一种与绵羊肉质嫩度相关的基因多态位点的检测方法及应用

1.本发明属于基因检测及畜禽品种改良与育种领域，具体涉及一种绵羊肉质嫩度相关单核苷酸多态性(snp)标记的鉴定。


背景技术：

2.随着经济进步，居民生活水平不断提高，餐饮业的蓬勃发展，羊肉越来越受大众的欢迎。羊肉需求量增加的同时，人们对其肉质的要求也随之升高。近年来，育种工作者们逐渐将研究方向转移至绵羊肉质方面性状的改善。羊肉整体品质由多种因素综合影响，如肌内脂肪含量能够显著影响肉质的嫩度；羊肉中不饱和脂肪酸不仅会影响羊肉的风味而且还是人体所必需的营养物质。通过探知影响绵羊肉质性状的候选基因及其上发生突变的位点与绵羊群体肉质性状差异的关联性，为绵羊提高肉质质量的分子育种工作提供了重要依据。早期研究揭示了与小尾寒羊前体脂肪细胞分化过程相关基因表达规律(doi:10.16431/j.cnki.1671-7236.2019.07.018.)，但尚未确定影响肉质性状的主要基因。
3.细胞间网络通信因子5(cellular communication network factor 5,ccn5)参与机体多项生理过程，如细胞粘附、增殖、分化、迁移、成熟等。有研究表明，ccn5基因能够影响间充质干细胞(mscs)增殖和分化，并参与机体的脂肪代谢。但关于ccn5基因在家畜肉质方面的研究较少，影响机体肉质性状的调控作用仍不明确。目前，对于ccn5基因snp标记的探索处于停滞状态。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种与绵羊肉质嫩度相关的基因多态位点的检测方法及应用，为在固定群体里选择肌内脂肪含量相对较高的绵羊个体提供一种快速有效的方法，为提高绵羊肉质品质的育种提供依据。
5.为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：
6.一种绵羊ccn5基因单核苷酸多态性的检测方法，包括以下步骤：
7.以绵羊基因组dna或绵羊离体生物材料所含dna为模板，通过pcr扩增ccn5基因部分片段，利用该片段鉴定ccn5基因第5外显子单核苷酸多态性位点的基因型。
8.优选的，所述单核苷酸多态性位点位于chr.13:7625253，该位点在绵羊(例如小尾寒羊)群体中存在c-g突变。
9.优选的，所述pcr的引物为：
10.上游引物：5
’‑
aacggagggaaggacatcaaat-3’(即seq.id.no.1)
11.下游引物：5
’‑
agcggctgacatagagtttcca-3’(即seq.id.no.2)。
12.优选的，所述绵羊离体生物材料为采集自绵羊个体的血液。
13.优选的，所述pcr的反应体系包括：50～150ng/μl绵羊基因组dna 1～2μl或绵羊血样1～2μl，以及10～20μmol/l上、下游引物各0.4～0.5μl。
14.优选的，所述pcr的反应条件包括：94℃5min；94～95℃30s，55～65℃30s，72℃
16s，共35个循环；72℃8min。
15.优选的，所述基因型的鉴定具体包括以下步骤：对所述片段进行测序，然后将测序结果与参考序列比对。
16.一种绵羊ccn5基因单核苷酸多态性的检测试剂盒，该试剂盒包括用于通过pcr-测序法鉴定ccn5基因第5外显子单核苷酸多态性位点的基因型的位点扩增引物(例如，上述上游引物和下游引物)。
17.上述绵羊ccn5基因单核苷酸多态性的检测方法在绵羊分子标记辅助选择育种中的应用。
18.优选的，所述单核苷酸多态性位点(具体为chr.13:7625253)的基因型为cg或cc的个体在肉质性状上较优。
19.优选的，所述肉质性状选自肌内脂肪含量。
20.优选的，所述绵羊选自小尾寒羊。
21.本发明的有益效果体现在：
22.本发明根据所发现的位于ccn5基因第5外显子内的snp位点，不仅可以实现对绵羊(例如小尾寒羊)群体ccn5基因进行快速、准确分型。而且基于该位点与个体肉质性状的显著相关性，可以运用分子标记(即snp标记)在早期筛选肉品质(例如嫩度)好的绵羊个体，从而提高优势肉羊(例如小尾寒羊)选育速度。
23.进一步的，与传统的分型方法相比，本发明通过测序鉴定基因型，具有耗时短、成功率高，结果更直观，以及可以大批量进行鉴定、选择的优势。
附图说明
24.图1为小尾寒羊ccn5基因第5外显子部分区域扩增产物电泳图；图中marker右侧的5个泳道为不同个体样本。
25.图2为小尾寒羊ccn5基因第5外显子部分区域测序图；图中we5-25-w5r_e02/f02/g02/h02/a03/b03/c03.ab1rc代表不同个体样本。
26.图3为小尾寒羊ccn5基因(第5外显子)不同基因型的测序峰图；其中：a为cc基因型，b为gg基因型，c为cg基因型。
具体实施方式
27.下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明。所述实施例仅用于解释本发明，而非对本发明保护范围的限制。
28.(一)绵羊基因组候选区域筛选
29.本发明中选用具有代表性的肉羊品种小尾寒羊为实验对象。实验室前期通过转录组测序技术检测实验羊脂肪细胞分化过程中的差异表达基因。结果发现ccn5基因与实验羊脂肪代谢相关，能够影响实验羊肉质性状，而后一发现在此前没有相关报道。随后的实验检测发现，ccn5基因只有第5外显子存在一个潜在的snp位点。因此，将该位点与实验羊肉质数据关联分析，试图证明ccn5基因存在与绵羊肉质性状相关的snp标记(具体参见以下实验内容)。
30.(二)绵羊样本采集以及ccn5基因第5外显子突变检测
31.1.样本采集
32.2021年10月对吉林省长春市吉林省农业科学院饲养的小尾寒羊进行血样采集。血样通过颈静脉采血获得，采集的血液存放在抗凝管中，置于4℃冰箱保存；共采集96只6月龄小尾寒羊。
33.2.突变检测策略
34.根据绵羊ccn5基因序列，设计特异性引物，然后通过pcr克隆ccn5基因第5外显子部分区域的dna片段，对该dna片段利用直接测序技术进行检测，得到序列信息，然后根据绵羊基因组参考序列判定样本的ccn5基因第5外显子发生突变的情况。
35.3.引物设计
36.以绵羊ccn5基因dna序列为参照(基因id号：xm_027977228.2)设计1对引物，引物序列如下，目的片段长度为745bp：
37.ccn5基因exon5上游引物：5
’‑
aacggagggaaggacatcaaat-3’38.ccn5基因exon5下游引物：5
’‑
agcggctgacatagagtttcca-3’39.引物由苏州金唯智生物有限公司合成。
40.4.pcr扩增
41.从采集的小尾寒羊血样中提取基因组dna，以此为模板，利用梯度pcr试验确定最佳试验温度。
42.在200μl的pcr离心管中加入pcr反应体系：2
×
master mix 10μl、上游引物0.5μl(10μmol/l)、下游引物0.5μl(10μmol/l)、基因组dna 1μl(约50ng/μl)，用ddh2o补齐至20μl。
43.将pcr离心管置于pcr仪中，设定反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s；设置55℃-65℃梯度退火30s；72℃延伸16s，从第二步开始35个循环；循环结束后再72℃延伸8min；4℃保存。
44.取5μl pcr产物用2％琼脂糖凝胶在1
×
tbe中电泳检测20min。根据条带亮度及清晰度确定最终退火温度。
45.确定最终退火温度后，利用全式金血液pcr试剂盒，以采集的绵羊血样为模板，并按以下pcr反应体系进行目的片段扩增：
[0046]2×
master mix 10μl、10μmol/l上下游引物各0.4μl、血液量1μl，用ddh2o补齐至20μl。
[0047]
pcr反应体系的配制在冰上操作，充分混匀后放入pcr仪。最终的pcr反应条件为：94℃5min；95℃30s，60℃退火30s，72℃16s，共35个循环；72℃8min。
[0048]
反应结束后取5μl pcr产物用2％琼脂糖凝胶在1
×
tbe中电泳检测，检测结果如图1所示。
[0049]
5.片段测序及序列分析
[0050]
将通过pcr扩增的745bp目的片段的产物进行条带回收，然后直接进行sanger测序。
[0051]
参见图2，将样本测序结果与参考基因组序列(基因id号：xm_027977228.2)进行比对，确定ccn5基因第5外显子存在的1个突变位点(位置为chr.13:7625253)，发生c-g突变，即编码序列由原来的gta突变为cta，并形成错义突变(编码氨基酸为缬氨酸突变为亮氨
酸)。其中突变型序列/野生型序列如下所示：
[0052]
gaccccagttttctggctttgtcgctcccccagcccctggcgtctcctgcccggaatggagcaccgcctggggtccctgctcgaccacctgcggcctgggcgtggccacccgagtgtccaatcagaaccgtttctgccgcctggagacccagcgccgcctgtgc(c/g)tactggggccctgcccacccgccaggggccacggcccaaggagcagagccttttag
[0053]
(三)绵羊ccn5基因多态性分析
[0054]
sanger测序后经比对会出现两个结果，在整体的序列比对结果(图2)中如果出现不同基因型后，再利用如图3所示结果进行查看，明确个体的具体序列(基因型)。结果发现，ccn5基因第5外显子在采集的小尾寒羊群体中产生cc、cg、gg三种基因型。其中gg基因型有36只，cc基因型有12只，cg基因型有48只，g为优势等位基因。
[0055]
进一步分析结果表明(表1)，ccn5基因第5外显子存在的这一突变位点为snp位点。
[0056]
表1.小尾寒羊ccn5基因各基因频率、基因型频率及遗传指标
[0057][0058]
(四)绵羊ccn5基因遗传变异与肉质性状的关联分析
[0059]
肉质性状数据：检测以上96只6月龄小尾寒羊背最长肌ph值、剪切力、肉色、系水率、嫩度、肌内脂肪含量。
[0060]
基因型数据：以上96只6月龄小尾寒羊ccn5基因的基因型(cc、cg或gg)。
[0061]
表2.小尾寒羊ccn5基因各基因型的肉质性状差异显著性检验结果
[0062][0063]
注：不同肩标字母代表差异显著，具有统计学意义(p＜0.05)。
[0064]
参见表2，经过对小尾寒羊群体中各基因型与实际肉质性状的联合分析，发现该群体中具有cg基因型以及cc基因型个体的肌内脂肪含量显著大于gg基因型的个体，这表明含有c等位基因的个体肉质嫩度要明显高于纯合的野生型(gg)个体。并且实验和分析结果表明，ccn5基因的这一snp位点除了与肉质嫩度有关，与其他检测的肉质性状无显著相关性。
[0065]
结合以上关联分析结果，可以推测得出：由于绵羊ccn5基因第5外显子上突变产生不同的氨基酸，使得蛋白二级结构以及蛋白三级结构的构象发生变化，由此不同的基因型产生了肉质性状上的差异，即肉质嫩度上出现差异。
[0066]
总之，本发明通过sanger测序技术分析绵羊ccn5基因遗传多态性并与肉质性状数据相结合进行相关分析，从分子水平揭示了影响与绵羊肉质嫩度相关的候选基因，即ccn5
基因，并且可以依据ccn5基因上的多态位点对肉质嫩度优势绵羊群体进行早期选择，从而为优质绵羊的育种工作提供理论基础和科学依据。