soc.2020,142,15271-15275]。

3、然而，具有高量子产率的长波长发射的荧光探针通常具有较大的π共轭体系，探针的分子量巨大，难以开发为临床药物[nature 2004,432,855-861；bioorg.med.chem.lett.2019,29,1555-1564]。同时，分子量大的探针在组织中的穿透困难，因此，在肿瘤等具有高基质密度的病灶组织中，红移探针常常面临渗透性差和组织分布不均匀等问题，导致探针在病灶部位的富集较小，荧光信号弱，对疾病的诊断能力下降[advanced materials2021,33,2006902；acs nano 2018,12,11282-11293]。因此，开发分子量更小的荧光探针是很有必要的。

4、经fda批准的近红外一区探针吲哚菁绿(icg)由于其在1000nm波长以上也具有荧光发射[proc.natl.acad.sci.u s a 2018,115,4465-4470]，也可用于近红外二区成像，目前，已被用于近红外二区荧光成像指导的第一例肝癌患者的肝肿瘤切除[nat.biomed.eng.2020,4,259-271]。icg的最大发射波长位于815nm，远小于已报道的红移探针，由此可见，长波长发射不是限制探针应用的必要因素。

5、而分子量更小，光谱蓝移的d-a型荧光探针能在满足成像条件的基础上，同时解决组织渗透性的问题，因此，对于d-a型探针的开发显得尤为紧要。

技术实现思路

1、[技术问题]

2、本公开的目的是提供一类具有优异性能的近红外二区荧光分子，其可有效地应用于生物显影剂。

3、[技术方案]

4、因此，一方面本发明提供一类不对称的d-a型近红外二区荧光分子，其为通式i所示的化合物或它们的盐：

5、

6、其中：

7、x为s、o、se、nr4；特别为s；

8、y和y’中一者为s、o或nr4’，另一者为ch或ch2；表示单键或双键；

9、r1选自r1’选自r5和r8各自独立地为h、c1-c8烷基、c1-c8烷氧基、取代或未取代的c6-c10芳基或5-10元杂芳基；r6和r7各自独立地为h、c1-c8烷基、c1-c8烷氧基、或卤素，或者r6和r7与和其相连接的c一起形成含有选自n、o和s中的1、2或3个杂原子的5-10元杂环，特别是形成含有选自n、o和s中的1、2或3个杂原子的6元杂环，更特别是形成含有选自o的1、2或3个杂原子的6元杂环；y1为s、o或nr4，特别为s或o，更特别为s；

10、r2和r3各自独立地选自h、c1-c12烷基、c1-c12烷氧基、c1-c8烷基硅基、羟基c1-c8烷基(例如羟基c1-c4烷基)、氨基c1-c8烷基(例如氨基c1-c4烷基)、醛基c1-c8烷基、巯基c1-c8烷基、卤代c1-c8烷基、酰氧基c1-c8烷基、氨基、卤素、羧基c1-c6烷基、取代或未取代的c6-c10芳基或5-10元杂芳基、-(ch2)n1-cooch2ch2si(ch3)3，其中n1为0～10的整数(如0，1，2，3，4等)；-(ch2)n2-(och2ch2)n3-r，其中，n2为1～10的整数，n3为1～500的整数，r选自h、c1-c8烷基、羟基、氨基、羧基、磺酸基、卤素、巯基、及

11、当c6-c10芳基或5-10元杂芳基被取代时，取代基选自c1-c8烷基、c1-c8烷氧基、c1-c8烷基硅基、羟基c1-c8烷基、氨基c1-c8烷基、巯基c1-c8烷基、卤代c1-c8烷基和羧基c1-c6烷基；

12、r4和r4’各自独立地选自h、c1-c8烷基、羟基c1-c8烷基、氨基c1-c8烷基、醛基c1-c8烷基、巯基c1-c8烷基、卤代c1-c8烷基、酰氧基c1-c8烷基、-(ch2)n2-(och2ch2)n3-r，其中n2为1～10的整数，n3为1～500的整数，r选自h、c1-c8烷基、羟基、氨基、羧基、磺酸基、卤素、巯基、及

13、d选自如下基团：

14、

15、

16、其中，r9至r46各自独立地选自h；取代或未取代的c1-c8烷基；取代或未取代的c1-c8烷氧基；取代或未取代的c1-c8烷基硅基；氨基；卤素；-(ch2)n1-cooch2ch2si(ch3)3，其中n1为0～10的整数(例如0、1、2、3、4、5等)；-(ch2)n1-coch2ch2si(ch3)3，其中n1为0～10的整数(例如0、1、2、3、4、5等)；-(ch2)n2-(och2ch2)n3-r，其中n2为1～10的整数(例如1、2、3、4、5等)，n3为1～500的整数(例如1、2、3、4、5等)，r选自h、c1-c8烷基、c1-c8烷氧基、羟基、氨基、羧基、磺酸基、卤素、巯基、及-(ch2)n4-conhch2ch2so3h，其中n4为0～10的整数(例如0、1、2、3、4、5等)；-(ch2)n5-oc-r，其中n5为1～10的整数(例如1、2、3、4、5等)，r选自h、c1-c8烷基、c1-c8烷氧基、羟基、

17、所述取代或未取代的c1-c8烷基、取代或未取代的c1-c8烷氧基或取代或未取代的c1-c8烷基硅基的取代基选自羟基、氨基、c2-c4炔基、叠氮基、巯基、醛基、羧基、磺酸基、卤素、raoc(＝o)-、rac(＝o)o-、ranc(＝o)-、其中ra各自独立地选自c1-c6烷基、羟基c1-c6烷基、氨基c1-c6烷基、醛基c1-c6烷基、巯基c1-c6烷基、卤代c1-c6烷基、炔基c1-c6烷基、叠氮基c1-c6烷基、羧基c1-c6烷基、磺酸基c1-c6烷基、

18、或者，r9至r46各自独立地选自式其中，r’和r”各自独立地选自c1-c8亚烷基，a选自环状rgd肽基团，例如c(rgdyk)、c(rgdfk)；单糖基团；二糖基团；及多糖基团，其中，所述单糖优选选自葡糖糖、半乳糖、果糖、阿拉伯糖、鼠李糖、核糖；所述二糖优选选自乳糖及麦芽糖；所述多糖优选选自环糊精；s表示硫原子；b为含有fv段的分子基团，例如可以选自单抗、双抗及单链fv段基团；

19、或者，r9至r46各自独立选自和其中r”’为-(ch2)n-，n为0～10的整数。

20、在一些实施方式中，r1选自r1’选自其中，r5为h、c1-c4烷基或c1-c4烷氧基；r6和r7各自独立地为h、c1-c6烷基、c1-c4烷氧基或卤素，或者r6和r7与和其相连接的c一起形成含有选自n、o和s中的1、2或3个杂原子的5-7元杂环基，特别是形成含有选自o的1、2或3个杂原子的6元杂环，更特别是二氧杂环己烷基；y1为s或o，特别是s；其他取代基同上。

21、在一些实施方式中，通式i的化合物为如下通式i-1的化合物：

22、

23、在通式i-1中，y选自s、o和nr4’；其余取代基及r4’的定义分别如上文所述。

24、在一些实施方式中，通式i的化合物为如下通式i-2的化合物：

25、

26、在通式i-2中，y选自s、o和nr4’；其余取代基及r4’的定义分别如上文所述。

27、在一些实施方式中，d选自如下基团：

28、特别是

29、在一些实施方式中，

30、x为s；

31、y为s、o或nr4’；

32、r1为r1’为其中，r6和r7各自独立地为h或c1-c8烷基，或者r6和r7与和其相连接的c一起形成二氧杂环己烷基；y1为s；以及

33、d选自如下基团：

34、

35、其他基团定义与上述相同。

36、在一些实施方式中，

37、x为s；

38、y为s；

39、r1为r1’为其中，r5为h、c1-c4烷基或c1-c4烷氧基，特别为h；

40、d为其他基团定义与上述相同。

41、在一些实施方式中，r2和r3各自独立地选自h、c1-c4烷基、c1-c4烷氧基、羟基c1-c4烷基、氨基c1-c4烷基、醛基c1-c4烷基、巯基c1-c4烷基、卤代c1-c4烷基、氨基、卤素、-(ch2)n1-cooch2ch2si(ch3)3，其中n1为0～10的整数(如0，1，2，3，4等)，其他基团定义与上述相同。在一些实施方式中，r2和r3彼此相同。

42、在一些实施方式中，r4和r4’各自独立地选自h、c1-c4烷基、羟基c1-c4烷基、氨基c1-c4烷基、醛基c1-c4烷基、巯基c1-c4烷基、卤代c1-c4烷基，特别是h或c1-c4烷基，其他基团定义与上述相同。

43、在一些实施方式中，r9-r46各自独立地选自h；取代或未取代的c1-c6烷基；取代或未取代的c1-c6烷氧基；取代或未取代的c1-c6烷基硅基；氨基；卤素；-(ch2)n2-(och2ch2)n3-r，其中n2为1～10的整数，n3为1～500的整数，r选自h、c1-c8烷基、羟基、氨基、羧基、磺酸基、卤素、巯基、及特别地，r9-r46各自独立地选自h、c1-c6烷基、卤素；所述的取代或未取代的c1-c6烷基、取代或未取代的c1-c6烷氧基或取代或未取代的c1-c6烷基硅基的取代基选自羟基、氨基、乙炔基、叠氮基、醛基、羧基、磺酸基、卤素、raoc(＝o)-、ranc(＝o)-、其中ra各自独立地选自c1-c4烷基、羟基c1-c4烷基、氨基c1-c4烷基、醛基c1-c4烷基、巯基c1-c4烷基、卤代c1-c4烷基、羧基c1-c4烷基、磺酸基c1-c4烷基和其他基团定义与上述相同。

44、在一些实施方式中，r9-r45各自独立地选自式其中，r’选自c1-c6亚烷基，a选自单糖基团，所述单糖选自葡糖糖、半乳糖、果糖、阿拉伯糖、鼠李糖、核糖、乳糖及麦芽糖；其他基团定义与上述相同。

45、在一些实施方式中，r9-r45各自独立选自r”’为-(ch2)n-，n为0～10的整数；其他基团定义与上述相同。

46、在一些实施方式中，在d为的情况下，r9和r10彼此相同，选自h，c1-c6烷基，和被羟基、氨基、醛基、羧基、磺酸基、ranc(＝o)-取代的c1-c6烷基，其中ra选自c1-c4烷基、羟基c1-c4烷基、氨基c1-c4烷基、醛基c1-c4烷基、巯基c1-c4烷基、卤代c1-c4烷基、羧基c1-c4烷基、磺酸基c1-c4烷基或单糖基团，所述单糖优选选自葡糖糖、半乳糖、果糖、阿拉伯糖、鼠李糖及核糖；其他基团定义与上述相同。

47、在一些实施方式中，在d为的情况下，r11和r12彼此相同或不同，选自h，c1-c6烷基，和被选自羟基、氨基、乙炔基、叠氮基、醛基、羧基、磺酸基、卤素、raoc(＝o)-、ranc(＝o)-、的取代基取代的c1-c6烷基，其中ra各自独立地选自c1-c4烷基、羟基c1-c4烷基、氨基c1-c4烷基、醛基c1-c4烷基、巯基c1-c4烷基、卤代c1-c4烷基、羧基c1-c4烷基、磺酸基c1-c4烷基和其他基团定义与上述相同。

48、在一些实施方式中，在d为的情况下，r13选自h，c1-c6烷基，和被选自羟基、氨基、乙炔基、叠氮基、醛基、羧基、磺酸基、卤素、raoc(＝o)-、ranc(＝o)-的取代基取代的c1-c6烷基，其中ra各自独立地选自c1-c4烷基、羟基c1-c4烷基、氨基c1-c4烷基、醛基c1-c4烷基、巯基c1-c4烷基、卤代c1-c4烷基、羧基c1-c4烷基、磺酸基c1-c4烷基；或者

49、r13选自r‘’‘为-(ch2)n-，n为0～10的整数；以及

50、r14选自h，c1-c6烷基，和被选自羟基、氨基、乙炔基、叠氮基、醛基、羧基、磺酸基、卤素、raoc(＝o)-、ranc(＝o)-的取代基取代的c1-c6烷基，其中ra各自独立地选自c1-c4烷基、羟基c1-c4烷基、氨基c1-c4烷基、醛基c1-c4烷基、巯基c1-c4烷基、卤代c1-c4烷基、羧基c1-c4烷基、磺酸基c1-c4烷基，其他基团定义与上述相同。

51、在一些实施方式中，在d为的情况下，r15和r16彼此相同或不同，选自c1-c6烷基；-(ch2)n1-cooch2ch2si(ch3)3，其中n1为0～10的整数(例如0、1、2、3、4、5等)；-(ch2)n1-coch2ch2si(ch3)3，其中n1为0～10的整数(例如0、1、2、3、4、5等)；和被选自羟基、氨基、醛基、羧基、磺酸基、raoc(＝o)-、ranc(＝o)-的取代基取代的c1-c6烷基，其中ra各自独立地选自c1-c4烷基、羟基c1-c4烷基、氨基c1-c4烷基、醛基c1-c4烷基、巯基c1-c4烷基、卤代c1-c4烷基、羧基c1-c4烷基、磺酸基c1-c4烷基；以及r17为h，其他基团定义与上述相同。

52、在一些实施方式中，在d为的情况下，r38选自h，c1-c6烷基，被选自羟基、氨基、乙炔基、叠氮基、醛基、羧基、磺酸基、卤素的取代基取代的c1-c6烷基，以及r37为c1-c6烷基，其他基团定义与上述相同。

53、在一些实施方式中，本发明的荧光分子选自下列化合物或其盐：

54、

55、

56、

57、

58、本发明的另一方面提供了制备通式i-1或i-2所示的荧光分子的方法，所述方法包括以下步骤：

59、

60、其中，各取代基的定义如上所述，r’为硼酸基或硼酸酯基或三正丁基锡基；

61、a、化合物1经还原反应得到中间体2；

62、b、中间体2与化合物3-1或3-2经缩合反应得到中间体4-1或4-2；

63、c、中间体4-1或4-2与化合物5经suzuki偶联反应得到化合物i-1或i-2。

64、特别地，反应条件可以如下：

65、a、取化合物1、zn粉于反应容器中，氮气或惰性气体保护下，加入二氯甲烷-90％甲醇混合溶液，其中，二氯甲烷和90％甲醇的体积比为15～3:1；向反应液中通入氮气或惰性气体，排除反应液中的氧气，再加入氯化铵，继续向反应液中通入氮气或惰性气体，室温反应4～48h，反应结束后进行提纯，即得到中间体2；

66、b、取中间体2、化合物3-1或3-2加入到反应容器中，溶于乙酸溶液，向反应液中通入氮气或惰性气体，加热回流反应10～72h，反应结束后进行提纯，即得到中间体4-1或4-2；

67、c、取中间体4-1或4-2、化合物5、碳酸钾加入到反应容器中，氮气或惰性气体保护下，加入四氢呋喃-水混合液，其中，四氢呋喃和水的体积比为10～2:1，向反应液中通入氮气或惰性气体，排除反应液中的氧气，再加入[1,1’-双(二苯基膦)二茂铁]二氯化钯二氯甲烷络合物，继续向反应液中通入氮气或惰性气体，加热回流反应10～96h，反应结束后进行提纯，即得到化合物i-1或i-2。

68、在具体实施方式中，步骤a所述的化合物1、zn粉、氯化铵的摩尔比为1:120:36，所述的二氯甲烷和90％甲醇的体积比为10:1；步骤b所述的中间体2和化合物3-1或3-2的摩尔比为1:2；步骤c所述的中间体4-1或4-2、化合物5、碳酸钾、[1,1’-双(二苯基膦)二茂铁]二氯化钯二氯甲烷络合物的摩尔比为1:1:5:0.1，四氢呋喃和水的体积比为2:1。

69、在具体实施方式中，步骤a的反应时间为4～6h。

70、在具体实施方式中，步骤b的反应时间为10～48h，回流温度为100～120℃。

71、在具体实施方式中，步骤c的反应时间为10～96h，回流温度为100～120℃。

72、本发明另一方面，提供一种上述近红外二区荧光分子用于制备显影剂的用途。

73、本发明又一方面，提供一种显影剂，其包含上述近红外二区荧光分子。

74、所述显影剂可以用于在生物组织及样品中进行体外定量检测和体内成像以及非生物组织的指示定量。

75、在具体实施方式中，所述显影剂可以用于活体肿瘤荧光成像，例如龋齿类动物骨肉瘤活体成像。

76、在具体实施方式中，所述显影剂可用于血液循环系统成像、淋巴管及淋巴结成像、肿瘤血管成像、血栓成像及脑血管成像、骨成像以及骨相关疾病(例如骨质疏松)成像。

77、[有益效果]

78、本发明提供一类不对称的d-a型近红外二区荧光分子，经实验验证，该类分子的最大二区荧光发射峰在900nm至1100nm之间，可用于骨成像、淋巴结成像以及骨肉瘤成像。