一种多模态复合功能幽门螺杆菌核酸检测试纸

1.本发明属于生物检测技术领域，涉及一种多模态复合功能幽门螺杆菌核酸检测试纸。


背景技术：

2.公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
3.由于幽门螺杆菌(helicobacter pylori,h.pylori)的感染具有普遍性和长期性，无论是对其进行控制、治疗还是预后跟踪，都需要长期、频繁、实时的检验，给病人带来了很大的负担，便捷、家用和廉价的检测方法对其防治工作有重要意义。据发明人研究了解，目前没有能够快速、灵敏、准确检测h.pylori的家用产品。


技术实现要素：

4.为了解决现有技术的不足，本发明的目的是提供一种多模态复合功能幽门螺杆菌核酸检测试剂盒，集核酸提取与检测为一体，灵敏地检测唾液样本中幽门螺杆菌核酸，并通过不同分区的结果来进行半定量地筛查。
5.为了实现上述目的，本发明的技术方案为：
6.一方面，一种多模态复合功能幽门螺杆菌核酸检测试纸，按照液体流动方向依次设置样品区、核酸提取区、初检区和复检区，所述样品区设置为用于滴加样品，所述复检区设置捕获探针，所述捕获探针能够与幽门螺杆菌核酸杂交。
7.另一方面，一种多模态复合功能幽门螺杆菌核酸检测试剂盒，包括：
8.检测试纸，按照液体流动方向依次设置样品区、核酸提取区、初检区和复检区，所述样品区设置为用于滴加样品，所述复检区设置捕获探针，所述捕获探针能够与幽门螺杆菌核酸杂交；
9.dna裂解液，用于对核酸提取区内的样品裂解释放幽门螺杆菌核酸；
10.初检试剂，用于对检测试纸初检区的幽门螺杆菌核酸进行反应释放荧光团；
11.复检试剂，用于对检测试纸复检区中捕获探针捕获的幽门螺杆菌核酸进行酶切循环扩增同时进行反应释放荧光团。
12.本发明在一个检测试纸中同时设置初检区和复检区，当幽门螺杆菌核酸核酸量较多时，通过初检试剂在初检区进行反应，即可通过释放的荧光团对幽门螺杆菌进行可视化检测，当幽门螺杆菌核酸核酸量较少时，仅在初检区进行反应释放的荧光团较少，荧光信号肉眼不可辨，此时，再通过复检试剂在复检区进行循环扩增同时进行反应释放荧光团，经过扩增后荧光团的释放量增多，从而产生肉眼可辨的荧光信号，由此实现高浓度幽门螺杆菌与低浓度幽门螺杆菌的筛查。
13.由于不同时间获得样品中的幽门螺杆菌浓度不同，当采用初检浓度较低时，再采
样进行复检，存在样品不同导致的误差，因而本发明在同时设置初检区和复检区时，还设置样品区、核酸提取区，实现一次采样，能够同时进行初检和复检。其过程为：将样品置于样品区时，经过流动进入核酸提取区，通过dna裂解液对样品中的幽门螺杆菌核酸进行提取，提取后的幽门螺杆菌核酸进入初检区和复检区。由于初检区进行即时检测，因而可以通过添加初检试剂后进行孵育即可实现初次检测。而复检区是在初检后进行再次检测，因而设置捕获探针，在核酸提取区提取的幽门螺杆菌核酸依次进入初检区和复检区后，被复检区内的捕获探针捕获，从而同一样品提取的幽门螺杆菌核酸固定在复检区，当进行复检时，添加复检试剂即可实现对初检后的同一样品中的幽门螺杆菌核酸进行再次检测，避免再次采样带来的误差，检测更为准确。
14.本发明的有益效果为：
15.1.本发明将样品区、核酸提取区、初检区和复检区设置在同一检测试纸中，能够实现核酸提取与检测通过一次进样完成，大大缩短了样本前处理的时间，适用于现场即时检测，方便家用，同时利用初检区和复检区中荧光团的释放，可以通过可视化条带信息实现对幽门螺杆菌核酸的检测。
16.2.本发明的初检区和复检区分别与初检试剂和复检试剂配合，通过一次信号转化和循环信号扩增完成对不同浓度的幽门螺杆菌核酸进行检测，通过不同区的荧光信号能够用于初步判定幽门螺杆菌感染的不同阶段，在激发光照射下以荧光信号的强弱表示幽门螺杆菌核酸的浓度高低，可以灵敏地对不同浓度范围的幽门螺杆菌进行检测。
附图说明
17.构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
18.图1为本发明实施例的检测原理示意图；
19.图2为本发明实施例的可行性验证结果图，a为荧光谱图，b为凝胶电泳图；
20.图3为本发明实施例初检区进行crispr/cas12a检测的条件优化结果图，a为荧光信号强度与温度变化关系的柱状图，b为cas12a酶浓度对荧光信号强度影响曲线，c为目标链(幽门螺杆菌核酸)加入后荧光信号随时间变化曲线，d为荧光信号强度与报告dna(reporter dna)浓度的关系柱状图；
21.图4为本发明实施例初检区和复检区对不同浓度目标链(幽门螺杆菌核酸)检测的结果图；a为高浓度目标链所对应的荧光谱图，b为高浓度目标链检测标准曲线拟合，c为低浓度目标链所对应的荧光谱图，d为低浓度目标链检测标准曲线拟合；
22.图5为本发明检测不同浓度幽门螺杆菌核酸的检测结果，a为高浓度(0.1nm)样品条带，b为低浓度(0.01nm)样品条带。
具体实施方式
23.应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
24.需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根
据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
25.鉴于目前没有能够快速、灵敏、准确检测h.pylori的家用产品，本发明提出了一种多模态复合功能幽门螺杆菌核酸检测试剂盒。
26.本发明的一种典型实施方式，提供了一种多模态复合功能幽门螺杆菌核酸检测试纸，按照液体流动方向依次设置样品区、核酸提取区、初检区和复检区，所述样品区设置为用于滴加样品，所述复检区设置捕获探针，所述捕获探针能够与幽门螺杆菌核酸杂交。
27.该实施方式的一些实施例中，捕获探针为发夹探针，发夹探针连接纳米金。通过纳米金将捕获探针固定在复检区，能够将幽门螺杆菌核酸固定在复检区，从而触发酶切循环反应，更有利于实现低灵敏检测。
28.该实施方式的一些实施例中，核酸提取区、初检区和复检区位于硝酸纤维素膜上。
29.在一种或多种实施例中，样品区搭接在核酸提取区。
30.本发明的另一种实施方式，提供了一种多模态复合功能幽门螺杆菌核酸检测试剂盒，包括：
31.检测试纸，按照液体流动方向依次设置样品区、核酸提取区、初检区和复检区，所述样品区设置为用于滴加样品，所述复检区设置捕获探针，所述捕获探针能够与幽门螺杆菌核酸杂交；
32.dna裂解液，用于对核酸提取区内的样品裂解释放幽门螺杆菌核酸；
33.初检试剂，用于对检测试纸初检区的幽门螺杆菌核酸进行反应释放荧光团；
34.复检试剂，用于对检测试纸复检区中捕获探针捕获的幽门螺杆菌核酸进行酶切循环扩增同时进行反应释放荧光团。
35.所述样品区设置为用于滴加样品。
36.所述核酸提取区设置为用于提取滴加样品中的幽门螺杆菌核酸。
37.所述初检区设置为用于对样品的幽门螺杆菌核酸进行初次核酸检测。
38.所述复检区设置为用于对样品的幽门螺杆菌核酸进行再次核酸检测。
39.本发明在一个检测试纸上述同时设置样品区、核酸提取区、初检区和复检区，实现一次采样，能够同时进行初检和复检，避免再次采样带来的误差，检测更为准确。通过初检区和复检区分别与初检试剂和复检试剂的配合，可以对用于初步判定幽门螺杆菌感染的不同阶段，通过荧光信号的强弱实现对不同浓度幽门螺杆菌的检测。
40.该实施方式的一些实施例中，捕获探针为发夹探针，发夹探针连接纳米金。通过纳米金将捕获探针固定在复检区，能够将幽门螺杆菌核酸固定在复检区，从而触发酶切循环反应，更有利于实现低灵敏检测。
41.该实施方式的一些实施例中，所述初检试剂包括报告dna、cas12a核酶、crrna，所述报告dna同时连接荧光团和淬灭团，所述报告dna在cas12a核酶、crrna和幽门螺杆菌核酸作用下被切断为含有荧光团的序列和含有淬灭团的序列。
42.在一种或多种实施例中，所述复检试剂包括复检添加剂，复检添加剂加入至初检试剂中形成复检试剂，复检添加剂包括引物、聚合酶和剪切酶，捕获探针、聚合酶和剪切酶能够对幽门螺杆菌核酸进行酶切-链取代循环反应对幽门螺杆菌核酸进行扩增。
43.该实施方式的一些实施例中，所述复检试剂包括引物、聚合酶、剪切酶、报告dna、cas12a核酶、crrna；引物、捕获探针、聚合酶和剪切酶能够对幽门螺杆菌核酸进行酶切-链取代循环反应对幽门螺杆菌核酸进行扩增，报告dna在cas12a核酶、crrna和幽门螺杆菌核酸作用下被切断为含有荧光团的序列和含有淬灭团的序列。
44.在一种或多种实施例中，复检试剂还包括脱氧核糖核苷三磷酸(dntp)。
45.该实施方式的一些实施例中，核酸提取区、初检区和复检区位于硝酸纤维素膜上。
46.在一种或多种实施例中，样品区搭接在核酸提取区。
47.该实施方式的一些实施例中，所述试剂盒还包括缓冲溶液。用于配制初检试剂和/或复检试剂。
48.该实施方式的一些实施例中，所述试剂盒还包括纯水和吸水纸。纯水用于浸润样品，吸水纸用于引流。
49.利用上述多模态复合功能幽门螺杆菌核酸检测试剂盒进行检测的方法，包括如下步骤：
50.将待测样品滴加至样品区，用纯水浸润后，用吸水纸引流，进入核酸提取区；
51.向核酸提取区中加入dna裂解液，使核酸提取区中的样品中的幽门螺杆菌核酸游离；
52.核酸提取区内的游离的幽门螺杆菌核酸游离进入初检区和复检区；
53.向初检区内加入配制后的初检试剂溶液，孵育后，进行荧光检测，根据初检区的荧光信号，判断是否进行复检；
54.当初检区存在荧光信号时，无需进行复检；当初检区不存在荧光信号时，向复检区内加入配制后的复检试剂溶液，孵育后，进行荧光检测。
55.为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例与详细说明本发明的技术方案。
56.实施例
57.一种多模态复合功能幽门螺杆菌核酸检测试剂盒，包括检测试纸，dna裂解液、初检试剂、复检试剂。
58.检测试纸依次设置样品区、核酸提取区、初检区和复检区，复检区含有连接纳米金的捕获探针。
59.初检试剂主要包括报告dna、cas12a核酶、crrna。
60.复检试剂主要包括引物、聚合酶、剪切酶、报告dna、cas12a核酶、crrna。
61.该检测试剂盒的检测原理如图1所示：收集唾液样品滴加至样品区，扩散至核酸提取区，经过dna裂解液后，完成幽门螺杆菌核酸提取。提取后的幽门螺杆菌核酸随溶液经过吸水纸引流，进入初检区和复检区。在初检区内，幽门螺杆菌核酸、报告dna、cas12a核酶和crrna进行crispr/cas12a检测，实现对高浓度幽门螺杆菌核酸的检测。在复检区内，捕获探针与幽门螺杆菌核酸杂交，经过引物、聚合酶、剪切酶的作用进行靶标循环扩增反应实现对幽门螺杆菌核酸的扩增，扩增后的幽门螺杆菌核酸与报告dna、cas12a核酶和crrna进行crispr/cas12a检测，从而实现对低浓度幽门螺杆菌核酸的检测。经过一次进样完成对幽门螺杆菌核酸的提取和检测，大大缩短了样本前处理的时间。
62.样本处理：将dna裂解液预滴在该区域，之后将收集的唾液样本取10μl滴在该区域
后，室温育3min后，即完成核酸提取。
63.crispr/cas12a检测：将一定浓度的cas12a核酶和crrna混合孵育1h后，加入预先准备好的reporter dna(终浓度为500nm)和不同浓度的target，并用depc水定容至100μl，37℃孵育90min，65℃，10min终止反应后，取该溶液用荧光分光光度计对标准曲线进行扫描。
64.靶标循环扩增反应：首先，将一定浓度的hairprobe，primer和target链混合后,95℃,10min进行退火后，把该产物1μl,dntp(10mm)1.8μl,atp(10mm)1μl,klenow(500u/ml)1μl,nb.bbvci(1000u/ml)1μl,10
×
nebuffer 2,dtt(10mm)1μl并用纯水定容至10μl。将该混合溶液置于37℃恒温振荡器中孵育1h后，95℃，10min用于终止酶促反应。将终止后的反应产物按照上述的crispr/cas12a检测的步骤进行信号读出。
65.试纸可视化检测：纸上直接滴加唾液样本后，使用纯水浸润后，在初检区滴加crispr/cas12a检测反应液，在复检区滴加纳米金固定hairprobe核酸链用于捕获目标target链。将目标分子溶液滴加于核酸提取区，从另一端以吸水纸引流，使样品流过检测区，并在激发灯照射下拍照测试荧光强度。当目标分子浓度较高时，初检区和复检区都会出现绿色条带，初检区亮度明显高于复检区；当目标分子浓度较低时，初检区不亮，再向复检区加入酶切-链取代循环与crispr/cas12a检测反应液，进行靶标循环扩增反应，复检区通过信号扩增可出现明显的绿色条带。
66.图2表明初检区只有当同时存在crrna，cas12a和目标链时，target通过识别crrna从而激活cas12a酶去反式切割reporter dna序列，使得荧光基团远离淬灭基团，荧光信号恢复。复检区凝胶电泳可以看到通过酶切循环产生了与目标链核酸分子量一致的条带，表明复检区和初检区的实验均具有可行性
67.图3表明经优化后，cas12a酶浓度为80nm，reporter浓度为500nm，温度为37℃，反应时间为90min时，实验条件达到最优。
68.图4表明通过荧光信号测量发现，不同浓度的幽门螺杆菌核酸均有响应。
69.图5表明两种不同浓度的幽门螺杆菌核酸通过本发明的试纸检测后可以出现肉眼可见的绿色条带。
70.本实施例中所使用的核酸序列为(5’到3’)：
71.crrna:uaauu ucuac uaagu guaga u gcaag acgga aagac cccgu-3，见seq id no.1。
72.hairprobe(发夹探针)：
73.tctgcaagacggaaagaccccgtcctcagctcttgcaga，见seq id no.2。
74.target：acggggtctttccgtcttgc，见seq id no.3。
75.primer(引物)：tctgcaag，见seq id no.4。
76.reporter dna(报告dna)：bhq1-ttatt-fam，见seq id no.5。
77.以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。