使用红麻浆生产乳酸的方法与流程

1.本发明涉及生产乳酸的方法，具体涉及使用红麻浆生产乳酸的方法。


背景技术：

2.乳酸是一种羧酸化合物，是聚乳酸的前体，可作为食品添加剂、化妆品添加剂、纺织加工剂、可生物降解的环保塑料等的主要原料。乳酸被应用于多个领域，特别是用于生产奶酪和干酪蛋白，以控制酸度和提供风味，也可用于生产葡萄酒、果汁、果酱、果冻或啤酒。乳酸可以通过化学法或生物法合成，已知通过生物法生产的乳酸纯度更高。
3.近年来，利用微生物生产乳酸的研究正逐渐开展。乳酸的常规生产方法是通过乳酸杆菌属的乳酸菌生产，但是乳酸菌的耐酸性较低，存在乳酸生产效率低的问题。
4.另一方面，红麻原产于西非，是锦葵科一年生草本植物，已被美国农业部农业研究局(ars)指定为最适合纸浆和纸张替代品的非木材材料。红麻在播种4～5个月后可长至4～5m大小，红麻极易存活、生长快速，具有抗盐、抗重金属等特性，在贫瘠、干燥或潮湿的土壤中存活状态良好。
5.红麻主要分为芯部和韧皮部，芯部主要用作工业吸水剂或垫子的原料，韧皮部经放软、精炼、漂白等工艺可制成天然纤维。用化学品或酶(例如硫化钠、氢氧化钠和氯)去除红麻韧皮中的木质素可获得红麻浆。
6.当红麻中存在的多糖被如纤维素酶或半纤维素酶的糖化酶分解时，可产生葡萄糖、木糖等可溶性糖，这些可溶性糖可用于微生物的生长。因此，打算对通过建立红麻的糖化条件和使用微生物的发酵条件来提高乳酸生产效率的方法进行研究。
7.韩国专利第1517585号公开了“一种通过同时糖化和发酵从姜黄废料生产乳酸的方法”，韩国专利第2088764号公开了一种“使用咖啡渣生产乳酸的方法”，但是没有描述本发明的“使用红麻浆生产乳酸的方法”。


技术实现要素：

8.(一)解决的技术问题
9.针对现有技术的不足，本发明提供了使用红麻浆生产乳酸的方法，为提高乳酸产量的红麻浆和去除了cyb2(细胞色素b2)基因的酿酒酵母建立了预处理、糖化和发酵的条件，解决了乳酸产量低的问题。
10.(二)技术方案
11.为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：
12.使用红麻浆生产乳酸的方法，其特征在于，具体步骤包括：
13.(a)向红麻浆中添加硫酸溶液进行预处理；
14.(b)使用糖化酶、氮源和酵母处理步骤(a)中预处理后的红麻浆，进行糖化和发酵。
15.优选的，所述步骤(a)中的红麻浆是通过从红麻原料中去除木质素而制备的。
16.优选的，所述步骤(a)的预处理中，将0.5～5％(v/v)的硫酸溶液以5～15倍于红麻
浆干重的用量加入到红麻浆中，并在80～130℃下处理10～50min。
17.优选的，所述步骤(b)中的糖化酶优选为纤维素酶、半纤维素酶、β-葡萄糖苷酶、β-琼脂酶、β-半乳糖苷酶、内切-1，4-β-葡聚糖酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、淀粉葡萄糖苷酶、海带多糖酶、α-d-葡萄糖苷酶、蔗糖酶、麦芽糖酶、异麦芽糖酶以及乳糖酶中的一种或多种酶混合。
18.优选的，所述步骤(b)中的氮源优选为酵母提取物和蛋白胨的混合物。
19.优选的，所述步骤(b)中的酵母优选为登记号为kctc14858bp的酿酒酵母bk02菌株。
20.优选的，所述酿酒酵母bk02菌株去除了cyb2(细胞色素b2)基因。
21.优选的，所述步骤(b)中的糖化发酵优选在20～40℃、ph 6～7、120～140rpm、发酵60～84h的条件下进行。
22.一种使用上述生产方法生产的乳酸。
23.(三)有益效果
24.本发明提供了使用红麻浆生产乳酸的方法。与现有技术相比，具备以下有益效果：
25.本发明使用糖化酶、氮源和酵母处理红麻浆，使红麻浆进行糖化发酵反应，为红麻浆和去除了cyb2(细胞色素b2)基因的酿酒酵母建立了预处理、糖化和发酵的条件，提高了乳酸的产量。
附图说明
26.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
27.图1示出了红麻浆预处理条件的建立。其中，图1a是红麻浆经过稀酸预处理、图1b是红麻浆经过水热预处理后，分别加入糖化酶(ctec2)等反应，并检测出的葡萄糖、木糖和醋酸盐浓度的结果图。
28.图2示出了红麻浆糖化发酵ph条件的建立，依次示出ph 5.5或ph 6.5下木糖、葡萄糖、乙醇、乳酸和醋酸盐的浓度对比图。经过稀酸预处理并中和至ph 5.5或ph 6.5后，加入糖化酶(ctec2)、氮源(1％酵母提取物和2％蛋白胨的混合物)和酿酒酵母bk01菌株后反应。
29.图3示出了红麻浆糖化发酵添加氮源条件的建立。红麻浆经稀酸预处理并中和至ph 6.5后，加入糖化酶(ctec2)、不同浓度的氮源和酿酒酵母bk01菌株后反应，检测出乳酸浓度。
30.0.0x：无氮源添加组；1.0x：1％酵母提取物和2％蛋白胨混合物的添加组；2.0x：2％酵母提取物和4％蛋白胨混合物的添加组；3.0x：3％酵母提取物和6％蛋白胨混合物的添加组。
31.图4示出了本发明的酿酒酵母bk02菌株的制备图。
32.其中，图4a是酿酒酵母中“cyb2基因启动子(cyb2p)-cyb2-终止子(cyb2t)”与供体dna中“cyb2基因启动子(cyb2p)-cg#1-终止子(cyb2t)”的示意图。
33.图4b是去除了酿酒酵母bk01菌株中的cyb2基因，并插入cg#1的序列。其中，标记1)为cyb2基因启动子(cyb2p)的部分序列；标记2)为grna序列；标记3)为cyb2基因终止子(cyb2t)的部分序列；下划线为供体dna中的cyb2p和cyb2t序列。
34.图5示出了使用不同菌株/不添加菌株后红麻浆糖化发酵效果分析。红麻浆经过稀酸预处理并中和至ph 6.5后，加入糖化酶(ctec2)、氮源(1％酵母提取物和2％蛋白胨的混合物)和不同菌株反应后，分别检测出木糖、葡萄糖、乳酸、醋酸盐和乙醇的浓度。
35.bk01：未去除cyb2基因的酿酒酵母bk01菌株添加组；bk02：去除cyb2基因的酿酒酵母bk02菌株添加组；control：无菌株组。
具体实施方式
36.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
37.本技术实施例通过提供使用红麻浆生产乳酸的方法，解决了乳酸产量低的问题，为红麻浆和去除了cyb2(细胞色素b2)基因的酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)建立了预处理、糖化和发酵的条件，提高了乳酸的产量，作为生产bk02菌株并将其用于红麻浆发酵的结果，证实了与未去除cyb2基因的未处理组或酿酒酵母bk01菌株处理组相比，乳酸产量增加完成。
38.为了更好的理解上述技术方案，下面将结合说明书附图以及具体的实施方式对上述技术方案进行详细的说明。
39.为了实现本发明的目的，本发明提供使用红麻浆生产乳酸的方法，具体步骤包括：
40.(a)向红麻浆中添加硫酸溶液进行预处理；
41.(b)使用糖化酶、氮源和酵母处理步骤(a)中预处理后的红麻浆，进行糖化和发酵。
42.在本发明的乳酸生产方法中，步骤(a)中的红麻浆可以通过从红麻原料中去除木质素获得。
43.更优选的，通过使用硫化钠(nas)和氢氧化钠来去除木质素，但不限于此。
44.在本发明的乳酸生产方法中，步骤(a)中的预处理是将0.5～5％(v/v)的硫酸溶液以5～15倍于红麻浆干重的用量加入到红麻浆中(以生产量为基准)，在80～130℃下处理10～50min。
45.更优选的，将10倍于红麻浆干重的1％(v/v)硫酸溶液加入到红麻浆中，在121℃下处理30min，但不限于此。
46.在本发明的乳酸生产方法中，步骤(b)中的糖化酶是纤维素酶、半纤维素酶、β-葡萄糖苷酶、β-琼脂酶、β-半乳糖苷酶、内切-1，4-β-葡聚糖酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、淀粉葡糖苷酶、海带多糖酶、α-d-葡糖苷酶、蔗糖酶、麦芽糖酶、异麦芽糖酶和乳糖酶中的一种或多种。
47.更优选的，糖化酶是纤维素酶与半纤维素酶的混合酶。
48.在本发明的乳酸生产方法中，步骤(b)中的氮源可以是酵母提取物和蛋白胨的混合物。
49.优选为0.5～1.5％(v/v)的酵母提取物和1.5～2.5％(v/v)的蛋白胨的混合物。
50.更优选为1％(v/v)的酵母提取物和2％(v/v)的蛋白胨的混合物，但不限于此。
51.在本发明的乳酸生产方法中，步骤(b)中的糖化发酵优选在20～40℃、ph 6～7、120～140rpm、发酵60～84h的条件下进行。
52.更优选在30℃、ph 6.5、130rpm的条件下进行。更优选的发酵时间为72h，但不限于此。
53.在本发明的乳酸生产方法中，步骤(b)中的酵母优选为酿酒酵母bk02菌株(登录号：kctc14858bp)，但不限于此。酿酒酵母bk02菌株的特征在于去除了cyb2(细胞色素b2)基因(参见实施例3和图4)。
54.步骤(b)中的酵母可以是酿酒酵母bk02菌株或其培养基，但不限于此。培养基为酿酒酵母bk02菌株的培养基，其可以包括但不限于培养液浓缩物或培养液干燥品。
55.培养基可以通过微生物的常规培养方法大量培养而获得，作为培养基，可以使用含有碳源、氮源、维生素和矿物质的培养基。
56.本发明菌株的培养方法可以按照本领域常用的方法进行培养，不限于特定的方法。
57.本发明还提供了通过该方法生产的乳酸。
58.实施例1：红麻浆预处理条件的建立
59.使用硫化钠(na2s)和氢氧化钠(naoh)处理粗红麻，制备除去木质素的红麻浆。
60.预处理条件的建立：红麻浆经过稀酸预处理(本发明处理条件)或水热预处理(对照组)后，分析糖化效率。
61.稀酸预处理：在红麻浆中加入10倍于红麻浆干重的1％(v/v)的硫酸(h2so4)溶液，在121℃下处理30min。
62.水热预处理：在红麻浆中加入10倍于红麻浆干重的水进行水热处理，在121℃下处理30min。
63.糖化处理：将2％(v/v)的糖化酶(ctec2)分别添加至每组(即经稀酸预处理或水热预处理的)红麻浆中，并在30℃、130rpm的条件下搅拌反应96h，只取上清液并通过一个0.2μm的注射器过滤，然后使用hplc测量分析葡萄糖、木糖(xylose)和乙酸盐的浓度。
64.用于hplc分析的色谱柱是rezex roa-organicacid h+(8％)色谱柱(phenomenex inc.)，每个样品的分析条件为0.005nh2so4的流动相、50℃的温度和0.6ml/min的流速。
65.结果表明，用稀酸预处理法(图1a)预处理红麻浆比用水热预处理法预处理红麻浆(图1b)产生更多的葡萄糖、木糖和醋酸盐，使用稀酸预处理法处理红麻浆的糖化效果优异。
66.实施例2：红麻浆糖化及发酵条件的建立
67.2-1.ph条件的建立
68.使用稀酸预处理法对红麻浆进行预处理时，由于低ph可能会阻碍糖化酶的作用，因此需要增加ph的中和过程。一般而言，已知酶作用的合适ph为5～7，中和至ph 5.5或ph 6.5后，分析糖化和发酵效率以建立更优的ph条件。
69.使用稀酸预处理法处理红麻浆，再使用碳酸钙中和红麻浆的ph，分为ph5.5组与ph6.5组，使用2％(v/v)的糖化酶(ctec2)、1％酵母提取物和2％蛋白胨的混合物、酿酒酵母bk01菌株处理两组红麻浆，均在30℃、130rpm的条件下反应72h，分别检测两组中
木糖、葡萄糖、乙醇、乳酸和醋酸盐的浓度，结果如图2所示。
70.结果表明，在ph6.5的条件下，糖化产生的木糖或葡萄糖被用作底物可以产生更多的乙醇、乳酸和醋酸盐。即在ph 6.5的条件下糖化和发酵时，乳酸产量更高。
71.但是，在ph 6.5的条件下反应12小时后，乳酸的产量逐渐减少，可以推断产生的乳酸再次用作碳源并转化为丙酮酸。
72.2-2.氮源添加条件的建立
73.改变氮源的添加浓度，分析红麻浆的糖化和发酵效率。
74.使用稀酸预处理法处理红麻浆，再使用碳酸钙将红麻浆中和至ph6.5，使用2％(v/v)的糖化酶(ctec2)、不同浓度氮源、酿酒酵母bk01菌株处理红麻浆。在30℃、130rpm的条件下反应72h，检测乳酸浓度，结果如图3所示。
75.结果表明，在使用红麻浆生产乳酸的过程中，添加氮源比不添加氮源可产生更多的乳酸，并且添加至少1％酵母提取物和2％蛋白胨的混合物作为氮源是必要的。
76.实施例3：改良菌株的制备
77.cyb2(细胞色素b2)基因被称为编码乳酸脱氢酶的基因，其参与乳酸向丙酮酸的转化。因此，为了防止红麻浆糖化发酵过程中产生的乳酸作为碳源转化为丙酮酸(见图2：反应72小时乳酸产量的示意图)，将制备去除cyb2基因的改良菌株。
78.制备方法为：在本发明人开发的酿酒酵母bk01菌株中载入表达cas9基因的prs41n-cas9质粒(参见jang et al.,2021,j.fungi.7:928与xu et al.,2016,metab.eng.34:88-96)，并在含有100μg/ml clonnat的ypd上筛选改良菌株。
79.在cyb2基因的目标序列中导入grna(seq id no：1)和由“cyb2基因启动子序列-cg#1-cyb2基因的终止子序列”组成的供体dna(seq id no：2)，添加到上述含prs41n-cas9质粒的菌株后，在100μg/ml clonnat和300μg/ml hygromycin的ypd中筛选，制作出在去除cyb2基因的位置上插入cg#1的改良菌株，该改良菌株命名为酿酒酵母bk02菌株(登录号：kctc14858bp)。
80.表1-本发明中使用的grna和供体dna序列
[0081][0082][0083]
实施例4：使用改良菌株进行红麻浆发酵和乳酸产量分析
[0084]
分析添加根据实施例3的方法制备的酿酒酵母bk02菌株的红麻浆发酵效率。
[0085]
将1％(v/v)的硫酸(h2so4)溶液以红麻浆干重10倍的用量加入红麻浆中，在121℃下反应30min，并使用碳酸钙中和至ph 6.5。向其中添加2％(v/v)糖化酶(ctec2)、1％酵母提取物和2％蛋白胨的混合物以及酿酒酵母bk02菌株(od600＝1.0)，在30℃、
130rpm的条件下糖化发酵72h后，分别测量ph、葡萄糖、木糖、乳酸、乙醇和醋酸盐的浓度。
[0086]
将酿酒酵母bk01菌株添加组和未去除cyb2基因的菌株未处理组用作对照组，结果如图5所示。
[0087]
结果表面，未处理组未产生任何乳酸，酿酒酵母bk01菌株添加组产生6g/l的乳酸，而酿酒酵母bk02菌株添加组产生16.1g/l的乳酸。
[0088]
基于以上结果，发现当使用根据本发明的酿酒酵母bk02菌株对红麻浆进行糖化和发酵时，乳酸的产量显著增加。
[0089]
综上所述，与现有技术相比，具备以下有益效果：
[0090]
1、本发明使用红麻浆生产乳酸，并建立了预处理、糖化和发酵的条件，乳酸的产量显著增加。
[0091]
2、红麻浆中加入去除了cyb2(细胞色素b2)基因的酿酒酵母bk02菌株，相较于未去除cyb2基因的未处理组或酿酒酵母bk01菌株添加组相比，乳酸产量显著增加，说明酿酒酵母bk02菌株对于乳酸增产具有显著效果。
[0092]
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个
……”
限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
[0093]
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。