一株高产戊二胺基因工程菌及构建方法与应用

1.本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一株高产戊二胺基因工程菌及构建方法与应用。


背景技术：

2.1,5-戊二胺(1,5-diaminopentane) ，即尸胺(cadaverine)，又称为1,5-二氨基戊烷，是一种普遍存在于生物体内的生物胺。1,5-戊二胺在工业、农业和医药领域上有着广泛的应用。在工业上，1,5-戊二胺可与二元酸反应合成生物基高分子材料聚酰胺（俗称尼龙，pa）；在农业上，可用于植物生长代谢的调节，果实质量和产量的提升；在医学上，可用于治疗痢疾的药物中。目前，聚酰胺在全球范围的需求量与日俱增。除了传统的化学合成1,5-戊二胺，生物法制备也日渐成熟，逐渐取代化学合成法，成为1,5-戊二胺合成的主流方法。其中，生物法主要原料是玉米等粮食作物。然而我国现今粮食储备尚不能满足国民需求，且粮食价格普遍上涨，戊二胺的生产成本也随之升高，为此需要改进戊二胺发酵方法，降低发酵成本。
3.基于固定化酶技术开发出的细胞固定化发酵技术可以使发酵连续不断进行，缩短生产周期并提高产量，极大提高戊二胺发酵的效率的同时也降低了成本。目前细胞固定化方法主要有四种：包埋法、交联法、共价结合法以及吸附法。采用吸附法固定酶，其操作简便、条件温和，不会引起酶变性或失活，且载体廉价易得，可反复使用。有利于工业化的大规模应用。


技术实现要素：

4.针对现有技术的不足，本发明提供了一株高产戊二胺基因工程菌及构建方法与应用。
5.为解决现有技术问题，本发明采取的方案为：一株高产戊二胺基因工程菌，在出发菌中过表达生物膜调控基因pgaabcd，所述生物膜调控基因pgaabcd的核苷酸序列如seq id no.1所示，即得高产戊二胺大肠杆菌。
6.seq id no.1：cgcggatccgagagagattttggcaatacatggagtaatacaggatgtattcaagtagcagaaaaaggtgcccgaaaaccaaatgggctttgaaacttcttactgccgcatttttagcagcgagtcccgcggcgaagagtgctgttaataacgcctatgatgcattgattattgaagctcgcaagggtaatactcagccagctttgtcatggtttgcactaaaatcagcactcagcaataaccaaattgctgactggttacagattgccttatgggccgggcaagataaacaggttattaccgtttacaaccgctaccgtcatcagcaattaccagcgcgtggttatgcagctgtcgccgtcgcttatcgtaacctgcaacaatggcaaaactcgcttacactgtggcaaaaggcgctctctctggagccgcaaaataaggattatcaacggggacaaattttaaccctggcagatgctggtcactatgatactgcgctggttaaacttaagcagcttaactctggagcaccggacaaagccaatttactcgcagaagcctatatctataaactggcggggcgtcatcaggatgaattacgggcgatgacagagtcattacctgaaaatgcatctacgcaacaatatcccacagaatacgtgcaggcattacgtaa
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id no.2所示。
9.seq id no.2：catgcagcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgctacgctcggtcgttcgactgcggcgagcggtgtcagctcactcaaaagcggtaatacggttatccacagaatcaggggataaagccggaaagaacatgtgagcaaaaagcaaagcaccggaagaagccaacgccgcaggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagccagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgttggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccattggtaactgatttagaggactttgtcttgaagttatgcacctgttaaggctaaactgaaagaacagattttggtgagtgcggtcctccaacccacttaccttggttcaaagagttggtagctcagcgaaccttgagaaaaccaccgttggtagcggtggtttttctttatttatgagatgatgaatcaatcggtctatcaagtcaacgaacagctattccgttactctagatttcagtgcaatttatctcttcaaatgtagcacctgaagtcagccccatacgatataagttgtaattctcatgttagtcatgccccgcgcccaccggaaggagctgactgggttgaaggctctcaagggcatcggtcgagatcccggtgcctaatgagtgagctaacttacattaattgcgttgcgctcactgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtgccagctgcattaatgaatcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcgtattgggcgccagggtggtttttcttttcaccagtgagacgggcaacagctgattgcccttcaccgcctggccctgagagagttgcagcaagcggtccacgctggtttgccccagcaggcgaaaatcctgtttgatggtggttaacggcgggatataacatgagctgtcttcggtatcgtcgtatcccactaccgagatgtccgcaccaacgcgcagcccggactcggtaatggcgcgcattgcgcccagcgccatctgatcgttggcaaccagcatcgcagtgggaacgatgccctcattcagcatttgcatggtttgttgaaaaccggacatggcactccagtcgccttcccgttccgctatcggctgaatttgattgcgagtgagatatttatgccagccagccagacgcagacgcgccgagacagaacttaatgggcccgctaacagcgcgatttgctggtgacccaatgcgaccagatgctccacgcccagtcgcgtaccgtcttcatgggagaaaataatactgttgatgggtgtctggtcagagacatcaagaaataacgccggaacattagtgcaggcagcttccacagcaatggcatcctggtcatccagcggatagttaatgatcagcccactgacgcgttgcgcgagaagattgtgcaccgccgctttacaggcttcgacgccgcttcgttctaccatcgacaccaccacgctggcacccagttgatcggcgcgagatttaatcgccgcgacaatttgcgacggcgcgtgcagggccagactggaggtggcaacgccaatcagcaacgactgtttgcccgccagttgttgtgccacgcggttgggaatgtaattcagctccgccatcgccgcttccactttttcccgcgttttcgcagaaacgtggctggcctggttcaccacgcgggaaacggtctgataagagacaccggcatactctgcgacatcgtataacgttactggtttcacattcaccaccctgaattgactctcttccgggcgctatcatgccataccgcgaaaggttttgcgccattcgatggtgtccgggatctcgacgctctcccttatgcgactcctgcattaggaaatactagtttgacaattaatcatccggctcgtataatgtgtggaattgtgagcggataacaatttcacacaggaaacagaccatggaattcgagctcggtacccggggatccgagagagattttggcaatacatggagtaatacaggatgtattcaagtagcagaaaaaggtgcccgaaaaccaaatgggctttgaaacttcttactgccgcatttttagcagcgagtcccgcggcgaagagtgctgttaataacgcctatgatgcattgattattgaagctcgcaagggtaatactcagccagctttgtcatggtttgcactaaaatcagcactcagcaataaccaaattgctgactggttacagattgccttatgggccgggcaagataaacaggttattaccgtttacaaccgctaccgtcatcagcaattaccagcgcgtggttatgcagctgtcgccgtcgcttatcgtaacctgcaacaatggcaaaactcgcttacactgtggcaaaaggcgctctctctggagccgcaaaataaggattatcaacggggacaaattttaaccctggcagatgctggtcactatgatactgcgctggttaaacttaagcagcttaactctggagcaccggacaaagc
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10.一种菌剂，含有上述任一株高产戊二胺基因工程菌。
11.上述任一株高产戊二胺基因工程菌或菌剂在发酵产戊二胺中的应用。
12.作为改进的是，发酵的具体步骤为：s1固定化载体制备将固定化载体用0.5-2 m的naoh浸泡30min-2h，用水冲洗至 ph为中性，再在0.5-2 m hcl中浸泡30min-2h，用水冲洗至ph为中性，烘干，得到经过预处理的固定化载体，最后将预处理大的固定化载体剪成大小相同，体积为0 .5cm3的正方体块状载体；s2发酵在活化的高产戊二胺基因工程菌平板上，挑取单点，接种至含有对应抗性的种子培养基中；待种子培养基中的od
600
为1时，以 0.4％(v/v)的接种量接种到已灭过菌的含固定化载体的发酵培养基中，固定化发酵得到戊二胺。
13.作为改进的是，所述固定化介质为聚氨酯材料。
14.作为改进的是，步骤s1中naoh的浓度为1m，浸泡1h，hcl的浓度为 1m，浸泡1h。
15.作为改进的是，步骤s2中固定化载体的含量为2g/l发酵培养基，发酵的温度为30-37℃，发酵的时间为48-72h。
16.在出发菌中过表达生物膜调控基因pgaabcd的方法为向出发菌中导入过表达生物
膜调控基因pgaabcd的质粒，使大肠杆菌中的pgaabcd基因表达量增加，基因pgaab调控聚-β-1,6-n-乙酰葡萄糖胺的分泌、pgacd调控聚-β-1,6-n-乙酰葡萄糖胺的合成，高产赖氨酸大肠杆菌生物膜基质主要含有聚-β-1,6-n-乙酰葡萄糖胺（pga）和荚膜异多糖酸，这些组件构成了结构支架生物膜。其中pga是主要的粘附素，对生物膜的稳定性具有主要作用，过表达生物膜调控基因pgaabcd，使得生物膜形成增加提高传质效率，进而影响固定化发酵和产戊二胺的效果。
17.有益效果：与现有技术相比，本发明一株高产戊二胺基因工程菌及构建方法与应用，构建了一株过表达生物膜调控基因pgaabcd的重组高产戊二胺基因工程菌,该重组基因工程菌使大肠杆菌在固定化发酵产戊二胺过程中生物膜量增加的同时减轻载体抱团现象，发挥出固定化发酵的优势，提高了戊二胺的产量，缩短了发酵周期。
附图说明
18.图1为pcwj质粒图谱；图2为pcwj-pgaabcd质粒图谱图；图3为革兰氏染色图；图4为原始大肠杆菌kaccpg和高产戊二胺基因工程菌的发酵结果；图5为原始大肠杆菌kaccpg和高产戊二胺基因工程菌的连续分批发酵结果。
具体实施方式
19.以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。
20.实施例中未提及到的技术均为本领域常规技术，另外，大肠杆菌kaccpg的构建方法见专利公开号：cn113817762a、pcwj、trans1-t1等材料都是商业化产品，可直接购买。
21.实施例1 大肠杆菌生物膜调控基因pgaabcd过表达菌的构建1、pcwj-pgaabcd质粒的构建以大肠杆菌kaccpg基因组为模板，通过常规pcr以操纵子形式扩增大肠杆菌来源的脱乙酰聚-β-1,6-n-乙酰-d-氨基葡萄糖输出外膜孔蛋白pgaabcd。上游引物带有bamh i酶切位点，序列为：seq id no.3:cgcggatccgagagagattttggcaatacatggagta；下游引物带有hindiii酶切位点，序列为：seq id no.4:cccaagcttccgggctttgttttgggtgt。
22.反应条件为：95℃ 2min ，95℃ 20s，55℃ 200s，72℃ 180s，共30个循环；72℃ 5min；得到的序列经1％琼脂糖凝胶电泳后回收相应片段；将该序列与表达载体pcwj（其质粒图谱见图1）用takara 公司的bamh i和hindiii酶切，酶切反应体系为：10
×
buffer h 2μl，xba i 0.5μl，bamh i 0.5μl，基因片段及载体pcwj 3μl，h2o 14μl。酶切体系于37℃条件
下反应2小时。将酶切产物连接，反应体系为：10
×
ligasebuffer1μl，t4dnaligase(takara)1μl，基因片段7μl，载体1μl。连接于25℃下反应3小时。将连接产物转化大肠杆菌trans1-t1。pcr筛选阳性菌株trans1-t1-pcwj-pgaabcd并进行dna测序，验证重组质粒构建正确。
23.将阳性菌株接种至5mllb/cmr液体培养基，lb/cmr液体培养基组成为蛋白胨10g/l、酵母粉5g/l、氯化钠5g/l，于37℃、200rpm条件下振荡培养过夜。24小时后按照天根质粒提试剂盒操作说明提取质粒pcwj-pgaabcd，其质粒图谱如图2所示。
24.2、高产戊二胺基因工程菌的获得
①
大肠杆菌kaccpg感受态的制备在lb平板上，挑取kaccpg单菌落，然后接入摇管（lb培养基），温度37℃，200rpm,培养10-12h。按以1%的接种量转接到500ml摇瓶lb的液体培养基中，装液量为50ml,温度37℃,200rmp进行培养。待菌液光密度值od600生长至0.4-0.5，将摇瓶放到冰上冰浴20min（停止生长活动）后，在已预冷的离心机中，4℃下，4000rpm，离心10min，去除上清后收集菌体。用10ml0.1mol/l预冷(4℃)的cacl2（包含20%甘油）溶液重悬菌体，放置于冰上静置15min，4℃下，4000rpm，离心10min（该步骤重复两次）。去除上清，最后添加1ml提前放置冰箱预冷的含15%甘油的0.1mol
·
l-1
cacl2溶液悬浮细胞，冰上放置5min后，即制成了kaccpg感受态细胞悬液。
25.②
高产戊二胺基因工程菌（记为：+ppgaabcd菌株）获得加入步骤1制备的重组质粒pcwj-pgaabcd于ka30感受态细胞悬液中，轻轻摇匀，冰上放置30min；42℃水浴热激45s，立即置于冰上冷却2min；加入1ml的lb液体培养基混匀后，37℃振荡培养40min，使菌体恢复正常生长状态；将上述菌液摇匀后取100μl涂布于lb抗性板，倒置培养皿，置于37℃恒温培养箱培养12h；其中，lb抗性板的配方如下：氯化钠10g/l、胰蛋白胨10g/l、酵母粉5g/l、琼脂粉20g/l，121℃灭菌20min，冷却后加氯霉素至终浓度为60μg/ml。
26.实施例2革兰氏染色实验将原始大肠杆菌kaccpg和+ppgaabcd菌株分别按照常规革兰氏染色方法进行然后，染色结果如图3所示，+ppgaabcd菌株在脱色后，红色较原始菌明显变深，用生物膜调控基因pgaabcd过表达后，生物膜是增加的。
27.实施例3高产戊二胺基因工程菌的固定化发酵实验1.多孔纤维材料固定化介质的制备将聚氨酯材料用1m的naoh浸泡1h，用纯水洗净后，在1mhcl中浸泡1h，之后用纯水冲洗至ph为中性，再放入65℃烘箱中烘干至恒重，剪成0.5cm3大小相同的载体。
28.2.发酵合成戊二胺一级种子液：将冻存的高产戊二胺基因工程菌和原始菌株接种至5ml含有对应抗性的lb液体培养基，液体培养基组成为蛋白胨10g/l、酵母粉5g/l、氯化钠5g/l，于37℃、200rpm条件下振荡培养过夜，当od
600
至0.8-1时转接二级种子液。
29.二级种子液：定量取一级种子液，控制二级种子液初始od
600
为0.1,液体培养基配方如下表2所示。
30.表2二级种子液的液体培养基的配方
发酵液：定量取二级种子液，控制发酵液初始od
600
为0.05,液体培养基配方如表1所示。
31.表1发酵液的液体培养基的配方37 ℃下培养12 h后，后加入iptg至终浓度0.5
‰‑1‰
，37 ℃下再诱导培养48 h。取上清进行液相检测，原始菌株kaccpg和高产戊二胺基因工程菌株的发酵结果如图4所示，发酵72 h后，过表达生物膜调控基因pgaabcd菌株发酵产戊二胺的产量平均为16.21 g/l ，原始菌发酵产戊二胺的产量平均为 13.92 g/l。转化率上，与原始菌相比提高16.45％，周期也从84h减少到72h。上述检测方法可参照专利cn109055449a。
32.图5表示+ppgaabcd菌株和原始菌株在连续发酵12批次后的生产强度的差异。从图中可以看出，+ppgaabcd菌株在12批次连续发酵后，发酵强度无明显下降，而原始菌株12批次后发酵强度下降了32％，说明+ppgaabcd菌株的连续发酵性能明显优于原始菌株。kaccpg是一株高产戊二胺菌株，在此基础上产量能有所提高，周期明显缩短，连续发酵效果也明显增强，可以说是在大肠杆菌kaccpg固定化发酵成产戊二胺的基础上取得了很大的进步，适宜于工业生产。