一种组合启动子pα2-α2及其应用的制作方法

一种组合启动子p
α
2-α
2及其应用
技术领域
1.本发明属于微生物与基因工程技术领域，具体涉及一种组合启动子pα2-α2及其应用。


背景技术：

2.碱性蛋白酶(alkaline protease)，一类能够催化水解肽键的酶，其活性中心含丝氨酸，又称丝氨酸蛋白酶，在ph值偏碱性范围内水解蛋白质肽键的酶类，它不但能水解肽键，还具有水解酰胺键、酯键以及转酯和转肽的功能。这类酶广泛存在于动物胰脏、细菌、霉菌中，酶活性可受到二异丙基磷酰氟(dfp)、苯甲基磺酰氟(pmsf)和马铃薯抑制剂(pi)等的专一性抑制。
3.碱性蛋白酶在食品、洗涤及制革等行业中有着广泛的用途。由于微生物蛋白酶均为胞外酶，与动植物源蛋白酶相比具有下游技术处理相对简单、价格低廉、来源广、菌体易于培养、产量高等优势，具有动植物蛋白酶所具有的全部特性，且相对中性蛋白酶具有更强的水解能力和耐碱能力，有较大耐热性且有一定的酯酶活力，易于实现工业化生产。
4.解淀粉芽胞杆菌作为一种革兰氏阳性细菌，由于其具有非致病性、分泌蛋白能力强、重组dna比较容易转入的特点和良好的发酵基础及生产技术，是目前原核表达系统中表达和分泌外源蛋白的理想宿主，成为原核表达系统中的一种重要的模式菌株。
5.而实现外源蛋白的高效表达的关键因素之一是使用高强度且易控制的启动子。启动子(promoter)是一段rna聚合酶(rna polymerase，rna pol)识别、结合和起始转录的特定dna序列。细菌启动子是与rna聚合酶结合的靶序列，是细菌中基因表达的必需调控元件，决定了细菌基因表达的强度和时机。通过启动子的插入或缺失，可以改变细菌基因的表达，实现对菌体生长发育以及代谢调控的研究。启动子也是构建各种表达系统、实现异源基因表达的基础。因此，筛选获取强启动子，是介导蛋白酶基因的表达并提高碱性蛋白酶产量非常有效的方法。


技术实现要素：

6.针对当前产业需求和现有技术的不足，本发明主要目的是提供一种实现目的基因高效表达的启动子及基因工程菌表达系统。
7.为了实现上述目的，本发明采取如下的技术方案：
8.第一方面，本发明提供一种组合启动子，其核苷酸序列如seq id no：2所示。
9.第二方面，本发明提供包含所述组合启动子的表达载体。
10.第三方面，本发明提供包含如上所述组合启动子或表达载体的表达系统。
11.第四方面，本发明提供如上所述组合启动子的用途，其用于控制基因表达，尤其应用于解淀粉芽孢杆菌代谢工程领域。
12.有益效果：
13.本发明通过对枯草芽孢杆菌来源的启动子分析改造获得了一种强度提高的新型
组合启动子，该组合启动子适用于解淀粉芽孢杆菌表达系统，可将碱性蛋白酶表达活性提高144％，为介导解淀粉芽胞杆菌表达系统中异源碱性蛋白酶基因的表达奠定基础，推动碱性蛋白酶的高效表达及工业化生产。
附图说明
14.图1：实施例2中重组载体各片段回收验证；其中，m：marker；1：启动子pα2-α2；2：对照启动子ply-2。
15.图2：实施例2中重组菌株表达碱性蛋白酶活性对比。
具体实施方式
16.下面通过具体的实施方案进一步叙述本发明。除非特别说明，以下实施方案所涉及的技术手段、材料等均可以是本领域技术人员所公知的，可以在已知的能解决相应技术问题的手段和材料中选择合适的。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。
17.第一方面，本发明提供一种组合启动子，其核苷酸序列如seq id no：2所示。
18.第二方面，本发明提供包含所述组合启动子的表达载体。所述表达载体的骨架可以是任何本领域已知的枯草芽孢杆菌的表达载体。
19.根据本发明一种优选的实施方式，所述表达载体是pwb980。
20.第三方面，本发明提供包含如上所述组合启动子或表达载体的表达系统。所述表达系统可以是适合于本发明的组合启动子或表达载体的任何宿主，例如解淀粉芽孢杆菌。
21.根据本发明一种优选的实施方式，所述宿主是解淀粉芽胞杆菌基因工程菌
△6△
eps
△
pgs
△
3049-3052(该基因工程菌是以cgmcc no.11218出发敲除六种胞外蛋白酶基因apre，bpr，vpr，mpr，npre，epr，胞外多糖基因簇eps，聚谷氨酸基因簇pgs和噬菌体相关基因3049-3052获得，具体可参见专利申请202111182462.6)。
22.第四方面，本发明提供如上所述组合启动子的用途，其用于控制基因表达，尤其应用于解淀粉芽孢杆菌代谢工程领域。
23.根据本发明一种优选的实施方式，所述组合启动子用于控制碱性蛋白酶基因apre在解淀粉芽孢杆菌系统中的表达，优选的，所述碱性蛋白酶基因的核苷酸序列如seq id no：3所示，genbank：fj940727.1。
24.以下将通过具体的实施例对本发明进行更详细描述。如无特别说明，以下实施例中：
25.本发明所用培养基及酶活测定方法：
26.种子培养基：酵母粉5g/l，蛋白胨10g/l，氯化钠5g/l。
27.发酵培养基：玉米粉64g/l，豆饼粉40g/l，磷酸氢二钠4g/l，磷酸二氢钾0.3g/l，高温淀粉酶0.7g/l。
28.枯草芽孢杆菌感受态制备培养基：
29.sp-a盐溶液：(nh4)2so
4 4g/l，k2hpo4·
3h2o 28g/l，kh2po
4 12g/l，柠檬酸钠2g/l；
30.sp-b盐溶液：mgso4·
7h2o 0.4g/l；
31.100
×
caye溶液：酪蛋白水解物20g/l，酵母粉100g/l；
32.spi(200ml)：sp-a盐溶液98ml，sp-b盐溶液98ml，50％葡萄糖2ml，100
×
caye 2ml；
33.spii培养基(600ml)：spi 588ml，50mmol/l cacl
2 6ml，250mmol/l mgcl
2 6ml；
34.100
×
egta溶液：10mmol/l egta溶液。
35.解淀粉芽孢杆菌感受态制备培养基：
36.lbs培养基：酵母粉5g/l，蛋白胨10g/l，氯化钠5g/l，山梨醇9.1085g/l；
37.复苏培养基：酵母粉5g/l，蛋白胨10g/l，氯化钠5g/l，山梨醇9.1085g/l，甘露醇6.92246g/l。
38.本发明所用碱性蛋白酶酶活力测定方法参照gb/t 23527-2009附录b福林酚法进行，即1个酶活力单位(u/ml)定义为1ml酶液在40℃、ph 10.5条件下反应1min水解酪蛋白产生1μg酪氨酸所需要的酶量。
39.实施例1：一种新型组合启动子及其质粒的构建
40.将来源于枯草芽胞杆菌的a-淀粉酶基因的启动子ply-2(核苷酸序列如seq id no：1)通过启动子预测分析软件iproep、softberry等进行分析，发现其具有两个-10区域和两个-35区域，将前后两个包含-10区域和-35区的片段分别命名为pα1、pα2，以ply-2作为模板pcr扩增获得pα2的两个带有同源臂的片段pα21、pα22，进一步将上述两个片段进行串联组合，获得一个新型的组合启动子命名为pα2-α2，其核苷酸序列如seq id no：2所示。所用引物如下表所示(注：大写字母表示同源臂)。
41.引物名称引物序列退火温度pα2-f1tatggttttggtcggcacttgaagctggcttacagaagagc52℃pα2-r1ttctgtaagccagcttcatc ttgacactccttatttgatt52℃pwb980-ftcaaataaggagtgtcaagaccaggagggctggaa52℃pwb980-rtcttctgtaagccagcttcaagtgccgaccaaaac52℃pα2-f2aatcaaataaggagtgtcaagatgaagctggcttacagaag52℃pα2-r2gcttcttccagccctcctggtcttgacactccttatttgattt52℃
42.启动子片段的退火温度是52℃，延伸时间与基因长度对应，反应程序如下：
[0043][0044]
载体的退火温度是52℃，延伸时间与基因长度对应，反应程序如下：
[0045][0046]
线性pwb980载体与启动子的无缝克隆连接，方法如下：
[0047]
1)提取pwb980质粒，以其为模板进行pcr；
[0048]
2)目标片段进行胶回收纯化；
[0049]
3)将回收好的启动子片段pα21、pα22和线性pwb980载体片段连接，连接条件水浴锅50℃，15min，然后迅速放入冰上静置数分钟。
[0050]
连接体系如下：
[0051]
载体
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2ul
[0052]
启动子片段
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3ul
[0053]
无缝克隆酶
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
10ul
[0054]
将连接产物化转到枯草芽孢杆菌wb600中，方法如下：
[0055]
1)挑取新活化的枯草芽孢杆菌wb600单菌落于5ml lb液体培养基中，37℃，220r/min，过夜培养；
[0056]
2)取100μl培养液转接至5ml spi培养基中，37℃，220r/min培养至对数生长末期od600＝1.2(约3
–
4h)；
[0057]
3)取200μl生长至对数期末的培养液至2ml spii培养基中，37℃，100r/min培养1.5h；
[0058]
4)在上述spii培养基的菌体中加入20μl 10mmol/l egta，37℃，100r/min培养10min；
[0059]
5)spii加入连接产物，37℃，100r/min培养30min；
[0060]
6)调节转速至220r/min，继续培养1.5h，取菌液涂布于含有100μg/ml卡那霉素的lb筛选平板，37℃培养12h，筛选阳性转化子进行验证。
[0061]
实施例2：重组碱性蛋白酶基因工程菌
[0062]
以嗜碱芽孢杆菌基因组为模板，pcr扩增碱性蛋白酶基因apre(genbank:fj940727.1)。
[0063][0064]
扩增目的基因时所用的反应体系为50μl，如下所示：
[0065][0066]
apre的退火温度是58℃，延伸时间与基因长度对应，反应程序如下：
[0067][0068]
将碱性蛋白酶基因apre与含有组合启动子的pα2-α2-pwb980质粒分别进行酶切后连接，构建含有启动子pα2-α2和apre基因表达盒的重组表达载体，并且化转到枯草芽胞杆菌wb600中；提取质粒，再将重组质粒通过电转的方式转入一株解淀粉芽胞杆菌基因工程菌
△6△
eps
△
pgs
△
3049-3052中(该基因工程菌是以cgmcc no.11218出发敲除六种胞外蛋白酶基因apre，bpr，vpr，mpr，npre，epr，胞外多糖基因簇eps，聚谷氨酸基因簇pgs和噬菌体相关基因3049-3052获得，具体可参见专利申请202111182462.6)，得到异源表达碱性蛋白酶的重组菌株。
[0069]
酶切体系如下：
[0070][0071]
表达载体的酶切及与目的基因的连接如下：
[0072]
1)提取含有组合启动子的载体质粒pα2-α2-pwb980，然后根据所需要的限制性内切酶(hindⅲ、sphⅰ)双酶切质粒，酶切条件37℃、2h；
[0073]
2)对目的基因进行相同双酶切，片段进行胶回收纯化；
[0074]
3)将回收好的目的基因片段和线性化pα2-α2-pwb980片段连接，连接条件，16℃，6h或过夜连接，连接体系如下：
[0075]
目的基因片段
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4.5μl
[0076]
线性pα2-α2-pwb980片段
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0.5μl
[0077]
solution i
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5.0μl；
[0078]
将连接产物化转到枯草芽孢杆菌wb600中，方法如下；
[0079]
1)挑取新活化的枯草芽孢杆菌wb600单菌落于5ml lb液体培养基中，37℃，220r/min，过夜培养；
[0080]
2)取100μl培养液转接至5ml spi培养基中，37℃，220r/min培养至对数生长末期od600＝1.2(约3
–
4h)；
[0081]
3)取200μl生长至对数期末的培养液至2ml spii培养基中，37℃，100r/min培养1.5h；
[0082]
4)在上述spii培养基的菌体中加入20μl 10mmol/l egta，37℃，100r/min培养10min；
[0083]
5)spii加入连接产物，37℃，100r/min培养30min；
[0084]
6)调节转速至220r/min，继续培养1.5h，取菌液涂布于含有100μg/ml卡那霉素的lb筛选平板，37℃培养12h，筛选阳性转化子进行验证。
[0085]
提取在wb600中的重组质粒，电转到解淀粉芽孢杆菌
△6△
eps
△
pgs
△
3049-3052中，电转方法如下：
[0086]
1)75％酒精清洗电转杯，在紫外下照射20min以上，并在冰上预冷；
[0087]
2)将100μl感受态和10ng质粒dna混合加入电转杯，冰上放置2min；
[0088]
3)2500v电击，电击时间一般为4-6ms；
[0089]
4)电击后立即加入1ml复苏培养基，37℃，复苏3h。涂板，37℃培养12h，筛选阳性转化子进行验证(片段的回收验证如图1所示)。
[0090]
同时，以启动子ply-2构建上述相同表达系统的重组菌作为对照菌，两者区别仅在于碱性蛋白酶基因的启动子不同。
[0091]
实施例3：重组碱性蛋白酶基因工程菌的表达及分析
[0092]
将新鲜平板上的重组基因工程菌和对照菌的单菌落接入50ml卡那霉素抗性种子培养基中，37℃、220rpm振荡培养12h，以相同的接种量转接于含有卡那霉素抗性的发酵培养基中，于37℃、220rpm发酵培养。
[0093]
按照国家标准gb/t 23527-2009附录b福林酚法测定重组基因工程菌发酵上清液中碱性蛋白酶的酶活，分别取重组菌发酵培养12h、24h、36h、48h、60h的发酵液，经测定48h时包含本发明组合启动子的重组菌发酵上清液中重组碱性蛋白酶活力达到最高为25686u/ml，是对照菌表达活性的144％(如图2所示)。可见本发明提供了一种强度更高的组合启动子pα2-α2，利用该启动子可显著提高碱性蛋白酶在枯草芽孢杆菌系统中的表达活性。
[0094]
虽然本发明已经以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和原理的情况下，可以对这些实施例进行各种形式和细节的变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物所限定。