一种制备丝素多肽的方法及其应用与流程

1.本发明涉及一种丝素多肽(ipc分类号：c12p21/00)，尤其涉及一种制备丝素多肽的方法及其应用。


背景技术：

2.丝素蛋白是一种天然高分子材料，具有非常优异的性能，例如丝素蛋白具有良好的生物相容性，生降解性等性能，可以被广泛应用于美容护肤、功能饮料及营养辅食的添加剂等；特别是适合用于美容护肤产品中的保湿与美白功能。目前对于丝素的水解常用酸、碱等化学法，这些方法虽能将丝素完全水解，但存在诸多缺点，如作用条件激烈，酸水解时，色氨基酸被完全破坏，生成一种暗黑色不溶物。
3.专利申请cn107722116a提供了一种小分子量的丝素肽的分离方法，采用多种类别的葡聚糖分子筛，建立分子筛柱对丝素多肽进行梯度分离，但此方法操作步骤繁琐，对于操作人员要求高，获得的低分子量含量少。
4.因此，本技术文件提供了一种制备丝素多肽的方法，该制备方法简单，用酶法高效制备为小分子量的多肽分子复合物。制备的丝素蛋白分子量低，多肽量高，分离效率高。


技术实现要素：

5.本发明提供了一种制备丝素多肽的方法，包括以下步骤：
6.(1)蚕茧脱胶：将蚕去除蚕蛹及杂质，在na2co3水溶液煮沸，去除丝胶，清洗，晾干，得到丝素；
7.(2)丝素溶解：将溴化锂水溶液放于容器中，将容器放于水浴锅中，将丝素慢慢放于溴化锂水溶液中，并不断搅拌，直至丝素完全溶解，得到丝素溶解液1；
8.(3)丝素透析：将丝素溶解液1进行透析，得到丝素溶解液2；
9.(4)丝素酶解：将蛋白酶加入上述丝素溶解液2中，充分搅拌均匀，然后装入三角烧瓶并盖上盖子，放置于恒温震荡摇床中震荡，得到酶解完毕的丝素肽溶液；
10.(5)木瓜白酶灭活：将酶解完毕的丝素肽溶液煮沸，使木瓜蛋白酶失活；
11.(6)过滤：将步骤(5)中煮沸后的丝素肽溶液过滤，得到透明澄清液体；
12.(7)干燥：将步骤(6)中透明澄清的液体进行干燥，得到丝素多肽，密闭储存。
13.作为一种优选的方案，步骤(1)所述蚕为桑蚕、蓖麻蚕、柞蚕、天蚕和琥珀蚕的一种或多种。
14.作为一种优选的方案，步骤(1)所述na2co3水溶液的溶度为0.4～0.6％；
15.作为一种优选的方案，步骤(1)所述na2co3水溶液的溶度为0.5％；
16.作为一种优选的方案，步骤(1)所述桑蚕茧，na2co3水溶液的质量比为1：(15～25)。
17.作为一种优选的方案，步骤(1)所述桑蚕茧，na2co3水溶液的质量比为1：20。
18.作为一种优选的方案，步骤(1)所述煮沸的时间为1h。
19.作为一种优选的方案，步骤(1)所述丝素占蚕茧重量的73～77％。
20.作为一种优选的方案，步骤(2)所述溴化锂水溶液的浓度为9.0～9.5mol/l。
21.作为一种优选的方案，步骤(2)所述溴化锂水溶液的浓度为9.3mol/l。
22.作为一种优选的方案，步骤(2)所述水浴锅的温度为75～85℃。
23.作为一种优选的方案，步骤(2)所述丝素的添加量为每7l溴化锂溶液溶解0.8～1.2kg丝素。
24.作为一种优选的方案，步骤(3)所述透析的具体实现方式：将冷却后的丝素溶解液用截留分子量为3500da的透析袋装好，放入纯化水中透析72-96h，每4小时换一次水，至透析液电导率小于5us/cm。
25.作为一种优选的方案，步骤(4)所述蛋白酶为弹性蛋白酶，胰蛋白酶，木瓜蛋白酶，胶原酶的一种或多种。
26.作为一种优选的方案，步骤(4)所述蛋白酶为木瓜蛋白酶。
27.作为一种优选的方案，步骤(4)所述蛋白酶的添加量为1mg/25u。
28.在本发明中，所述1mg/25u是指1mg丝素干重配比25活力单位的木瓜蛋白酶。
29.作为一种优选的方案，步骤(4)所述震荡的具体实现方式为震荡的时间为15～17h，震荡的频率为80～100rpm，震荡的温度为55～65℃。
30.在本技术文件中，通过限定添加量为1mg/25u的木瓜蛋白酶，对于丝素具有优异的水解能力，这可能是由于木瓜蛋白酶水解的氨基酸在丝蛋白分子上占有很大的比例，因此当水解丝素时，其水解位点介绍，因此水解能力较大，本技术人在实验过程中发现，当木瓜蛋白酶的添加量为1mg/25u时，在震荡的时间为15～17h，震荡的频率为80～100rpm，震荡的温度为55～65℃的震荡条件下，可以获得多肽分子量在10000以下的丝素多肽，同时分离效率高。
31.作为一种优选的方案，步骤(5)所述煮沸的时间为15～25min。
32.作为一种优选的方案，步骤(6)所述过滤的具体实现方式为尼龙纱布，精密仪器的任意一种。
33.作为一种优选的方案，步骤(6)所述过滤的具体实现方式为尼龙纱布。
34.作为一种优选的方案，所述尼龙纱布的平均粒径为500目。
35.作为一种优选的方案，步骤(7)所述干燥的具体实现方式为用离心喷雾干燥机进行干燥。
36.作为一种优选的方案，所述离心喷雾干燥机的干燥温度为165℃-175℃，所述离心喷雾干燥机的离心头转速为420～470r/s。
37.与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
38.1、在本技术文件中，通过限定添加量为1mg/25u的木瓜蛋白酶，在对于丝素具有优异的水解能力，并且在震荡的时间为15～17h，震荡的频率为80～100rpm，震荡的温度为55～65℃的震荡条件下，可以获得多肽分子量在10000以下的丝素多肽，同时具有优异的分离效率。
39.2、在本技术文件中，丝素溶解液用截留分子量为3500da的透析袋，在纯化水中反复透析，除去色素和无机分子，同时加快了超低分子量部分的链段的透析，从而可以透析出超低分子量部分从而获得目标分子量部分。
40.3、在本技术文件中，采用木瓜蛋白酶在特定的条件下水解丝素蛋白，使其制备的
丝素多肽含量高，分子量的分布具有较佳的均一性。
41.4.在本技术文件中，提供的丝素多肽的制备方法简单，用酶法高效制备为小分子量的多肽分子复合物，制备的丝素蛋白分子量低，分子量分布均一，多肽量高，分离效率高。
附图说明
42.图1为实施例1凝胶过滤法检测丝素多肽分子量的液相谱图。
43.图2为实施例1干燥处理后的丝素多肽粉末实物照片。
44.图3为实施例1与对比例2-5的平均分子量的对比图。
具体实施方式
45.实施例
46.实施例1
47.一种制备丝素多肽的方法的制备工艺，包括以下步骤：
48.(1)蚕茧脱胶：将蚕去除蚕蛹及杂质，在na2co3水溶液煮沸，去除丝胶，清洗，晾干，得到丝素；
49.(2)丝素溶解：将溴化锂水溶液放于容器中，将容器放于水浴锅中，将丝素慢慢放于溴化锂水溶液中，并不断搅拌，直至丝素完全溶解，得到丝素溶解液1；
50.(3)丝素透析：将丝素溶解液1进行透析，得到丝素溶解液2；
51.(4)丝素酶解：将蛋白酶加入上述丝素溶解液2中，充分搅拌均匀，然后装入三角烧瓶并盖上盖子，放置于恒温震荡摇床中震荡，得到酶解完毕的丝素肽溶液；
52.(5)木瓜白酶灭活：将酶解完毕的丝素肽溶液煮沸，使木瓜蛋白酶失活；
53.(6)过滤：将步骤(5)中煮沸后的丝素肽溶液过滤，得到透明澄清液体；
54.(7)干燥：将步骤(6)中透明澄清的液体进行干燥，得到丝素多肽，密闭储存。
55.步骤(1)中蚕为桑蚕；
56.步骤(1)所述na2co3水溶液的溶度为0.5％；步骤(1)所述桑蚕茧，na2co3水溶液的质量比为1：20。步骤(1)所述煮沸的时间为1h。步骤(1)所述丝素占蚕茧重量的75％。
57.步骤(2)所述溴化锂水溶液的浓度为9.3mol/l；步骤(2)所述水浴锅的温度为80℃。步骤(2)所述丝素的添加量为每7l溴化锂溶液溶解1kg丝素。
58.步骤(3)所述透析的具体实现方式：将冷却后的丝素溶解液用截留分子量为3500da的透析袋装好，放入纯化水中透析96h，每4小时换一次水，至透析液电导率小于5us/cm。
59.步骤(4)所述蛋白酶为木瓜蛋白酶。步骤(4)所述蛋白酶的添加量为1mg/25u。
60.所述1mg/25u是指1mg丝素干重配比25活力单位的木瓜蛋白酶。所述木瓜蛋白酶购买自北京奥博星生物技术有限责任公司。
61.步骤(4)所述震荡的具体实现方式为震荡的时间为16h，震荡的频率为90rpm，震荡的温度为60℃。
62.步骤(5)所述煮沸的时间为20min。
63.步骤(6)所述过滤的具体实现方式为尼龙纱布；所述尼龙纱布的平均粒径为500目。
64.步骤(7)所述干燥的具体实现方式为用离心喷雾干燥机进行干燥；所述离心喷雾干燥机的干燥温度为170℃，所述离心喷雾干燥机的离心头转速为450r/s。
65.由图1看出制备的丝素多肽的分子量为10000以下。
66.对比例1
67.对比例1的具体实施方式同实施例1，不同之处在于，对比例1中步骤(2)丝素溶解。将水溶液放于容器中，将容器放于水浴锅中，将丝素慢慢放于水溶液中，并不断搅拌，该工艺无法溶解丝素，也即无法进行下一步工艺步骤。
68.对比例2
69.对比例2的具体实施方式同实施例1，不同之处在于，对比例2中步骤步骤(4)所述蛋白酶为胰蛋白酶。步骤(4)所述胰蛋白酶的添加量为250u/mg。所述胰蛋白酶购买自北京奥博星生物技术有限责任公司。
70.对比例3
71.对比例3的具体实施方式同实施例1，不同之处在于，对比例3中步骤(4)丝素酶解：将蛋白酶加入上述丝素溶解液2中，充分搅拌均匀，然后装入三角烧瓶并盖上盖子，放置于恒温震荡摇床中震荡，得到酶解完毕的丝素肽溶液。步骤(4)所述蛋白酶的添加量为1mg/15u。所述1mg/15u是指1mg丝素干重配比15活力单位的木瓜蛋白酶。
72.对比例4
73.对比例4的具体实施方式同实施例1，不同之处在于，对比例4中步骤(4)所述震荡的具体实现方式为震荡的时间为16h，震荡的频率为90rpm，震荡的温度为30℃。
74.对比例5
75.对比例5的具体实施方式同实施例1，不同之处在于，对比例5中步骤(4)所述震荡的具体实现方式为震荡的时间为8h，震荡的频率为90rpm，震荡的温度为60℃。
76.性能测试：
77.(1)平均分子量：对实施例1和对比例2-5所得到的丝素多肽进行平均分子量的测定，见图3。