一种促进转录因子GATA6蛋白结晶的方法

一种促进转录因子gata6蛋白结晶的方法
技术领域
1.本发明属于结构生物学技术领域，具体涉及的是一种促进转录因子gata6蛋白结晶的方法。


背景技术：

2.蛋白质三维空间结构可以提供生物大分子间相互作用的细节信息，也可以观察生物大分子在行使其功能时的动态变化。解析蛋白质的结构不仅能促进对生物功能和分子机理的认识，阐述重要的生物学问题，还能够探索与生物大分子功能失调相关疾病的发病机理与设计相关疾病的靶向药物。gata6是一种转录因子，属于gata蛋白家族的一员，在心肌肥大疾病中gata6转录因子被激活，究其原因在于其dna结合域（dna-bindingdomain,dbd）与致心肌肥大胚胎基因的启动子直接结合进而引起心肌肥大。因此，以gata6转录因子为结构基础探索心肌肥大的发病机理并以此研发抑制心肌肥大的新药有重要的理论和临床意义。
3.目前为止gata6的结构尚未被解析，其结合启动子促心肌肥大的结构生物学机制也不清楚：（1）、药物研发需要gata6结构，但只能借鉴gata家族其它被解析的结构，如gata1和gata3，但这二者主要在造血系统中发挥功能，而gata6主要参与心脏发育，因此解析gata6的结构非常必要；（2）、gata6在蛋白纯化过程中特别容易沉淀，很难得到单一且纯度高的蛋白，难以进行之后的蛋白结晶实验以解析空间结构；（3）、gata6在结晶过程中难以得到其蛋白晶体，因此无法进行进一步x光衍射实验。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于克服现有技术的缺点，解决gata6蛋白表达低、易沉降、不结晶，从而导致结构未解析的技术问题，提供一种促进转录因子gata6蛋白结晶的方法，通过促进gata6蛋白结晶实验来解析gata6与致心肌肥大胚胎基因的启动子互作的三维空间结构，以提供复合物结合模式的细节信息，了解促心肌肥大的结构学问题，为可能的抑制心肌肥大药物筛选提供精准的靶点。
5.本发明的设计构思为：受结构生物学与分子生物学的启发，将gata6的dbd序列克隆到适合gata6表达的载体中，这种载体需要满足gata6的大量表达与降低gata6的沉降的需求。另外蛋白成功表达之后需要gata6-dbd与dna进行孵育，通过共晶实验得到gata6-dbd与dna结合的复合物晶体，解析后明确二者的互作模式，为可能的病理过程提供依据，对以gata6为靶蛋白筛选相关疾病的临床药物提供具有重要的意义。
6.本发明通过以下技术方案予以实现：一种促进转录因子gata6蛋白结晶的方法，本发明提供五种能与gata6-dbd区域结
合的dna序列，并进一步地在dna与gata6-dbd的复合物结晶实验中，得到二者的复合物晶体，为后续蛋白结构解析提供基础。本方法包括以下步骤：s1、gata6-dbd的克隆构建：从人源gata6（hgata6[nm_005257.6]）基因中pcr扩增得到gata6-dbd目的片段，连接到pet32m.3c载体，转化到dh5α感受态细胞，涂板接菌，37℃条件下220rpm培养过夜，然后提取重组质粒进行双酶切鉴定和测序；s2、gata6-dbd蛋白表达：将步骤s1测序正确的重组质粒转入大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞中，涂板接菌，37℃条件下220rpm培养过夜，加入iptg在16℃诱导16h，然后收集菌体待后步使用；s3、gata6-dbd蛋白纯化：将步骤s2获得的菌体重悬于磷酸盐缓冲液，在超声破碎前向菌液中加入浓度为10
µ
g/ml的dnase溶液、浓度为10
µ
g/ml的rnase溶液、浓度为5%的甘油以及浓度为0.5mm的pmsf溶液，dnase溶液、rnase溶液、甘油、pmsf溶液以及菌液的体积比为1：1：50：5：1000，然后利用超声破碎仪破碎菌体，在4℃温度环境下超速15000rpm离心取上清液，将上清液与ni介质孵育后进行亲和层析纯化，洗脱得到的目的蛋白依次进行离子交换层析和凝胶过滤层析，最后使用sds-page电泳检测，收集gata6-dbd目的蛋白；s4、gata6-dbd蛋白与dna复合物结晶：将步骤s3收集的gata6-dbd目的蛋白与化学合成的含有gata位点启动子部分序列的dna共同孵育，进行共晶培养，制得gata6-dbd与dna结合的复合物晶体。
[0007]
进一步地，在所述步骤s4中，gata6-dbd与dna复合物晶体通过气相扩散法筛选获得，包括以下步骤：（1）、制备dsdna：将化学合成的含有gata位点的启动子两条单链用含有zncl2、mgcl2、dtt、tris-hcl、nacl以及5%甘油的混合溶液稀释，100℃退火5min，静置至室温后与gata6按照摩尔比（0.5-1）：1在冰上进行孵育至少30min；（2）、对复合物进行晶体筛选与优化：
①
、采用气相扩散法对复合物进行晶体的筛选：使用hamptonresearch公司生产的crystalscreeningkiti&ii、indexkit或者pgerxkit晶体生长试剂盒对初始结晶条件进行筛选，包括以下步骤：盖玻片中央加1
µ
l蛋白，再加1
µ
l池液，混合倒置于悬滴晶体板上，每孔加池液200
µ
l，用真空脂封口，静置于16℃恒温晶体培养箱进行晶体培养，获得gata6-dbd复合物初筛晶体；
②
、初筛的晶体进行优化：通过蛋白浓度梯度、初筛条件ph、盐浓度、沉淀剂浓度、加入additive、或者迭代seeding优化方法对初筛晶体进行优化，获得gata6-dbd复合物优化晶体。
[0008]
与现有技术相比本发明的有益效果为：本发明为成功解析gata6与dna互作三维空间结构提供可靠、高效的蛋白晶体。在本发明中，通过分子克隆选取gata6-dbd这一段序列，构建到最合适表达的载体中，然后转化到大肠杆菌中，解决了蛋白沉淀的问题。另外，通过与含有gata结合位点的化学合成的dsdna进行孵育，解决了gata6-dbd蛋白不结晶的问题。晶体经过后续步骤进一步优化，得到了符合衍射条件的晶体。
[0009]
总之，本发明为解析gata6-dbd复合物结构，了解心肌肥大病理过程与筛选有效药
物提供结构学基础。
附图说明
[0010]
图1为本发明进行蛋白纯化的流程图；图2为gata6-dbd分子克隆成功的质粒进行双酶切验证的琼脂糖凝胶电泳胶图；图3为gata6-dbd蛋白在大肠杆菌bl21（de3）试表达前后的蛋白考马斯亮蓝胶图；图4为三步纯化后的gata6-dbd蛋白层析图以及蛋白胶图；图5为gata6-dbd与dsdna孵育后进行凝胶过滤的层析图；图6为gata6-dbd复合物初筛晶体图；图7为gata6-dbd复合物优化晶体图。
具体实施方式
[0011]
下面结合附图和实施例对本发明作进一步的详细描述。
[0012]
如图1所示的一种促进转录因子gata6蛋白结晶的方法，本实施例中使用五种能与gata6-dbd区域结合的dna序列，并进一步地在dna与gata6-dbd的复合物结晶实验中，得到二者的复合物晶体，为后续蛋白结构解析提供基础。本方法包括以下步骤：s1、gata6-dbd的克隆构建：从人源gata6（hgata6[nm_005257.6]）基因中pcr扩增得到gata6-dbd目的片段，连接到pet32m.3c载体，转化到dh5α感受态细胞，涂板接菌，37℃条件下220rpm培养过夜，然后提取重组质粒进行双酶切鉴定和测序，双酶切鉴定结果如图2所示；s2、gata6-dbd蛋白表达：将步骤s1测序正确的重组质粒转入大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞中，涂板接菌，37℃条件下220rpm培养过夜，加入iptg在16℃诱导16h，从图3中可以确认蛋白在iptg诱导前后有差异，然后收集菌体待后步使用；s3、gata6-dbd蛋白纯化：将步骤s2获得的菌体重悬于磷酸盐缓冲液，在超声破碎前向菌液中加入浓度为10
µ
g/ml的dnase溶液、浓度为10
µ
g/ml的rnase溶液、浓度为5%的甘油以及浓度为0.5mm的pmsf溶液，dnase溶液、rnase溶液、甘油、pmsf溶液以及菌液的体积比为1：1：50：5：1000，然后利用超声破碎仪破碎菌体，在4℃温度环境下超速15000rpm离心取上清液，将上清液与ni介质孵育后进行亲和层析纯化，洗脱得到的目的蛋白依次进行离子交换层析和凝胶过滤层析，最后使用sds-page电泳检测，收集gata6-dbd目的蛋白上清液，目的蛋白的纯度高、均一性良好；s4、gata6-dbd蛋白与dna复合物结晶：将步骤s3收集的目的gata6-dbd蛋白与化学合成的含有gata位点启动子部分序列的dna共同孵育，如图5所示，孵育后再次过凝胶过滤层析验证二者成功结合，后进行共晶培养，制得gata6-dbd与dna结合的复合物晶体。
[0013]
进一步地，在所述步骤s4中，gata6-dbd与dna复合物晶体通过气相扩散法筛选获得，包括以下步骤：（1）、制备dsdna：将化学合成的含有gata位点的启动子两条单链用含有zncl2、mgcl2、dtt、tris-hcl、nacl以及5%甘油的混合溶液稀释，100℃退火5min，静置至室温后与gata6按照摩尔比（0.5-1）：1在冰上进行孵育至少30min，在本步骤涉及五种不同的dna；
（2）、对复合物进行晶体筛选与优化：
①
、采用气相扩散法对复合物进行晶体的筛选：使用hamptonresearch公司生产的crystalscreeningkiti&ii、indexkit或者pgerxkit晶体生长试剂盒对初始结晶条件进行筛选，包括以下步骤：盖玻片中央加1
µ
l蛋白，再加1
µ
l池液，混合倒置于悬滴晶体板上，每孔加池液200
µ
l，用真空脂封口，静置于16℃恒温晶体培养箱进行晶体培养，获得gata6-dbd复合物初筛晶体，如图6所示；
②
、初筛的晶体进行优化：通过蛋白浓度梯度、初筛条件ph、盐浓度、沉淀剂浓度、加入additive、或者迭代seeding优化方法对初筛晶体进行优化，获得gata6-dbd复合物优化晶体，如图7所示。
[0014]
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。