异叶青兰中姜辣素类天然自由基清除剂的分离工艺及其应用的制作方法

1.本发明涉及异叶青兰中天然自由基清除剂分离技术领域，具体涉及异叶青兰中姜辣素类天然自由基清除剂的分离工艺及其应用。


背景技术：

2.异叶青兰(dracocephalum heterophyllum benth)系唇形科(labiatae)青兰属(dracocephalum)植物，藏药名：“吉孜青保”，又名白花夏枯草，分布于山西(神池)，内蒙古(大青山)，宁夏(贺兰山)，甘肃(兰州以西及西南)，四川西北部、西部，青海，西藏及新疆(天山)，资源丰富。《晶珠本草》中记载异叶青兰治口腔病、牙齿病，清肝热。新疆用全草入药，对治疗慢性气管炎有明显的镇咳平喘作用。现代研究证明异叶青兰中的化学成分主要包括苯丙素类、黄酮类、萜类、甾体类、生物碱类和苯甲酸类。文献报道，姜辣素类化合物具有良好的清除自由基活性。为了进一步加快异叶青兰的质量评价和相关新药的研发步伐，有必要从中挖掘更多的活性成分。
3.目前，有关异叶青兰中姜辣素类天然自由基清除剂的分离制备工艺及其应用并未见文献报道，已有的研究也未做到系统化的研究。因此，亟需建立一种工艺简单、规模化从异叶青兰中分离制备姜辣素类天然自由基清除剂的方法。


技术实现要素：

4.基于上述技术问题，本发明的目的是提供异叶青兰中姜辣素类天然自由基清除剂的分离工艺及其应用。
5.本发明保护异叶青兰中姜辣素类天然自由基清除剂的分离工艺，具体包括如下步骤：
6.步骤1，提取：将异叶青兰全草阴干，粗碎后按料液比1g：5～100ml的甲醇提取，在室温下提取2～4次，每次8～12h，过滤、合并滤液，即滤液a，该滤液a按硅胶的量：异叶青兰药材的量＝1:1～5拌样并减压干燥，即得异叶青兰提取物拌样样品；
7.步骤2，硅胶柱前处理：异叶青兰提取物拌样样品，该样品经装有硅胶的中压色谱柱分离，经检测波长为210nm的紫外检测器检测，收集制备色谱图中第一个主要的色谱峰馏分，该馏分经减压干燥即得异叶青兰含有目标成分的组分fr1；其中，所述硅胶柱分离的工作参数为色谱柱柱长460mm、直径15-49mm，固定相为硅胶，流动相a为甲醇，b为二氯甲烷，色谱条件为0-30min，0％b，30-60min，0-100％b，60-90min，100％b，进样量为20-130g，流速为10-57ml/min；
8.步骤3，微孔树脂柱富集：fr1用加入其质量5～10倍的甲醇溶解得到滤液b，滤液b按硅胶的量：样品的量＝1:1～1.5拌样并干燥，即得异叶青兰含有目标成分的组分fr1拌样样品，该样品经装有微孔树脂的中压色谱柱分离，经检测波长为210nm的紫外检测器检测，收集制备色谱图中第四个主要的色谱峰馏分，该馏分经减压干燥即得异叶青兰含有目标成分的组分fr14；其中，微孔树脂柱分离的工作参数为：色谱柱柱长460mm、直径15-49mm，微孔
树脂柱固定相为chp20p，流动相a为水，b为甲醇，色谱条件为0-150min，20-100％b，150-210min，100％b，进样量为10-55g，流速为10-57ml/min；hplc分析条件为：reprosil-pur c18 aq(250
×
4.6mm，5μm)色谱柱，检测波长为210nm，流动相a为色谱纯水，流动相b为乙腈溶液，按照0-60min，40-75％b，流动相流速为1.0ml/min；
9.步骤4，在线自由基清除剂组分筛选：在所述异叶青兰含有目标成分的组分fr14中加入其质量5～10倍的体积浓度为70～90％的甲醇进行溶解，配制样品浓度为50.0～100.0mg/ml，经0.45μm微孔滤膜过滤，得到异叶青兰fr14甲醇样品溶液，即滤液c，取1ml滤液c，利用在线hplc-dpph色谱联用系统筛选异叶青兰含有目标成分的组分中自由基清除剂；其中，所述在线hplc-dpph色谱联用系统，第一台高效液相色谱仪采用reprosil-pur c18 aq(250
×
4.6mm，5μm)色谱柱，检测波长为210nm；第二台高效液相色谱仪进乙醇溶解的dpph溶液，检测波长为517nm；
10.步骤5，diol二醇基柱富集：滤液c按硅胶的量：样品的量＝1:1～1.5拌样并干燥，即得异叶青兰含有目标成分的组分fr14拌样样品，该样品经diol二醇基中压色谱柱分离，经检测波长为280nm的紫外检测器检测，收集制备色谱图中第一个主要的色谱峰馏分，该馏分经减压干燥即得异叶青兰含有目标成分的组分fr141；其中，diol二醇基柱分离的工作参数为：色谱柱柱长500mm、直径50mm，固定相为diol，流动相a为正己烷，b为乙酸乙酯，色谱条件为0-90min，0-100％b，检测波长为280nm，进样量为10-60g，流速为57ml/min；
11.步骤6，在线自由基清除剂组分再筛选：在所述异叶青兰含有目标成分的组分fr141中加入其质量5～10倍的体积浓度为70～90％的甲醇进行溶解，配制样品浓度为50.0～100.0mg/ml，经0.45μm微孔滤膜过滤，得到异叶青兰fr141样品溶液，即滤液d，取1ml滤液d，利用在线hplc-dpph色谱联用系统筛选异叶青兰含有目标组分中自由基清除剂色谱峰1-3；其中，所述在线hplc-dpph色谱联用系统，第一台高效液相色谱仪采用reprosil-pur c18 aq(250
×
4.6mm，5μm)反相色谱柱，检测波长为210nm；第二台高效液相色谱仪进乙醇溶解的dpph溶液，检测波长为517nm；
12.步骤7，spherical c18色谱柱制备：滤液d按硅胶的量：样品的量＝1:1～1.5拌样并干燥，即得异叶青兰含有目标成分的组分fr141拌样样品，该样品经spherical c18中压色谱柱分离，经检测波长为210nm的紫外检测器检测，收集制备色谱图中第二个主要的色谱峰馏分，该馏分经减压干燥即得异叶青兰含有目标成分的组分fr1412；其中，spherical c18色谱柱制备的工作参数为：色谱柱柱长500mm、直径50mm，固定相为spherical c18，流动相a为水，b为乙醇，色谱条件为0-90min，55-75％b，检测波长为210nm，进样量为10g，流速为57ml/min；
13.步骤8，反相制备柱分离：在所述异叶青兰含有目标成分的组分fr1412中加入其质量5～10倍的体积浓度为70～100％的甲醇进行溶解，配制样品浓度为50.0～100.0mg/ml，经0.45μm微孔滤膜过滤，得到异叶青兰fr1412样品溶液，即滤液e，取1ml滤液e，使用在线hplc-dpph色谱联用系统对滤液e进行分析和活性峰筛选，然后将分析条件进行线性放大，对滤液e进行反相制备色谱柱分离，经检测波长为210nm的紫外检测器检测，收集制备色谱图中对应的色谱峰馏分fr14123、fr14124和fr14126，经减压干燥分别得到含有目标化合物1的组分fr14123，含有目标化合物2的组分fr14124和含有目标化合物3和4的组分fr14126；
14.步骤9，fr1423、fr1424和fr1426反相苯基柱液相色谱纯化：分别含有目标化合物1
～4的组分fr14123、fr14124和fr14126分别用体积分数为70～100％的甲醇-水溶液溶解，配制样品浓度为20.0～50.0mg/ml，均经0.45μm微孔滤膜过滤，得到滤液，即滤液f、g和h，使用在线hplc-dpph色谱联用系统对滤液f、g和h进行分析和活性峰筛选，然后将分析条件进行线性放大，对滤液f、g和h进行反相液相制备色谱纯化，经检测波长为210nm的紫外检测器检测，收集滤液f、g和h制备色谱图中主要的色谱峰馏分，该色谱峰馏分经减压干燥即得纯度大于95％的自由基清除剂5-methoxy-[6]-gingerol，标记为1号；6-shogaol，标记为2号；6-paradol，标记为3号；diacetoxy-6-gingerdiol，标记为4号；其中，化学结构式分别为：
[0015][0016]
进一步的，所述步骤1、步骤2、步骤3、步骤5、步骤7、步骤8和步骤9中，减压干燥的条件均为：真空度100～300mbar，温度45～65℃。
[0017]
进一步的，所述步骤4和6中，第一台高效液相色谱仪采用的流动相a为色谱纯水，流动相b为乙腈溶液，按照0-60min，40-75％b，流动相流速为1.0ml/min；第二台高效液相色谱仪进乙醇溶解的dpph溶液浓度为25μg/ml，流动相流速为0.8ml/min；反应环长度为18m。
[0018]
进一步的，所述步骤8中，在线hplc-dpph色谱联用系统，第一台高效液相色谱仪采用reprosil-pur c18 aq(250
×
4.6mm，5μm)反相色谱柱，检测波长为210nm，流动相a为色谱纯水，流动相b为乙腈溶液，按照0-60min，55％b洗脱，流速为1.0ml/min；第二台高效液相色谱仪进乙醇溶解的dpph溶液，检测波长为517nm；dpph溶液浓度为25μg/ml，流动相流速为0.8ml/min；反应环长度为18m；反相制备液相色谱纯化的工作参数为：色谱柱柱长250mm、直径20mm，反相制备柱固定相为5μm的reprosil-pur c18 aq填料，流动相a为色谱纯水，流动相b为乙腈溶液，按照0-60min，55％b洗脱，进样体积为0.5ml，流速为19ml/min。
[0019]
进一步的，所述步骤9中，在线hplc-dpph色谱联用系统，第一台高效液相色谱仪采用kromasil 100-5phenyl(250
×
4.6mm，5μm)反相色谱柱，检测波长为210nm，流动相a为色谱纯水，流动相b为乙腈溶液，组分fr14123分离的流动相为体积分数40％乙腈-水溶液，洗脱60min，组分fr14124分离的流动相为体积分数42％乙腈-水溶液，洗脱60min，fr14126分离的流动相为体积分数38％乙腈-水溶液，洗脱120min，流速均为1.0ml/min；第二台高效液相色谱仪进乙醇溶解的dpph溶液，检测波长为517nm；dpph溶液浓度为25μg/ml，流动相流速为0.8ml/min；反应环长度为18m；反相制备液相色谱纯化的工作参数为：色谱柱柱长250mm、直径20mm，反相制备柱固定相为5μm的kromasil 100-5phenyl填料，组分fr14123、组分fr14124和组分fr14126使用的流动相与在线hplc-dpph色谱联用系统中第一台高效液相色
谱仪中流动相相同，进样体积均为0.5ml，流速为19ml/min。
[0020]
本发明还保护上述异叶青兰中姜辣素类天然自由基清除剂的应用，其中，该异叶青兰中姜辣素类天然自由基清除剂在制备自由基清除药物或保健食品中应用，具体作为有效成分按药学上可接受的任何载体制成各类药用制剂，或作为有效成分按食品科学上可接受的任何载体制成各类保健类食品。
[0021]
相比于现有的技术，本发明具有如下有益效果：
[0022]
(1)本发明成本低廉、产品纯度高
[0023]
使用的提取溶剂，硅胶柱、微孔树脂柱、中压色谱柱(diol二醇基柱和spherical c18色谱柱)、反相色谱柱分离和纯化所使用的溶剂均可以回收利用；使用的色谱分离材料(反相制备液相色谱分离材料)均可以重复利用，回收利用的溶剂和重复利用的分离材料保证了分离过程中平均成本比较低廉，高压色谱分离可以保证产品的纯度大于95％。
[0024]
(2)本发明的制备方法可实现规模化生产需要
[0025]
原料要求不高、成本低廉，一般野生的或市场上销售的异叶青兰即可，易于批量备料；甲醇室温冷浸提取，易于操作，同时对环境友好；分离采用硅胶柱前处理，微孔树脂柱、diol二醇基柱和spherical c18色谱柱富集，硅胶和微孔树脂分离材料可以装于中压柱层析系统中，易于规模化；分离纯化中使用的反相制备液相色谱，为快速的等度方法，非常适宜大规模生产。
附图说明
[0026]
图1为硅胶柱前处理色谱图；
[0027]
图2为fr1组分微孔树脂富集色谱图；
[0028]
图3为在线自由基清除剂fr14组分筛选色谱图；
[0029]
图4为diol二醇基色谱柱富集色谱图；
[0030]
图5为在线自由基清除剂fr141组分再筛选色谱图；
[0031]
图6为spherical c18色谱柱分离色谱图；
[0032]
图7为组分fr1412的reprosil-pur c18 aq反相分析柱分析及活性色谱图；
[0033]
图8为组分fr1412的reprosil-pur c18 aq制备柱制备色谱图；
[0034]
图9为组分fr14123的kromasil 100-5phenyl反相分析柱分析及活性色谱图；
[0035]
图10为组分fr14123的kromasil 100-5phenyl制备柱制备色谱图；
[0036]
图11为组分fr14124的kromasil 100-5phenyl反相分析柱分析及活性色谱图；
[0037]
图12为组分fr14124的kromasil 100-5phenyl制备柱制备色谱图；
[0038]
图13为组分fr14126的kromasil 100-5phenyl反相分析柱分析及活性色谱图；
[0039]
图14为组分fr14126的kromasil 100-5phenyl制备柱制备色谱图；
[0040]
图15为异叶青兰中姜辣素类天然自由基清除剂1在线活性验证图谱；
[0041]
图16为异叶青兰中姜辣素类天然自由基清除剂2在线活性验证图谱；
[0042]
图17为异叶青兰中姜辣素类天然自由基清除剂3在线活性验证图谱；
[0043]
图18为异叶青兰中姜辣素类天然自由基清除剂4在线活性验证图谱；
[0044]
图19为异叶青兰中姜辣素类天然自由基清除剂1～4化学结构式；
[0045]
图20为异叶青兰中姜辣素类天然自由基清除剂1的dpph自由基清除率实验ic
50
值
拟合曲线图；
[0046]
图21为异叶青兰中姜辣素类天然自由基清除剂2的dpph自由基清除率实验ic
50
值拟合曲线图；
[0047]
图22为异叶青兰中姜辣素类天然自由基清除剂3的dpph自由基清除率实验ic
50
值拟合曲线图；
[0048]
图23为异叶青兰中姜辣素类天然自由基清除剂4的dpph自由基清除率实验ic
50
值拟合曲线图；
[0049]
图24为异叶青兰中姜辣素类天然自由基清除剂1(5-methoxy-[6]-gingerol)的低分辨质谱图；
[0050]
图25为本发明异叶青兰中姜辣素类天然自由基清除剂1(5-methoxy-[6]-gingerol)1h nmr核磁；
[0051]
图26为本发明异叶青兰中姜辣素类天然自由基清除剂1(5-methoxy-[6]-gingerol)
13
c nmr核磁图；
[0052]
图27为本发明异叶青兰中姜辣素类天然自由基清除剂2(6-shogaol)的低分辨质谱图；
[0053]
图28为本发明异叶青兰中姜辣素类天然自由基清除剂2(6-shogaol)1h nmr核磁图；
[0054]
图29为本发明异叶青兰中姜辣素类天然自由基清除剂2(6-shogaol)
13
c nmr核磁图；
[0055]
图30为本发明异叶青兰中姜辣素类天然自由基清除剂3(6-paradol)的低分辨质谱图；
[0056]
图31为本发明异叶青兰中姜辣素类天然自由基清除剂3(6-paradol)1h nmr核磁图；
[0057]
图32为本发明异叶青兰中姜辣素类天然自由基清除剂3(6-paradol)
13
c nmr核磁图；
[0058]
图33为本发明异叶青兰中姜辣素类天然自由基清除剂4(diacetoxy-6-gingerdiol)的低分辨质谱图；
[0059]
图34为本发明异叶青兰中姜辣素类天然自由基清除剂4(diacetoxy-6-gingerdiol)1h nmr核磁图；
[0060]
图35为本发明异叶青兰中姜辣素类天然自由基清除剂4(diacetoxy-6-gingerdiol)
13
c nmr核磁图。
具体实施方式
[0061]
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0062]
实施例1
[0063]
异叶青兰中姜辣素类天然自由基清除剂的分离工艺，具体包括如下步骤：
[0064]
步骤1，提取：将10.0kg异叶青兰全草阴干，粗碎后按料液比1g：20ml的甲醇提取，在室温下提取2次，每次10h，过滤、合并滤液，即滤液a，该滤液a按硅胶的量：异叶青兰药材的量＝1:1.15拌样并减压干燥，即得异叶青兰提取物拌样样品2.8kg；其中，减压干燥的条件为真空度150mbar，温度55℃；
[0065]
步骤2，硅胶柱前处理：异叶青兰提取物拌样样品，该样品经装有硅胶的中压色谱柱分离，经检测波长为210nm的紫外检测器检测，收集制备色谱图中第一个主要的色谱峰馏分(如附图1所示)，该馏分经减压干燥即得205.5g异叶青兰含有目标成分的组分fr1；其中，减压干燥的条件均为真空度150mbar，温度55℃；硅胶柱分离的工作参数为色谱柱柱长460mm、直径15-49mm，固定相为硅胶，流动相a为甲醇，b为二氯甲烷，色谱条件为0-30min，0％b，30-60min，0-100％b，60-90min，100％b，进样量为20-130g，流速为10-57ml/min；
[0066]
步骤3，微孔树脂柱富集：fr1用加入其质量10倍的甲醇溶解得到滤液b，滤液b按硅胶的量：样品的量＝1:1.14拌样并干燥，即得异叶青兰含有目标成分的组分fr1拌样样品439.53g，该样品经装有微孔树脂的中压色谱柱分离，经检测波长为210nm的紫外检测器检测，收集制备色谱图中第四个主要的色谱峰馏分(如附图2所示)，该馏分经减压干燥即得44.2g异叶青兰含有目标成分的组分fr14；其中，微孔树脂柱分离的工作参数为：色谱柱柱长460mm、直径15-49mm，微孔树脂柱固定相为chp20p，流动相a为水，b为甲醇，色谱条件为0-150min，20-100％b，150-210min，100％b，进样量为50g，流速为57ml/min；其中，减压干燥的条件为真空度150mbar，温度55℃；hplc分析条件为：reprosil-pur c18 aq(250
×
4.6mm，5μm)色谱柱，检测波长为210nm，流动相a为色谱纯水，流动相b为乙腈溶液，按照0-60min，40-75％b，流动相流速为1.0ml/min；
[0067]
步骤4，在线自由基清除剂组分筛选：在所述异叶青兰含有目标成分的组分fr14中加入其质量7倍的体积浓度为80％的甲醇进行溶解，配制样品浓度为90.0mg/ml，经0.45μm微孔滤膜过滤，得到异叶青兰fr14甲醇样品溶液，即滤液c，取1ml滤液c，利用在线hplc-dpph色谱联用系统筛选异叶青兰含有目标成分的组分中自由基清除剂(如附图3所示)；其中，所述在线hplc-dpph色谱联用系统，第一台高效液相色谱仪采用reprosil-pur c18 aq(250
×
4.6mm，5μm)色谱柱，流动相a为色谱纯水，流动相b为乙腈溶液，按照0-60min，40-75％b，流动相流速为1.0ml/min，检测波长为210nm；第二台高效液相色谱仪进乙醇溶解的dpph溶液浓度为25μg/ml，检测波长为517nm，流动相流速为0.8ml/min；反应环长度为18m；
[0068]
步骤5，diol二醇基柱富集：滤液c按硅胶的量：样品的量＝1:1拌样并干燥，即得异叶青兰含有目标成分的组分fr14拌样样品88.4g，该样品经diol二醇基中压色谱柱分离，经检测波长为280nm的紫外检测器检测，收集制备色谱图中第一个主要的色谱峰馏分(如附图4所示)，该馏分经减压干燥即得9.98g异叶青兰含有目标成分的组分fr141；其中，减压干燥的条件为：真空度150mbar，温度55℃；diol二醇基柱分离的工作参数为：色谱柱柱长500mm、直径50mm，固定相为diol，流动相a为正己烷，b为乙酸乙酯，色谱条件为0-90min，0-100％b，检测波长为280nm，进样量为45g，流速为57ml/min；
[0069]
步骤6，在线自由基清除剂组分再筛选：在所述异叶青兰含有目标成分的组分fr141中加入其质量8倍的体积浓度为80％的甲醇进行溶解，配制样品浓度为90.0mg/ml，经0.45μm微孔滤膜过滤，得到异叶青兰fr141样品溶液，即滤液d，取1ml滤液d，利用在线hplc-dpph色谱联用系统筛选异叶青兰含有目标组分中自由基清除剂色谱峰1-3(如附图5所示)；
其中，所述在线hplc-dpph色谱联用系统，第一台高效液相色谱仪采用reprosil-pur c18 aq(250
×
4.6mm，5μm)色谱柱，流动相a为色谱纯水，流动相b为乙腈溶液，按照0-60min，40-75％b，流动相流速为1.0ml/min，检测波长为210nm；第二台高效液相色谱仪进乙醇溶解的dpph溶液浓度为25μg/ml，检测波长为517nm，流动相流速为0.8ml/min；反应环长度为18m；
[0070]
步骤7，spherical c18色谱柱制备：滤液d按硅胶的量：样品的量＝1:1拌样并干燥，即得异叶青兰含有目标成分的组分fr141拌样样品20g，该样品经spherical c18中压色谱柱分离，经检测波长为210nm的紫外检测器检测，收集制备色谱图中第二个主要的色谱峰馏分(如附图6所述)，该馏分经减压干燥即得924mg异叶青兰含有目标成分的组分fr1412；其中，spherical c18色谱柱制备的工作参数为：色谱柱柱长500mm、直径50mm，固定相为spherical c18，流动相a为水，b为乙醇，色谱条件为0-90min，55-75％b，检测波长为210nm，进样量为10g，流速为57ml/min；其中，减压干燥的条件为：真空度150mbar，温度55℃；
[0071]
步骤8，反相制备柱分离：在所述异叶青兰含有目标成分的组分fr1412中加入其质量7倍的体积浓度为90％的甲醇进行溶解，配制样品浓度为80.0mg/ml，经0.45μm微孔滤膜过滤，得到异叶青兰fr1412样品溶液，即滤液e，取1ml滤液e，使用在线hplc-dpph色谱联用系统对滤液e进行分析和活性峰筛选(详见附图7)，然后将分析条件进行线性放大，对滤液e进行反相制备色谱柱分离，经检测波长为210nm的紫外检测器检测，收集制备色谱图中对应的色谱峰馏分fr14123、fr14124和fr14126(详见附图8)，经减压干燥分别得到含有目标化合物1的组分fr14123，质量为102mg，含有目标化合物2的组分fr14124，质量为78mg，含有目标化合物3和4的组分fr14126，质量为95mg；其中，减压干燥的条件为：真空度150mbar，温度55℃；在线hplc-dpph色谱联用系统，第一台高效液相色谱仪采用reprosil-pur c18 aq(250
×
4.6mm，5μm)反相色谱柱，检测波长为210nm，流动相a为色谱纯水，流动相b为乙腈溶液，按照0-60min，55％b洗脱，流速为1.0ml/min；第二台高效液相色谱仪进乙醇溶解的dpph溶液，检测波长为517nm；dpph溶液浓度为25μg/ml，流动相流速为0.8ml/min；反应环长度为18m；反相制备液相色谱纯化的工作参数为：色谱柱柱长250mm、直径20mm，反相制备柱固定相为5μm的reprosil-pur c18 aq填料，流动相a为色谱纯水，流动相b为乙腈溶液，按照0-60min，55％b洗脱，进样体积为0.5ml，流速为19ml/min；
[0072]
步骤9，fr1423、fr1424和fr1426反相苯基柱液相色谱纯化：分别含有目标化合物1～4的组分fr14123、fr14124和fr14126分别用体积分数为90％的甲醇-水溶液溶解，配制样品浓度为50.0mg/ml，均经0.45μm微孔滤膜过滤，得到滤液，即滤液f、g和h，使用在线hplc-dpph色谱联用系统对滤液f、g和h进行分析和活性峰筛选(如附图9、11和13所示)，然后将分析条件进行线性放大，对滤液f、g和h进行反相液相制备色谱纯化，经检测波长为210nm的紫外检测器检测，收集滤液f、g和h制备色谱图中主要的色谱峰馏分(详见附图10、12和14)，该色谱峰馏分经减压干燥即得纯度大于95％的自由基清除剂5-methoxy-[6]-gingerol，标记为1号，质量为7.55mg；6-shogaol，标记为2号，质量为5.33mg；6-paradol，标记为3号，质量为12.55mg；diacetoxy-6-gingerdiol，标记为4号，质量为5.70mg；其中，化学结构式详见附图19；其中，减压干燥的条件为真空度150mbar，温度55℃；在线hplc-dpph色谱联用系统，第一台高效液相色谱仪采用kromasil 100-5phenyl(250
×
4.6mm，5μm)反相色谱柱，检测波长为210nm，流动相a为色谱纯水，流动相b为乙腈溶液，组分fr14123分离的流动相为体积分数40％乙腈-水溶液，洗脱60分钟，组分fr14124分离的流动相为体积分数42％乙腈-水溶液，
洗脱60分钟，fr14126分离的流动相为体积分数38％乙腈-水溶液，洗脱120分钟，流速均为1.0ml/min；第二台高效液相色谱仪进乙醇溶解的dpph溶液，检测波长为517nm；dpph溶液浓度为25μg/ml，流动相流速为0.8ml/min；反应环长度为18m；反相制备液相色谱纯化的工作参数为：色谱柱柱长250mm、直径20mm，反相制备柱固定相为5μm的kromasil 100-5phenyl填料，组分fr14123、组分fr14124和组分fr14126使用的流动相与在线hplc-dpph色谱联用系统中第一台高效液相色谱仪中流动相相同，进样体积均为0.5ml，流速为19ml/min。
[0073]
上述异叶青兰中姜辣素类天然自由基清除剂在制备自由基清除药物或保健食品中应用，具体作为有效成分按药学上可接受的任何载体制成各类药用制剂，或作为有效成分按食品科学上可接受的任何载体制成各类保健类食品。
[0074]
实施例2
[0075]
异叶青兰中姜辣素类天然自由基清除剂的活性验证：
[0076]
分别在分离得到的异叶青兰中姜辣素类天然自由基清除剂1～4中加入其质量5倍的色谱甲醇进行溶解，配制样品浓度为0.1mg/ml，经0.45μm微孔滤膜过滤，得到异叶青兰中姜辣素类天然自由基清除剂样品溶液，取1ml样品，利用在线hplc-dpph色谱联用系统验证异叶青兰中姜辣素类天然自由基清除剂1～4的活性(如附图15-18所示)。
[0077]
其中，在线hplc-dpph色谱联用系统，第一台高效液相色谱仪采用reprosil-pur c18 aq(250
×
4.6mm，5μm)反相色谱柱，第一台高效液相色谱仪采用的流动相a为色谱纯水，流动相b为乙腈溶液，48％乙腈等度洗脱60分钟，流动相流速为1.0ml/min，检测波长为210nm；第二台高效液相色谱仪进甲醇溶解的dpph溶液，dpph溶液浓度为25μg/ml，流动相流速为0.8ml/min；反应环长度为18m，检测波长为517nm。
[0078]
从异叶青兰中得到的姜辣素类天然自由基清除剂为5-methoxy-[6]-gingerol(化合物1)，6-shogaol(化合物2)，6-paradol(化合物3)，diacetoxy-6-gingerdiol(化合物4)结构表征见附图24-35。
[0079]
实施例3
[0080]
异叶青兰中得到的姜辣素类天然自由基清除剂的抗氧化活性试验：
[0081]
dpph溶液的配制：称取2.5mg dpph试剂，加100.0ml乙醇溶解，配成浓度为25μg/ml的溶液，并在0-4℃下避光保存。
[0082]
样品溶液的配制：将分离出的姜辣素类天然自由基清除剂1～4用乙醇配制成1.0mg/ml的母液，然后制备成不同浓度的溶液(0.1,1,10,50,100,500μg/ml)。
[0083]
在96孔板中加入30μl样品溶液和70μl dpph溶液。所有测量需做3个平行。然后将混合溶液在黑暗中孵育30分钟。测定混合物在517nm处的紫外吸光度，记为a。每个样品重复3次。dpph自由基的清除率按下式计算(计算时质量浓度根据分子质量转换为摩尔浓度)。
[0084][0085]
其中a0为空白组(乙醇)的吸光度，a1为对照组的吸光度，a为样品(姜辣素类自由基清除剂1～4样品溶液30μl和dpph溶液70μl)的吸光度。
[0086]
以dpph自由基的清除率方法检测抗氧化活性，如附图20-23所示，结果显示姜辣素类自由基清除剂1～4的dpph清除率的ic
50
值分别为：55.77
±
2.98μm、67.69
±
7.95μm、57.86
±
4.16μm和7.76
±
1.67μm。表明姜辣素类化合物具有很好的抗氧化作用，可作为天然抗氧
化剂。
[0087]
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。