一种检测小鼠唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的荧光定量PCR方法与流程

一种检测小鼠唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的荧光定量pcr方法
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，特别是一种检测小鼠唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的荧光定量pcr方法。


背景技术：

2.唐菖蒲伯克霍尔德氏菌（burkholderia gladioli, b. gladioli）是一种广泛存在于水、土壤、植物和水果中的革兰氏阴性细菌，主要被鉴定为植物病原体。形状为杆状，需氧兼微需氧，有动力，不发酵。对于人体来说，唐菖蒲伯克霍尔德氏菌是引起囊性纤维化患者肺部感染的元凶。对于动物来说，免疫缺陷的小鼠会因为饮用受污染的水而被感染，出现头部倾斜症状。
3.该菌目前已发现有四个致病变型，b. gladioli pathovar gladioli会导致唐菖蒲和鸢尾的玉米叶病害；b. gladioli pathovar allicola会导致洋葱鳞茎腐烂；b.gladioli pathovar agaricicola会导致蘑菇软腐，b.gladioli pathovar cocovenans会产生致命的毒素，导致食物中毒。在2004年的一项关于因中耳炎而导致头部严重倾斜的无胸腺裸鼠研究中，设计了一对针对唐菖蒲伯克霍尔德氏菌16s rrna基因的特异引物，并对小鼠耳分泌物的样本进行pcr检测，结果证实了该菌的存在。最近，有报道关于免疫缺陷小鼠头部倾斜的病例，通过飞行时间质谱方法确定病原体为唐菖蒲伯克霍尔德氏菌，研究发现了是由于小鼠饮用了被污染的水而导致的感染。人一旦感染上，会引发慢性肉芽肿、肺炎、菌血症，可能会导致免疫抑制患者死亡。
4.然而，关于小鼠感染唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的研究较少，故本发明旨在建立一种于基于taqman探针的荧光定量pcr方法，用于检测小鼠唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的感染与否。
5.目前来说，唐菖蒲伯克霍尔德氏菌主要通过非培养的方法检测，包括荧光原位杂交(fish)、dna微阵列、普通pcr、多重pcr、实时荧光定量pcr和实时环介导等温扩增pcr(lamp)。
6.在早期研究中，使用选择性琼脂培养法和pcr-rflp方法来检测囊性纤维化(cf)患者的痰液样本中的除b. gladioli以外的洋葱伯克氏菌群(burkholderia cepacia complex，bcc），通过 reca 靶向基因的pcr扩增和限制性片段长度多态性(rflp)，实现bcc的快速检测。结果表明，在100个cf患者样本中，在19份培养阳性的痰样本中检测到17个bcc阳性，另外的两个pcr阴性样品检测结果为b. gladioli。该检测方法的灵敏度为10
6 cfu /g 痰液，这是由于该pcr方法的扩增片段较大，为1040 bp，为普通pcr方法，敏感性不够，所以无法检测到较低水平的感染。
7.另一项研究是基于靶向16s和23s rrna基因序列的普通pcr法检测cf患者痰样本中的b. gladioli，达到快速区分b. gladioli和bcc的目的。将培养法检测需要的时间5天，缩短为5小时，但这项研究并没有提及检测的敏感性。由于bcc和b. gladioli与cf患者的肺部感染密切相关，因此对他们的种属特异性检测已成为临床研究的重点，一些研究是通过物种特异性pcr (ss-pcr)法快速鉴定这种细菌。通过pcr法扩增23s rrna基因区域的序列，
对收集到的102株cf患者的临床样本分离株进行b. gladioli检测，成功检测到了74个b. gladioli分离株中的70 个，对其他分离株呈阴性。基于培养和pcr检测方法，引物的总体灵敏度和特异性分别为96%和100%。然而，这项研究没有提及实时qpcr法的引物的敏感性。有的研究基于16s-23s rdna 之间的序列设计了特异性引物，建立了一种直接、快速、特异性高的普通pcr法检测b. gladioli。发现该引物组的检测下限为10-2 cfu/50 μl，并且测试了伯克霍尔德氏菌属之间的特异性，靶向序列在种内保守，但在种之间不保守。
8.有研究开发了一种新的多重pcr方法来检测水稻病原体，基于靶向gyrb和rpod基因序列设计了特异性引物，可特异性检测和鉴定受这些病原体物种感染的水稻种子中的b. plantarii, b. glumae和b. gladioli。受试引物具有良好的特异性，但未提及引物的敏感性。另一种结合荧光原位杂交(fish)和pcr方法的用于检测cf患者痰液样本中的bcc，该方法着重于开发检测b.cepacia的引物而非b.gladioli。同时还有使用dna微阵列和多重pcr方法的组合方法，检测从cf患者痰液收集的样本中的伯克霍尔德氏菌，该研究旨在检测常见于cf患者痰液中的伯克霍尔德氏菌属，其中包括b. gladioli，着重于在痰中检测b.pseudomallei，b mallei和b.gladioli，而没有研究b. gladioli的敏感性和特异性。
9.最近的研究使用多重实时pcr法检测cf患者痰液样本中的b. cepacia复合体和b.gladioli，设计并验证了八种物种特异性pcr 探针，用于准确识别b. cepacia复合体和b.gladioli。在痰液样本中加入梯度稀释后的b. gladioli标准品，测得引物的最低检测限ct值为35.8，对梯度稀释的b. gladioli dna 样品的ct值为32.9。该研究调查了来自cf患者的200份随机痰液样本，这些样本通过选择性培养、生化和序列分析被证实为伯克霍尔德菌阳性。利用reca序列分析，6个分离株鉴定为b. gladioli。该研究使用8个物种特异性探针和引物进行多重pcr方法。尽管多重 pcr方法提供了良好的特异性，但依然还有一些局限，主要是靶向目标区域的选择有局限性，还有pcr条件、引物二聚体、引物设计的复杂性、程序的复杂性，使多重pcr方法运用较少。
10.还开发出了一种联合方法，用于同时检测包括b. gladioli在内的6种伯克霍尔德氏菌。该研究单重pcr、qpcr（探针法或染料法）和多重pcr方法测试设计的引物对伯克霍尔德氏菌的敏感性和特异性进行分析。结果表明，对b. gladioli进行单重pcr检测至少需要1000个细菌，用sybr染料进行qpcr检测至少需要10个细菌。多重pcr检测限为10 ~ 1000个细菌。然而，因为任何双链dna都可以被给定的引物组检测到，故sybr染料法的qpcr特异性不好。
11.有的研究在16s-23s rrna its区设计引物，采用实时荧光仪进行环介导等温扩增(lamp)检测b.gladioli pv.allicola的敏感性和特异性，但并未对b.gladioli pv. gladioli进行重点研究。
12.最近一项研究关于中国白酒中b. gladioli产生的毒(性)黄素，针对toxa基因设计普通pcr方法来检测。研究了b. gladioli产生的紫杉黄素及其对食物中毒的可能性。前期研究表明b. gladioli在一定条件下会产生毒(性)黄素，导致食物中毒，但本研究没有描述该引物的敏感性。
13.上述的研究方案都是集中于人类样本或植物中检测b. gladioli，迄今为止，很少有研究集中在动物样本中检测b. gladioli。


技术实现要素：

14.本发明的目的在于针对背景技术中所述的现有的关于唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的检测方法都集中在人类样本或植物中检测唐菖蒲伯克霍尔德氏菌，而且存在特异性和灵敏性较低的问题，提供一种快速、灵敏、特异、经济的基于taqman探针的pcr方法来检测小鼠唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的方法。
15.一种检测小鼠唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的qpcr方法，其特征在于：其包括以下步骤：s1、从样本中提取dna；s2、配置荧光定量qpcr反应的反应体系，反应体系包括定量pcr预混taq酶体系、上游引物、下游引物、探针、校正染料、pcr专用水和dna；s3、荧光定量qpcr反应的反应程序为：在pcr仪中预变性20-40s，然后变性3-6s，然后退火延伸25-40s，采集信号，并按上述过程进行30-60个循环；s4、在所述整个体系扩增结束后，读取循环数ct值以及扩增曲线，根据循环数ct值和扩增曲线来进行检测结果的判断。
16.上述方案中，根据qpcr反应的温度要求，预变性和变性的温度可以设置为95℃，退火延伸的温度可以设置为60℃。
17.作为上述方案的进一步改进，上游引物的dna序列为seq id no：1，下游引物的dna序列为seq id no：2，探针的dna序列为seq id no：3，扩增片段153 bp。
18.在上述方案的步骤s3中，荧光定量qpcr反应的原理为：在基因保守区域设计特异的实时荧光pcr引物和探针序列，探针两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团，探针完整时，报告荧光基团发射的荧光信号被淬灭荧光基团吸收，检测不到荧光；在pcr扩增时，premix taq酶的5
’→3’
外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，报告荧光基团释放并发出荧光，荧光能被检测仪器接收，通过荧光信号的强弱对pcr产物进行检测。
19.作为上述方案的进一步改进，步骤s3中，pcr扩增采用的阳性质控质粒的制备方法是：以puc57为载体插入唐菖蒲伯克霍尔德氏菌特异性保守序列合成的质粒穿刺菌转染到大肠杆菌dh5a中，摇菌增殖后采用质粒提取试剂盒提取纯化质粒，用分光光度计测定浓度,并用无菌te缓冲液将阳性质控质粒浓度稀释至3.0
×
10
10
拷贝数/μl。
20.作为上述方案的进一步改进，质粒合成序列为seq id no：4。
21.作为上述方案的进一步改进，步骤s1中，根据样本类型，采用天根细菌、口腔拭子、血液/细胞/组织提取试剂盒，来提取样本的核酸dna。
22.作为上述方案的进一步改进，步骤s4中，当有扩增曲线，且ct值≤35,判断唐菖蒲伯克霍尔德氏菌阳性；当无扩增曲线，且ct值显示undet或n/a时，或者有扩增曲线，ct值＞37时，判断唐菖蒲伯克霍尔德氏菌阴性；当有扩增曲线，35《ct值≤37，建议重复一次实验，复孔检测，若结果相同，则判定35《ct值≤36为唐菖蒲伯克霍尔德氏菌阳性，36《ct值≤37为唐菖蒲伯克霍尔德氏菌可疑，建议重新采样检测或将样本扩菌处理后，重新提取测试；若无扩增曲线，则判定为唐菖蒲伯克霍尔德氏菌阴性。
23.本发明的有益效果为：1）本发明的检测小鼠唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的qpcr方法，采用的实时荧光定量方法实验操作简单快捷，引物设计的局限性小，且无需再设置熔解曲线检测扩增产物的特异性，数据分析更加简单直观；2）本发明的检测小鼠唐菖蒲伯克霍尔
德氏菌的qpcr方法，检测时间大大缩短：反应在数小时内即可完成；3）本发明的检测小鼠唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的qpcr方法，敏感性高，特异性强、重复性好：可检测低至30 拷贝数/反应,且探针法只与目的序列结合，显著提高了敏感性和特异性；实时监控荧光数据，避免了琼脂糖凝胶电泳，避免污染，确保了实验结果的可靠性和准确性。
24.说明书附图图1为实施例1中的s3.1中进行特异性检测时的pcr扩增曲线。
25.图2a为实施例1中的s3.4中采用阳性质控质粒进行质粒敏感性检测时的扩增曲线。
26.图2b为实施例1中的s3.4中采用阳性质控质粒进行质粒敏感性检测时标准曲线。
27.图3a为实施例1中的s3.4中采用小鼠样本检测中获得的强阳性样本进行质粒敏感性检测时的扩增曲线。
28.图3b为实施例1中的s3.4中采用小鼠样本检测中获得的强阳性样本进行质粒敏感性检测时标准曲线。
具体实施方式
29.下面通过实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
30.实施例1一种检测小鼠唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的qpcr方法，其包括以下步骤：s1、从样本中提取dna；s1.1、常见细菌标准菌株及dna样本：标准菌株唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(burkholderia gladioli，简称为b.gla)、金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus，简称为s.aureus)、铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa, 简称为p.aeruginosa)、肺炎克雷伯杆菌(klebsiella pneumoniae, 简称为k.pneumoniae)、大肠杆菌(escherichia coli, 简称为 e.coli)、嗜麦芽窄食单胞菌(stenotrophomonas maltophilia, 简称为s.maltophilia) 6种菌株均于-70℃保存于实验室中，提取菌株基因组dna，用于pcr方法的实验。
31.s1.2、dna提取：根据样本类型不同，选用不同的试剂盒提取核酸，菌液选用细菌基因组dna提取试剂盒；口腔拭子选用高效口腔拭子基因组dna提取试剂盒；组织样本采用血液/细胞/组织基因组dna提取试剂盒。根据样本类型不同，按照对应的试剂盒说明书进行操作，dna用te洗脱，-20℃保存待用。
32.s2、引物设计与合成：根据ncbi genbank: mk419120.1的16s rrna基因序列，利用primer 3引物设计软件来设计引物、探针和重组质粒。
33.上游引物bgla-153f的dna序列为: 5
’‑ꢀ
tgacatggtcggaaccttgg
ꢀ‑3’
。
34.下游引物bgla-153r的dna序列为: 5
’‑ꢀ
agtgctcttgcgtagcaact
ꢀ‑3’
。
35.探针bgla-153p的dna序列为: 5
’‑
fam-cagctcgtgtcgtgagatgt
ꢀ‑3’
tamra，扩增片段153 bp。fam为报告荧光基团，tamra为淬灭荧光基团。
36.在荧光定量qpcr反应中，在基因保守区域设计特异的实时荧光pcr引物和探针序列，探针两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团，探针完整时，报告荧光基团发射的荧光信号被淬灭荧光基团吸收，检测不到荧光；在pcr扩增时，premix taq酶的5
’→3’
外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，报告荧光基团释放并发出荧光，荧光能被检测仪器接收，通过荧光信号的强弱对pcr产物进行检测。
37.构建重组质粒，根据pcr扩增目的片段来构建质粒。质粒合成序列如下：tgacatggtcggaaccttggagagatctgagggtgctcgaaagagaaccgatacacaggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttgtccttagttgctacgcaagagcact。
38.上述的重组质粒即为阳性质控质粒，阳性质控质粒是以puc57为载体插入唐菖蒲伯克霍尔德氏菌特异性保守序列合成的质粒穿刺菌转染到大肠杆菌dh5a中，摇菌增殖后采用质粒提取试剂盒提取纯化质粒，用分光光度计测定浓度,并用无菌te缓冲液将阳性质控质粒浓度稀释至3.0
×
10
10
拷贝数/μl。
39.配置荧光定量qpcr反应的反应体系，反应体系共20 μl，含2
×
premix ex taq
tm 10μl, 校正染料 0.4 μl，上下游引物（浓度为20 μm）0.4 μl，探针（20 μm） 0.2μl，5 μl dna模板，4.0 μl pcr专用水。
40.荧光定量qpcr反应的反应程序为：在pcr仪中，95℃预变性20-40s，例如预变性30s，然后95℃变性3-6s，例如变性5s，然后60℃退火延伸25-40s，例如退货延伸31s，采集信号，并按上述过程进行30-60个循环，例如进行40个循环。
41.s3、pcr方法检测，包括特异性检测、敏感性检测、重复性检测和小鼠样本的检测。
42.s3.1、特异性检测是以提取的6株标准菌株基因组dna进行pcr扩增，检验pcr方法的特异性。
43.特异性检测结果为：以唐菖蒲伯克霍尔德氏菌, 大肠埃希氏菌, 铜绿假单胞菌, 金黄色葡萄球菌, 肺炎克雷伯氏杆菌, 嗜麦芽窄食单胞菌这6种菌基因组dna为模板，采用新设计的唐菖蒲伯克霍尔德氏菌引物和探针，通过荧光定量pcr方法检测上述6种细菌验证方法的特异性，结果见表1。
44.表1 pcr 方法检测b.gla的特异性检测结果扩增曲线如图1所示，通过扩增曲线可以看出，新设计的pcr引物对唐菖蒲伯克霍尔德氏菌有较好的特异性，其他病原菌的核酸检测均为阴性。
45.s3.2、重复性检测是将阳性质控质粒梯度10倍梯度稀释至10-3-10-10
共8个浓度，并进行pcr，分别重复3次检测，检测本发明检测方法的准确性和重复性。如表4所示，为重复性
检测结果：当有扩增曲线，且ct值≤35,判断唐菖蒲伯克霍尔德氏菌阳性；当无扩增曲线，且ct值显示undet或n/a时，或者有扩增曲线，ct值＞37时，判断唐菖蒲伯克霍尔德氏菌阴性；当有扩增曲线，35《ct值≤37，建议重复一次实验，复孔检测，若结果相同，则判定35《ct值≤36为唐菖蒲伯克霍尔德氏菌阳性，36《ct值≤37为唐菖蒲伯克霍尔德氏菌可疑，建议重新采样检测或将样本扩菌处理后，重新提取测试；若无扩增曲线，则判定为唐菖蒲伯克霍尔德氏菌阴性。阴性对照无扩增曲线，无ct值，阳性对照有扩增曲线，且ct值≤35。若阳性对照无扩增曲线，无ct值，则本次实验为无效实验，需更换试剂重新检测。
46.通过表4的检测数据可以看出，质粒在10-3
~10-9
梯度浓度时pcr的3次重复检测均可检出，且cv值均低于5%，说明本方法重复性好、稳定性高。
47.3.3、小鼠样本的检测是用79份小鼠样本，其中包含3份环境样本，37份肿瘤组织，39份小鼠组合样本，用前述方法提取dna后，用建立好的唐菖蒲伯克霍尔德氏菌pcr方法进行检测。同时用sybr染料法检测样本，比对两种方法的检测结果。
48.采用本发明建立好的唐菖蒲伯克霍尔德氏菌pcr探针方法对79份小鼠样本dna进行检测，检测出19份阳性，60份阴性，采用sybr染料法检测，测得19份阳性，60份阴性，本发明的检测方法与sybr染料法检测比对结果符合率100%。
49.s3.4、敏感性检测是将阳性质控质粒10倍梯度稀释至10-3-10-10
共8个浓度后，检测pcr方法的最低拷贝数，并将阳性样本梯度稀释10-1-10-7
，pcr检测，测定提取质粒的浓度，计算每微升质粒中的分子数。
50.敏感性检测的结果为，将质粒10倍梯度稀释至10-3-10-10
共8个浓度，使其在5 μl中分别含有3.0
×
107、3.0
×
106、3.0
×
105、3.0
×
104、3.0
×
103、3.0
×
102、3.0
×
101、3.0 拷贝
数。如表2所示，为质粒敏感性数据。
51.附图2a为质粒敏感性检测扩增曲线，图2b为质粒敏感性检测标准曲线，通过图2b可以得到标准曲线的线性方程式为y=-3.332x+40.643，r2=0.998, e=99.6%,，其中y代表ct值，x代表标准品的对数值，pcr检测最低检测下限为30拷贝数。通过表2、图2a和图2b，标准品浓度在3.0
×
101ꢀ‑
3.0
×
107拷贝数/反应范围内具有良好的线性关系。
52.将上述s3.3小鼠样本检测中获得的强阳性样本，10倍梯度稀释至10-1
~10-10
共10个浓度，按照上述的方法进行敏感性检测，检测数据如表3所示，
附图3a为质粒敏感性检测扩增曲线，图2b为质粒敏感性检测标准曲线，通过图3b可以得到标准曲线的线性方程式为y=-3.473x+41.427，r2=1.000, e=94.0%。通过表3、图3a和图3b可以看出，小鼠样本浓度在稀释10-1
~10-6
浓度范围内具有良好的线性关系。
53.通过上述的检测，可知本发明的检测小鼠唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的qpcr方法具有较好的敏感性。
54.尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。