LncRNA生物标志物在结直肠癌诊疗中的应用

所属的技术人员知道，本发明可以实现为设备、方法或计算机程序产品。因此，本公开可以具体实现为以下形式，即：可以是完全的硬件、也可以是完全的软件(包括固件、驻留软件、微代码等)，还可以是硬件和软件结合的形式，本文一般称为“单元”或“系统”。

背景技术：

1、结直肠癌(colorectal cancer，crc)是全球范围内常见的恶性肿瘤之一，估计2020年全球crc年龄标化发病率为19.5/10万，死亡率为9.0/10万。crc在发达国家发病率较高，美国近5年crc年龄标化发病率约为38.7/10万，死亡率为13.9/10万。在我国，随着人们生活水平的提高与饮食结构的改变，crc发病率逐年上升。国家癌症中心统计数据显示，2015年我国crc新发38.8万例，死亡18.7万例。根据2020年globocan的最新估算数据，crc已成为我国发病率排名第二的恶性肿瘤，估计年龄标化发病率为23.9/10万，死亡率为12.0/10万。crc的预后与诊断时的疾病分期密切相关。美国国家癌症研究所的seer(surveillance，epidemiology，and endresults)数据库显示，局限期crc的5年生存率可达90.6％，而转移性crc的5年生存率仅为14.7％。

2、多数散发性crc由癌前病变缓慢进展而来，一般认为需要5～10年时间。这种生物学行为决定了crc是为数不多的能够通过人群筛查有效检出并治疗从而改善疾病预后的恶性肿瘤之一。研究证据已表明结直肠癌筛查和早诊早治可以有效降低结直肠癌的死亡率。传统的结直肠癌筛查方法包括免疫粪便潜血检测(fecal immunochemical test，fit)、结肠镜、软式乙状结肠镜、ct仿真结肠镜等。然而这些筛查手段应用于人群筛查时存在一定的局限性，如内镜检查属于侵入性操作、人群依从性较差、对操作人员技术水平要求较高；fit对结直肠癌前病变诊断效能有限等。近年来，随着对结直肠癌发生发展中遗传学和表观遗传学变化的深入了解以及生物检测技术的不断进步，人体血液、粪便和尿液等生物载体中的dna、rna、蛋白质及微生物等作为结直肠癌筛查和早期诊断生物标志物的潜能备受关注，这些标志物具有采样简便、风险较小等特点，有望成为下一代新型结直肠癌筛查和早期诊断检测靶点。

3、lncrna是长度超过200个核苷酸的非编码rna分子，在调节肿瘤细胞增殖、细胞凋亡和迁移方面发挥着重要的生物学功能。目前lncrna已经开始用于结直肠癌诊断的研究。研究证据表明，血液循环中的neat1_v1和neat1_v2区分结直肠癌患者和健康人群，zfas1,snhg11,linc00909及linc006544种lncrna的组合可诊断早期结直肠癌，但其检测的灵敏度、特异性和阳性预测值都不十分令人满意，仍需要灵敏度和特异性更高和更多的lncrna生物标志物。

技术实现思路

1、为了解决现有技术存在的问题，本发明经过广泛而深入的研究，一是采用wilcoxon秩和检验评估lncrna在结直肠癌样本和癌旁样本中的表达差异，二是实验测定了其在人的正常结肠上皮细胞(hco epic)与结肠癌细胞(hct116，lovo)的表达水平，通过以上两种方法，发现其中具有明显表达差异的lncrna，从而探讨其与结直肠癌的诊断和预后之间的关系，继而为结直肠癌的诊断及靶向治疗寻找更好的途径和方法。

2、本发明的目的在于提供一种用于结直肠癌诊断或预测预后的产品，所述产品包括用于检测生物标志物表达水平的试剂，生物标志物是多个lncrna的组合。

3、本发明采用了如下技术方案：

4、本发明一方面提供了一种生物标志物，所述生物标志物包括以下一种或多种lncrna：ac092687.3，loc100506691，itgb8-as1，zeb1-as1，loc100507403，entpd1-as1，linc00261。

5、本发明另一方面提供了检测所述的生物标志物表达水平的试剂在制备诊断结直肠癌的产品中的应用。

6、本发明包括任何本领域可用的检测所述生物标志物表达的方法。“检测表达”是指确定内在基因的lncrna转录物或存在。检测本公开的内在基因的lncrna转录物的方法包括测序技术、核酸杂交技术、核酸扩增技术，核酸扩增技术选自聚合酶链式反应、逆转录聚合酶链式反应、转录介导的扩增、连接酶链式反应、链置换扩增和基于核酸序列的扩增，聚合酶链式反应是实时荧光定量pcr。

7、进一步，所述生物标志物是以下一种或两种lncrna：loc100507403，loc100506691。

8、进一步，与正常结直肠组织相比，所述生物标志物中的entpd1-as1、loc100506691、zeb1-as1在结直肠癌组织样本中的表达水平显著上调，loc100507403在结直肠癌组织样本中的表达水平显著下调。

9、许多表达检测方法使用分离的rna.起始材料典型地是从生物样品，例如分别从肿瘤或肿瘤细胞系，以及相应的正常组织或细胞系分离的总rna。如果rna的来源是原发性肿瘤，则可以从冷冻的或保存的石蜡包埋并固定的(例如福尔马林固定的)组织样品(例如病理学家指导的组织核心样品)中提取的总rna。

10、rna提取的一般方法是本领域熟知的。特别地，可以使用来自商业制造商，例如tiangen的纯化试剂盒、缓冲剂套组和蛋白酶进行rna分离，按照制造商的说明进行。其它可商购的rna分离试剂盒包括masterpuretm complete dna和rna纯化试剂盒(epicentre，madison，wis.)和paraffin block rna分离试剂盒(ambion，austin，tx)。例如，可以使用rna stat-60(tel-test,friendswood，tx)从组织样品中分离总rna。例如，可以使用高纯ffpe rna microkit，货号04823125001(roche applied science，indianapolis，in)从ffpe中分离总rna。例如，可以通过氯化铯密度梯度离心分离从肿瘤制备的rna。此外，可以通过使用本领域技术人员熟知的技术容易地处理大量组织样品。

11、进一步，所述试剂包括特异性识别所述生物标志物的探针、和/或特异性扩增所述生物标志物的引物。

12、进一步，所述引物如seq id no:1-seq id no:14所示。

13、本发明另一方面提供了一种用于诊断结直肠癌的产品，所述产品包含检测所述的生物标志物表达水平的试剂。

14、进一步，所述产品包括芯片、试剂盒、高通量测序平台。

15、芯片包括固相载体以及固定在固相载体的特异性识别所述生物标志物的寡核苷酸探针，试剂盒包括特异性扩增所述生物标志物的引物、特异性识别所述生物标志物的寡核苷酸探针或芯片。

16、所述固相载体包括无机载体和有机载体，所述无机载体包括但不限于有硅载体、玻璃载体、陶瓷载体等；所述有机载体包括聚丙烯薄膜、尼龙膜等。

17、进一步，所述试剂包括所述生物标志物的探针、和/或特异性扩增所述生物标志物的引物。

18、进一步，所述引物如seq id no:1-seq id no:14所示。

19、本发明另一方面提供了检测生物标志物表达水平的试剂在制备用于预测结直肠癌预后的产品中的应用，所述产品包含检测所述的生物标志物表达水平的试剂。

20、进一步，所述生物标志物是ac092687.3、loc100506691、itgb8-as1、zeb1-as1、loc100507403、entpd1-as1、linc00261的组合。

21、本发明另一方面提供了一种用于预测结直肠癌预后的产品，所述产品包含检测所述的生物标志物表达水平的试剂。

22、进一步，所述生物标志物是ac092687.3、loc100506691、itgb8-as1、zeb1-as1、loc100507403、entpd1-as1、linc00261的组合。

23、特异性识别所述生物标志物的寡核苷酸探针可以是dna、rna、dna-rna嵌合体、pna或其它衍生物。所述探针的长度没有限制，只要完成特异性杂交、与目的核苷酸序列特异性结合，任何长度都可以。所述探针的长度可短至25、20、15、13或10个碱基长度。同样，所述探针的长度可长至60、80、100、150、300个碱基对或更长，甚至整个基因。由于不同的探针长度对杂交效率、信号特异性有不同的影响，所述探针的长度通常至少是14个碱基对，最长一般不超过30个碱基对，与目的核苷酸序列互补的长度以15-25个碱基对最佳。所述探针自身互补序列最好少于4个碱基对，以免影响杂交效率。

24、作为一种实施方案，所述产品包含芯片、试剂盒、高通量测序平台。试剂盒包含一组寡核苷酸引物，所述引物足以检测和/或定量本发明所述的内在基因。寡核苷酸引物可以以冻干或重构的形式提供，或者可以作为一组核苷酸序列提供。在一个实施方案中，以微孔板(microplate)的形式提供引物，其中每一个引物组占用微孔板中的一个孔(或多个孔，如在重复的情况下)。微孔板可以进一步包含足以检测如下所述的一个或多个看家基因的引物。试剂盒可以进一步包含足以扩增本发明所述的基因的表达产物的试剂和说明。

25、本发明另一方面提供了一种结直肠癌预后风险预测模型的构建方法，所述构建方法包括将ac092687.3、loc100506691、itgb8-as1、zeb1-as1、loc100507403、entpd1-as1、linc00261通过多因素cox模型拟合，利用逐步回归算法降维，构建风险预测模型。

26、进一步，所述风险预测模型利用以下公式计算风险评分：

27、risk score＝(-0.1204)×itgb8-as1表达量+(0.1797)×zeb1-as1表达量+(0.0413)×loc100506691表达量+(-0.0661)×linc00261表达量+(-0.0334)×loc100507403表达量+(-0.0563)×entpd1-as1表达量+(0.0697)×ac092687.3表达量。

28、本发明另一方面提供了一种结直肠癌预后的风险预测系统，所述风险预测系统包括计算单元，所述计算单元利用所述的风险预测模型计算风险评分。

29、进一步，所述风险预测系统还包括检测单元，所述检测单元用于检测ac092687.3、loc100506691、itgb8-as1、zeb1-as1、loc100507403、entpd1-as1、linc00261的表达量。

30、进一步，所述风险预测系统还包括信息获取单元，所述信息获取单元用于执行获取受试者检测信息的操作，所述检测信息包括ac092687.3、loc100506691、itgb8-as1、zeb1-as1、loc100507403、entpd1-as1、linc00261的表达量。

31、进一步，所述风险预测系统还包括评估单元，所述评估单元用于执行根据所述计算单元的计算结果预测受试者结直肠癌预后的风险高低。

32、进一步，所述风险预测系统还包括结果显示单元，所述结果显示单元用于显示所述评估单元得出的结论。所述结果显示单元通过屏幕显示、声音播报或打印的方式显示结果。

33、应当理解，本文使用的“系统”、“单元”是用于区分不同级别的不同组件、元件、部件、部分或装配的一种方法。然而，如果其他词语可实现相同的目的，则可通过其他表达来替换所述词语。