1.本技术涉及骨髓间充质干细胞
技术领域：
：，尤其涉及骨髓间充质干细胞的外泌体、体外培养方法以及应用。
背景技术：
：：2.间充质干细胞(mesenchymalstemcells，mscs)主要的生物学特性包括高度的自我更新、多向分化及独特的免疫调节能力，其免疫调节能力则主要是通过mscs与先天免疫和适应性免疫系统的细胞相互作用，分泌细胞调节性因子发挥免疫调节功能。来源于间充质干细胞外泌体(exosomesfrommesenchymalstemcells，mscs-exo)在组织的修复、免疫调节及疾病的治疗过程中发挥着至关重要的作用，可能为临床疾病诊断和治疗提供新的策略。3.mscs-exo不仅表达所有外泌体共同表达的蛋白标志物，还表达mscs细胞膜表面的一些黏性分子(如：cd90、cd105、cd29、cd44、cd73)。同时，也存在一些其他种类的蛋白如alix、tsg101、肌动蛋白、微管蛋白、膜联蛋白(i、ii、v和vi)及一些信号转导蛋白和组织相融性抗原。另外，mscs-exo富含胆固醇和鞘磷脂，具有脂质双分子层结构，从mscs-exo中分离得到的脂肪酸主要有花生四烯酸、二十二碳六烯酸、白三烯、磷脂酸和前列腺素溶血磷脂酰胆碱。除此之外，mscs-exo内还含有大量的rna(microrna和mrna)，少量线粒体dna(mtdna)、长链非编码rna(lncrna)、核糖体rna(rrna)、pirna、trna、snorna和snrna。4.由于外泌体中功能蛋白往往由被其分泌的细胞所决定，对于其中所包含的功能蛋白，在一些应用领域如医用填充物、创面修复或皮肤再生领域，需要发挥具有促进细胞增殖、再生和分化的作用，因而需要对外泌体中的功能蛋白成分的差异表达进行调控，而对其进一步研究和发掘，以适应更多应用领域。技术实现要素：5.有鉴于此，本技术的目的在开拓新型的外泌体，以促使其具有促进细胞增殖、再生和分化的作用，以适应更多应用领域。6.第一方面，本技术实施例公开了一种骨髓间充质干细胞的外泌体，以elisa方法检测结果计，所述外泌体包含colii、cxcl9、vegf-a、ets1、pdzk1、kdr、p-kdr、cx26、cx30、cx31和cx31.1蛋白，所述外泌体不包含colii、cxcl9、vegf-a、ets1和pdzk1相关核酸物质。7.在本技术实施例中，所述外泌体的平均粒径为82.9～111.0nm，pdi值为0.162～0.210。8.第二方面，本技术实施例公开了第一方面所述的外泌体的体外培养方法，包括以下步骤：9.获得骨髓间充质干细胞的工作种子细胞；10.第一次传代培养以得到第一代细胞培养物，所述第一代细胞培养物是将所述工作种子细胞接种于第一条件培养基培养得到的，所述第一传代培养基为包含1-(5-哇啉磺酰基)-2-甲基哌嗪(h-7)的dmem/f12培养液；11.第二次传代培养以得到第二代细胞培养物，所述第二代细胞培养物是将所述第第一代细胞接种于第二条件培养基培养得到的，所述第二传代培养基为包含4-甲基-5-{[(2s)-2-甲基-1,4-二氮杂环庚-1-基]磺酰基}异喹啉二盐酸盐、6-(环辛基氨基)喹啉-5,8-二酮和转化生长因子-β的dmem/f12培养液；[0012]第三次传代培养以得到第三代细胞培养物，所述第三代细胞培养物是将所述第二代细胞接种于第三条件培养基培养得到的，所述第三代培养物中包含所述外泌体，所述第三条件培养基为包含4-甲基-5-{[(2s)-2-甲基-1,4-二氮杂环庚-1-基]磺酰基}异喹啉二盐酸盐、转化生长因子-β和肝细胞生物因子的dmem/f12培养液；以及[0013]分离纯化所述第三代细胞培养物，以得到所述外泌体。[0014]在本技术实施例中，在进行所述第三次传代培养后，所述体外培养方法还包括以下步骤：将所述第三细胞培养物接种至平铺有温敏凝胶的所述第三培养液中培养，以得到分泌所述外泌体的培养物。[0015]在本技术实施例中，所述第一条件培养基为包含3～15μm1-(5-哇啉磺酰基)-2-甲基哌嗪(h-7)、0.5～2μm地塞米松、10～60μg/ml抗坏血酸、10mmβ-甘油磷酸钠以及10％v/vfbs的dmem/f12培养液。[0016]在本技术实施例中，所述第二条件培养基为包含10～20μm4-甲基-5-{[(2s)-2-甲基-1,4-二氮杂环庚-1-基]磺酰基}异喹啉二盐酸盐、1～5μm6-(环辛基氨基)喹啉-5,8-二酮、5～10ng/ml转化生长因子-β以及10％v/vfbs的dmem/f12培养液。[0017]在本技术实施例中，所述第三条件培养基为包含1～5μm4-甲基-5-{[(2s)-2-甲基-1,4-二氮杂环庚-1-基]磺酰基}异喹啉二盐酸盐、20～50ng/ml转化生长因子-β、100～200ng/ml肝细胞生物因子、100～200ng/ml低氧诱导因子1α以及10％v/vfbs的dmem/f12培养液。[0018]在本技术实施例中，所述第三次传代培养的培养条件为35℃、饱和湿度、5％co2和2％o2，培养时间为48h。[0019]在本技术实施例中，分离纯化所述第三代细胞培养物以得到所述外泌体的步骤具体包括：[0020]所述第三代细胞培养物，用于无菌pbs洗涤后，经300×g、10min；2000×g、10min和10000×g、30min的离心程序进行差速离心后，再次100000×g离心70min，得沉淀用pbs重悬，即为外泌体。[0021]第三方面，本技术实施例公开了第一方面所述的外泌体、或者第二方面所述的体外培养方法制得的外泌体在制备医用填充物、创面修复药物或保健品中的应用。[0022]与现有技术相比，本技术至少具有以下有益效果：[0023]本技术通过对小鼠骨髓间充质干细胞进行三次传代培养以及三维凝胶培养，使得其大量分泌外泌体，由此制得的外泌体包含colii、cxcl9、vegf-a、ets1、pdzk1、kdr、p-kdr、cx26、cx30、cx31和cx31.1蛋白，所述外泌体不包含colii、cxcl9、vegf-a、ets1和pdzk1相关核酸物质。本技术进一步通过细胞试验证实了外泌体中的这些细胞因子、促成骨分化以及血管形成的功能蛋白，具有促使成纤维细胞培养物软骨分化和血管形成的作用，提示该外泌体具有应用于医学填充、创面修复等领域的应用前景。最后，本技术实施例还通过动物实验证实了盖外泌体对小鼠创面的修复功能。附图说明[0024]图1为本技术实施例提供的典型外泌体微观图。[0025]图2为本技术细胞试验中实施例1～6提供的茜素红s染色图，图2a-f依次对应为为实施例1～6.。[0026]图3为本技术细胞试验中对比例1～7和对照组提供的茜素红s染色图，图3a-h依次对应为对照组和对比例1～7。具体实施方式[0027]为了使本技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本技术，并不用于限定本技术。[0028]细胞体外培养[0029]一、材料与方法[0030]1、细胞来源[0031]小鼠骨髓间充质干细胞(mscs)，购自武汉原生原代生物医药科技有限公司，货号mic-cell-0081，5×105细胞数/1ml。[0032]2、工作种子细胞[0033](1)将市售的小鼠骨髓间充质干细胞冻存管从干冰中取出，置于37℃水浴锅中迅速解冻，然后将细胞悬液转移至预先加有小鼠骨髓间充质干细胞完全培养基(snpm-m076，尚恩生物)的离心管中，500g离心5min；[0034](2)取出离心管，弃上清，加入上述干细胞完全培养基重悬细胞，然后将细胞悬液转移至预先加有干细胞完全培养基的100ml细胞培养瓶(英思坦)中，于37℃孵箱中培养；[0035](3)48h后进行首次换液，以后每隔48h换液，待细胞长满培养瓶90％以作为的工作种子细胞，以便进行传代。[0036]3、传代培养[0037]一个具体的实施例1的传代培养过程如下：[0038](1)第一次传代培养[0039]弃去工作种子细胞培养液中的培养基，加入pbs洗1次，替换为第一条件培养基，于37℃、5％co2条件下培养48h，得到第一代细胞。其中，第一条件培养基为包含5μm1-(5-哇啉磺酰基)-2-甲基哌嗪(h-7)(参见“赵京浦，庄明强，姚斌.1-(5-异哇啉磺酰基)-2-甲基哌嗪(h-7)的合成[j].第二军医大学学报，1996,17(3):291～293.”公开的方法合成得到)、2μm地塞米松(sigma)、50μg/ml抗坏血酸(sigma)、10mmβ-甘油磷酸钠(sigma)以及10％v/v(体积比)fbs的dmem/f12培养液。[0040](2)第二次传代培养[0041]将第一次传代培养得到的第一代细胞用pbs清洗1～2次，充分去除其中第一条件培养基后，并调整细胞浓度至106细胞数/1ml的悬液后，接种至含有80ml第二条件培养基的细胞培养瓶中，于35℃、饱和湿度、5％co2条件下培养72h，每24h换液一次，得到第二代细胞。其中，第二条件培养基为包含10μm4-甲基-5-{[(2s)-2-甲基-1,4-二氮杂环庚-1-基]磺酰基}异喹啉二盐酸盐(cas号:451462-58-1，bocsciences)、5μm6-(环辛基氨基)喹啉-5,8-二酮(cas号35961-95-6，chemblink，achemica)、8ng/ml转化生长因子-β(货号p1230，欧凯生物)以及10％v/vfbs的dmem/f12培养液。[0042](3)第三次传代培养[0043]将第二次传代培养得到的第二代细胞用pbs清洗1～2次，充分去除其中第二条件培养基后，并调整细胞浓度至106细胞数/1ml的悬液后，接种至含有80ml第三条件培养基的细胞培养瓶中，于35℃、饱和湿度、5％co2、2％o2条件下培养48h，每24h换液一次，得到第三代细胞。其中，第三条件培养基为包含5μm4-甲基-5-{[(2s)-2-甲基-1,4-二氮杂环庚-1-基]磺酰基}异喹啉二盐酸盐、20ng/ml转化生长因子-β、200ng/ml肝细胞生物因子(cas:72957-37-0，深圳市奥品医药有限公司)、100ng/ml低氧诱导因子1α(产品货号：gh0006，百奥莱博)以及10％v/vfbs的dmem/f12培养液。[0044]一个具体的实施例2的传代培养过程为：其第一条件培养基为包含15μm1-(5-哇啉磺酰基)-2-甲基哌嗪(h-7)、2μm地塞米松、50μg/ml抗坏血酸、10mmβ-甘油磷酸钠以及10％v/vfbs的dmem培养液。其他培养条件与培养过程均与实施例1相同。[0045]一个具体的实施例3传代培养过程为：其第二条件培养基为包含20μm4-甲基-5-{[(2s)-2-甲基-1,4-二氮杂环庚-1-基]磺酰基}异喹啉二盐酸盐、1μm6-(环辛基氨基)喹啉-5,8-二酮、8ng/ml转化生长因子-β以及10％v/vfbs的dmem/f12培养液。其他培养条件与培养过程均与实施例1相同。[0046]一个具体的实施例4传代培养过程为：其第三条件培养基为包含1μm4-甲基-5-{[(2s)-2-甲基-1,4-二氮杂环庚-1-基]磺酰基}异喹啉二盐酸盐、50ng/ml转化生长因子-β、100ng/ml肝细胞生物因子、200ng/ml低氧诱导因子1α以及10％v/vfbs的dmem/f12培养液。其他培养条件与培养过程均与实施例1相同。[0047]一个具体的实施例5传代培养过程为：其第三次传代培养条件为，于35℃、饱和湿度、5％co2、2％o2条件下培养24h，其他培养条件与培养过程均与实施例1相同。[0048]一个具体的对比例1传代培养过程为：其第一条件培养基为包含2μm1-(5-哇啉磺酰基)-2-甲基哌嗪(h-7)、2μm地塞米松、50μg/ml抗坏血酸、10mmβ-甘油磷酸钠以及10％fbs的dmem培养液。其他培养条件与培养过程均与实施例1相同。[0049]一个具体的对比例2传代培养过程为：其第一条件培养基为包含2μm地塞米松、50μg/ml抗坏血酸、10mmβ-甘油磷酸钠以及10％v/vfbs的dmem培养液。其他培养条件与培养过程均与实施例1相同。[0050]一个具体的对比例3传代培养过程为：其第二条件培养基为包含8ng/ml转化生长因子-β以及10％v/vfbs的dmem/f12培养液。其他培养条件与培养过程均与实施例1相同。[0051]一个具体的对比例4传代培养过程为：其第三条件培养基维包含20ng/ml转化生长因子-β、200ng/ml肝细胞生物因子、100ng/ml低氧诱导因子1α以及10％v/vfbs的dmem/f12培养液。其他培养条件与培养过程均与实施例1相同。[0052]一个具体的对比例5传代培养过程为：其第三条件培养基维包含5μm4-甲基-5-{[(2s)-2-甲基-1,4-二氮杂环庚-1-基]磺酰基}异喹啉二盐酸盐、100ng/ml低氧诱导因子1α以及10％v/vfbs的dmem/f12培养液。其他培养条件与培养过程均与实施例1相同。[0053]一个具体的对比例6传代培养过程为：其第三条件培养基维包含5μm4-甲基-5-{[(2s)-2-甲基-1,4-二氮杂环庚-1-基]磺酰基}异喹啉二盐酸盐、200ng/ml肝细胞生物因子以及10％v/vfbs的dmem/f12培养液。[0054]其他培养条件与培养过程均与实施例1相同。[0055]一个具体的对比例7传代培养过程为：其第三传代培养条件为：于35℃、饱和湿度、5％co2培养48h，每24h换液一次。其他培养条件与培养过程均与实施例1相同。[0056]4、细胞外泌体的分离及鉴定[0057]为进一步提升本技术对于mscs的传代培养效果，本技术在实施例1的基础上还实施了实施例6，其过程如下：[0058](1)制得温敏凝胶[0059]采用离子交联法(zhangk,zhaox,chenx,etal.enhancedtherapeuticeffectsofmesenchymalstemcell-derivedexosomewithaninjectablehydrogelforhindlimbischemiatreatment[j].acssapplmaterinterfaces,2018,10(36):30081-30091.)制备得到壳聚糖水凝胶。具体方法为：精密配制含50mg/ml壳聚糖的0.1mol/l乙酸溶液以及含20mg/mlβ-gp的碳酸氢钠溶液，过0.22μm滤膜后，于冰浴搅拌条件下二者混合，并使得的β-gp:壳聚糖的质量比例为1:15，充分磁力搅拌10min以得到均匀的凝胶；[0060](2)将上制得的凝胶平铺于细胞培养瓶中，向培养瓶中倒入第三条件培养基，将经过上述第三传代培养得到的mscs细胞(实施例1得到)接种至培养中，继续于35℃、饱和湿度、5％co2、2％o2条件下培养8h。[0061]5、外泌体的分离及鉴定[0062](1)分离外泌体[0063]将经过上述第三传代培养的细胞培养液，用于无菌pbs洗涤后，经300×g、10min；2000×g、10min和10000×g、30min的离心程序进行差速离心后，以分别去除死细胞、细胞碎片和凋亡小体。进一步100000×g离心70min，得沉淀用pbs重悬，即为外泌体。合并上述离心过程中的细胞液，以便于进一步分析。[0064](2)外泌体形态鉴定[0065]利用动态光散射仪(贝克曼库尔特)对分离得到的外泌体进行粒径分析，并将外泌体溶液滴在铜网膜上，染色，电镜观察。[0066](3)外泌体wb检测[0067]取上述分离的得到外泌体(实施例1～6和对比例1～7)，用4％多聚甲醛，室温下固定20min；弃去多聚甲醛固定液，4℃pbs洗3次，加入免疫染色通透液，室温下通透10min；弃去通透液，免疫染色洗涤液洗3次，每次5min，加入免疫染色封闭液，室温下封闭60min；弃去封闭液，加入一抗4℃冰箱孵化过夜后，弃去一抗，免疫染色洗涤液洗3次，每次5min，加入二抗，避光条件下室温孵育60min；避光条件下弃去二抗，免疫染色洗涤液洗3次，每次5min，加入dapi染色液，室温下染细胞核10min；弃去dapi染色液，pbs洗1次，再加适量pbs，避光条件下共聚焦显微镜下观察并拍照。软件分析条带灰度值，与内参β-actin做比较，得到每种蛋白的相对表达量。[0068]一抗包括colii抗体(1:2000，abcam，ab34712)，cxcl9抗体(1:1000，货号srp08483，天津赛尔生物)，vegf-a抗体(1:2000，ab1316，abcam)，ets1抗体(1:2000，abcam，ab124282)，pdzk1抗体(1:1000，ptglab)，kdr抗体(1:1000，cellsignalingtechnology，#2479)，p-kdr抗体(磷酸化kdr抗体，1:1000，cellsignalingtechnology，#2478)，cx26抗体(1:2000，货号：p4928rb-h，美国rockland)，cx30抗体(1:2000，ab200866，abcam)，cx31抗体(1:2000，ab236620，abcam)，cx31.1抗体(1:2000，connexin31.1polyclonalantibody，invitrogen，thermofisherscientific)，β-actin(1:1000，zsgb，ta-09)。[0069]二抗包括anti-rabbitigg-hrp(1:10000，cellsignalingtechnology，7074)，anti-mouseigg-hrp(1:10000，cellsignalingtechnology，7076)，anti-rabbitigg-fitc(1:200，santacruzbiotechnology，g61713)。[0070](4)mrna相对表达量检测[0071]采用rna提取试剂盒(trizolrna试剂盒，thermofisherscientific)提取上述在提取外泌体中收集的细胞液中rna，利用逆转录试剂盒(货号:a45003，iontorrenttm，thermofisherscientific)得到其cdna样品，并以gapdh作为参考基因进行rt-pcr。pcr程序设定为：预变性95℃10min；变性95℃10sec；退火57℃/60℃/63℃20sec；延伸72℃30sec；40cycles。反应结束后，采用abi7300realtimepcr软件分析pcr过程，检测样本的ct值，即pcr扩增过程中扩增产物荧光信号超过基线值(进入指数增长期)时的循环数。以gapdh为内参照基因，通过2-δδct法进行相对定量分析。其中，引物序列如表1所示。[0072]表1[0073][0074][0075]6、统计学分析[0076]所有测试数据均以平均值和标准偏差表示，应用spss13.0软件处理数据，并对数据进行多重比较和显著性差异标记。[0077]二、结果[0078]研究通过差速离心法分离得到外泌体，并通过动态光散射原理测定exo的粒径，并对进行tem观察发现，其中并未出现细胞碎片，表明得到的差速离心法得到了高纯度的外泌体。表2示出了各实施例和对比例制得的外泌体的平均粒径和pdi值，结果各实施例和对比例提供的外泌体的平均粒径和pdi值无显著差别。[0079]表2外泌体性能[0080]实施方式平均粒径(nm)pdi实施例196.7±6.40.204±0.005实施例293.1±10.20.182±0.012实施例3101.4±9.60.178±0.016实施例497.5±10.20.189±0.018实施例5103.2±8.70.185±0.022实施例6101.6±6.80.193±0.017对比例195.3±5.20.186±0.014对比例291.0±4.60.183±0.015对比例393.4±3.80.185±0.019对比例496.2±5.90.188±0.021对比例597.2±8.50.193±0.018对比例696.8±7.80.191±0.017对比例795.4±6.40.187±0.023[0081]表3细胞mrna相对表达量[0082]实施方式coliicxcl9ets1pdzk1vegf-a实施例12.04±0.22b0.07±0.012c0.64±0.12b0.76±0.13c1.32±0.14a实施例22.08±0.20b0.06±0.009c0.62±0.08b0.74±0.15c1.28±0.11b实施例32.09±0.17b－0.65±0.09b0.81±0.12b1.34±0.09a实施例42.14±0.15ab－0.79±0.07a0.83±0.08b1.38±0.16a实施例52.06±0.12b－0.71±0.11ab0.84±0.07b1.40±0.14a实施例62.21±0.23a－0.70±0.08ab0.95±0.12a1.45±0.12a对比例11.34±0.12f0.29±0.11ab0.46±0.09c0.23±0.11e0.46±0.08e对比例20.85±0.14h0.22±0.13b0.48±0.11c0.21±0.09e0.44±0.09e对比例31.43±0.16e0.25±0.14b0.33±0.05d0.26±0.05e0.56±0.12d对比例41.24±0.11f0.28±0.13ab0.35±0.03d0.32±0.14d0.75±0.08c对比例51.68±0.15d0.24±0.11b0.34±0.08d0.34±0.09d0.78±0.09c对比例61.62±0.14d0.26±0.09b0.35±0.07d0.38±0.11d0.74±0.10c对比例71.78±0.09c0.33±0.05a0.33±0.05d0.32±0.09d0.79±0.12cmscs1g0.34±0.07a0.31±0.11d0.21±0.12e0.42±0.07e[0083]表3列出了实施例1～6、对比例1～7以及未经上述第一、二、三传代培养的mscs细胞中相关基因的mrna相对表达量，表3中，“－”表示未检出相关基因的表达。[0084]由表3可知，相对未经传代的原代mscs细胞，各实施例1～6提供的mscs细胞中colii、pdzk1、ets1和vegf-a表达量显著提升，而cxcl9表达量显著降低，并且实施例3～6提供的mscs细胞中未检出cxcl9表达。相对于未经传代的原代mscs细胞，对比例1～7提供的mscs细胞中colii、ets1、pdzk1和vegf-a表达量有所提升，cxcl9表达量有所降低，但均不及实施例1～6的作用显著。[0085]结合前述对于实施例1～6和对比例1～7提供的传代培养过程分析发现，实施例1～6相对于原代mscs细胞，进行第一、第二、第三传代培养以及在三维凝胶中培养，这些过程对于细胞colii、cxcl9、pdzk1、vegf-a和ets1表达起到了调控作用。[0086]表4外泌体mrna相对表达量[0087]实施方式coliicxcl9ets1pdzk1vegf-a实施例1－－－－－实施例2－－－－－实施例3－－－－－实施例4－－－－－实施例5－－－－－实施例6－－－－－对比例10.14±0.03a0.09±0.0020.12±0.02a0.18±0.006a0.14±0.006a对比例20.12±0.04a0.07±0.0030.11±0.01a0.16±0.007a0.12±0.007a对比例30.13±0.012a0.05±0.0140.09±0.003b0.15±0.005ab0.15±0.011a对比例40.09±0.009b0.04±0.0130.08±0.012b0.14±0.006b0.08±0.007b对比例50.08±0.008b－0.05±0.002b0.16±0.009a0.06±0.008b对比例60.07±0.008b－0.03±0.014c0.17±0.008a0.05±0.006b对比例70.06±0.007b－－0.16±0.007a0.04±0.007b[0088]表4进一步列出了外泌体中colii、cxcl9、pdzk1、vegf-a和ets1mrna相对表达量，表4中，“－”表示未检出相关基因的表达。结果可知，实施例1～6提供的外泌体未检出colii、cxcl9、pdzk1、vegf-a和ets1mrna的表达，说明其外泌体中可能不存在colii、cxcl9、pdzk1、vegf-a和ets1相关表达的核酸物质；而对比例1～7提供的外泌体中仍然有colii、cxcl9、pdzk1、vegf-a和ets1mrna少量表达，表明其提供的外泌体中仍然有相关核酸物质。[0089]表5wb检测外泌体中蛋白相对表达量(灰度值)(i)[0090][0091]表5、6进一步列出了实施例1～6和对比例1～7提供的外泌体中colii、cxcl9、vegf-a、ets1、pdzk1、kdr、p-kdr、cx26、cx30、cx31和cx31.1的wb检测相对表达量，表5、6中，“－”表示未检出相关蛋白的表达。[0092]由表5可知，实施例1～6制得的外泌体中，colii、vegf-a、ets1、pdzk1、kdr和p-kdr表达量均显著高于对比例1～7，而cxcl9未检出有表达；对比例1～7检测了cxcl9的表达。结合上述表3、4的结果可知，实施例1～6相对于原代mscs细胞，进行第一、第二、第三传代培养以及在三维凝胶中培养，使得其mscs细胞在colii、cxcl9、ets1、pdzk1和vegf-a基因的转录翻译后，其表达的蛋白迁移和分泌至外泌体中，致使外泌体中仅仅得到了这些蛋白，而不存在基因转录、翻译的过程，这对于外泌体作为一个外源体用于相关组织修复过程具有一定优势。[0093]colii为ii型胶原表达基因，其作为软骨基质维持软骨结构和功能的重要组成部分，能够提供软骨细胞生长的最适微环境。而cxcl9是成骨分化的细胞因子，vegf-a是血管形成的重要细胞因子，能够与vegf结合，阻碍vegf与内皮细胞及成骨细胞表面受体结合，以抑制成骨细胞的成骨分化和内皮细胞形成分化成血管；cxcl9还能影响mscs成骨分化后期矿物化基质的生成，一定程度上抑制内皮细胞的迁移及血管样网络结构的形成。而实施例1～6提供的分泌体中，colii和vegf-a的表达量均显著高于对比例1～7，而cxcl9显著低于对比例1～7，提示实施例1～6提供的外泌体可能具有更强促进成骨分化和血管形成的功能。ets1作为血管发生因子之一，为调控血管发生的重要转录因子。pdzk1是结构域蛋白1，主要分布于细胞膜上，属于钠氢交换调节因子家族成员，被证实在蛋白相互作用以及细胞膜表面或者外泌体表面发挥靶向作用，以及相关细胞因子或炎症因子的调节作用，已有文献证实了其对软骨细胞抗衰老有关。由表5结果可知，实施例1～6提供的外泌体中ets1和pdzk1表达显著高于对比例1～7，提示本技术实施例1～6提供的外泌体可能是通过ets1和pdzk1相对对比例的差异表达来发挥其血管形成功能，抵抗细胞炎症以及抗软骨细胞衰老的功能。[0094]而kdr是血管内皮生长因子的受体，p-kdr是其磷酸化蛋白，二者与血管发生密切相关，二者的表达，提示实施例1～6提供的外泌体在mscs的培养过程中分化形成了具有血管发生的能力。[0095]表6wb检测外泌体中蛋白相对表达量(灰度值)(ii)[0096]实施方式cx26cx30cx31cx31.1实施例10.33±0.04a0.28±0.03a0.30±0.02a0.19±0.003实施例20.32±0.03a0.29±0.02a0.31±0.015a0.20±0.004实施例30.35±0.02a0.31±0.03a0.33±0.014a0.22±0.002实施例40.36±0.03a0.33±0.02a0.35±0.016a0.25±0.007实施例50.38±0.02a0.32±0.03a0.37±0.018a0.26±0.008实施例60.39±0.03a0.35±0.016a0.39±0.012a0.29±0.006对比例10.08±0.012b0.06±0.002b0.08±0.005c0.06±0.004对比例20.05±0.006b0.08±0.003b0.09±0.006c0.05±0.003对比例30.04±0.003b0.05±0.001b0.11±0.005bc0.04±0.005对比例40.03±0.004b0.03±0.002b0.12±0.008bc0.03±0.002对比例50.04±0.006b－0.14±0.007b0.01±0.008对比例60.05±0.007b－0.16±0.009b－对比例70.06±0.008b－0.18±0.005b－[0097]cx26、cx30、cx31和cx31.1作为一类间隙连接蛋白，在胚胎发育、细胞生长、分化以及细胞自身稳定维持中发挥重要作用。由表6可知，实施例1～6提供的外泌体中cx26、cx30、cx31和cx31.1蛋白表达量显著高于对比例1～7，说明本技术相对于原代mscs细胞，进行第一、第二、第三传代培养以及在三维凝胶中培养，使得其外泌体中获得了一类间隙连接蛋白的表达和分泌，这对于外泌体作用一种细胞间的连接通道，能够作用于其他细胞，比如内皮细胞，发生细胞粘附，促使其形成软骨组织以及血管网络和其他细胞形成整体，这将提升此类外泌体有助于在组织修复中发挥重要作用。[0098]细胞实验[0099]一、材料与方法[0100]1、细胞来源[0101]小鼠真皮成纤维细胞(mdfs)，pm3086，欣润生物。[0102]2、共培养[0103](1)取mdfs冻存管从干冰中取出，置于37℃水浴锅中迅速解冻，然后将细胞悬液转移至预先加有小鼠真皮成纤维细胞专用完全培养液(产品编号：km6086-5，欣润生物)的离心管中，500g离心5min；[0104](2)离心，弃上清，加入上述小鼠真皮成纤维细胞专用完全培养液重悬细胞，然后将细胞悬液转移至预先加有培养基的75cm2培养瓶中，于37℃孵箱中培养，每24h换液，待细胞长满培养瓶90％时，以作为进步实验。[0105](3)将上述培养得到的mdfs细胞分为对照组和实验组。对照组细胞不加任何其他成分，仅在成软骨诱导培养基(货号kpd-005，武汉普诺赛)中培养14天。实验组细胞子在含有10％体积比的10mg/ml外泌体的成软骨诱导培养基中培养14天，培养条件均为37℃、5％co2。[0106]3、培养物的检测[0107]对上述的对照组和实验组进行rt-pcr、westernblot检测。[0108]4、茜素红s染色及钙含量定量分析[0109]将上述对照组和实验组细胞培养物，用pbs洗2次，4％多聚甲醛室温固定15min。固定后，然后用1％的茜素红s(sigma)溶液室温染色20min，染色后用pbs洗3次，其中红色区即为钙结节的着色区。[0110]钙含量定量测定用钙检测试剂盒(mak022-1kt，sigma-aldrich)。各实验组中细胞经pbs洗2次，用0.1mhcl孵育1h。孵育后，收集细胞液，比色法检测钙含量。[0111]5、nbtbcip染色及alp酶活性检测[0112]将上述对照组和实验组细胞培养物，吸去培上清，pbs洗2次，4％多聚甲醛室温固定15min。固定后加入nbt/bcip溶液(beyotime)染色，室温避光孵育30min。染色后用pbs洗2次。根据着色的强弱定性检测alp酶活。[0113]alp酶活的定量检测采用碱性磷酸酶检测试剂盒(货号e-bc-k091-m，elabscience)。将待测细胞用pbs洗涤，用0.25％tritonx-100室温孵育1h后收集样品，10000rpm离心5min后收集上清，按试剂盒操作说明书进行检测。[0114]二、结果[0115]如图2、3所示，对照组和各实验组的细胞培养物均有钙结节生成，但生成量明显不同；茜素红s染色图中，红色代表钙结节，vonkossa染色图中，黑色代表钙结节生成。对对照组和处理组的细胞培养物中的钙结节生成量和alp酶活进行检测，结果如表7所示。由表7可知，实施例1～6的培养物中钙结节生成量和alp酶活均显著高于对比例1～7和对照组，这提示将本技术实施例1～6提供的外泌体与mdfs细胞共培养后，其具有促使mdfs细胞成骨分化的趋势。[0116]表7[0117]实施方式钙结节/mg蛋白alp酶活/细胞数实施例13.12±0.23a1.02±0.15b实施例23.15±0.16a1.10±0.12b实施例33.19±0.25a1.22±0.18ab实施例43.24±0.27a1.32±0.22ab实施例53.38±0.31a1.42±0.26a实施例63.37±0.28a1.48±0.24a对比例10.23±0.08e0.12±0.005d对比例20.27±0.07e0.16±0.003d对比例30.31±0.11d0.25±0.007cd对比例40.48±0.12c0.28±0.009cd对比例50.45±0.14c0.32±0.011cd对比例60.51±0.08b0.35±0.009cd对比例70.54±0.07b0.42±0.018c对照组－0.05±0.004e[0118]表8培养物相关基因mrna表达水平(i)[0119][0120][0121]表9培养物相关基因mrna表达水平(ii)jensenwoundassessmenttool)评估，小鼠痴面情况、皮肤软硬、渗液量、渗液类型、边缘、上皮化作为指标对各组大鼠的创面修复情况进行评分，评分指标见表10所示。采集每组大鼠的创面图像，用image软件计算创面面积，得出创面愈合率。创面愈合率＝(原始创面面积－未愈合创面面积)/原始创面面积×100％。[0135]表10简化的bates-jensen的伤口评估与效果评价量表[0136][0137]5、统计学分析[0138]所有测试数据均以平均值和标准偏差表示，应用spss13.0软件处理数据，并对数据进行多重比较和显著性差异标记。[0139]二、结果[0140]表11[0141][0142]表11列出了各组实验后，小鼠的创面修复情况。由表11可知，对照组的创面愈合率略高于模型组、而创面修复评分相对于模型组无显著差异，说明对照组的mscs细胞对于小鼠创面修复作用有限。实验组中，实施例1～6提供的外泌体注射小鼠创面后，小鼠的创面修复评分和创面愈合率均显著高于对比例1～7、对照组和模型组，说明实施例1～6提供的外泌体能够明显修复模型小鼠的创面，提示实施例1～6提供的外泌体具有创面修复功能，同时也未产生明显的排异反应，提示其不仅具有创面修复的相关应用前景，还具有在注射填充物等领域的应用前景。[0143]以上所述，仅为本技术较佳的具体实施方式，但本技术的保护范围并不局限于此，任何熟悉本
技术领域：
：的技术人员在本技术揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本技术的保护范围之内。当前第1页12当前第1页12