OTUB1基因、其检测试剂和抑制剂的应用

otub1基因、其检测试剂和抑制剂的应用
技术领域
1.本发明属于生物医药技术领域，具体涉及otub1基因、其检测试剂和抑制剂的应用。


背景技术：

2.hippo信号通路在多个生物过程中发挥重要作用，包括器官大小控制、组织稳态、癌变和免疫应答。hippo信号通路的激活受磷酸化级联调控，在哺乳动物中，hippo激酶mst1/2磷酸化lats1/2激酶，而磷酸化的lats1/2促进yap/taz蛋白的磷酸化，导致蛋白定位在细胞质和从而引起蛋白质的降解。如果hippo信号失活，不被磷酸化的yap/taz转录进核中，促进其靶基因的表达。在人类癌症中，yap蛋白在包括胃癌在内的几种人类癌症中升高，而yap的表达水平与远处转移和低生存率相关。分子生物学研究表明，yap可促进胃癌的侵袭和迁移。此外，hippo/yap轴的激活可以与干扰素-irf3通路协同作用，促进ebv感染胃癌模型的肿瘤进展。基于这些背景，我们可以得出结论，hippo-yap轴的过度激活在胃癌的致癌过程中起着重要的作用，而靶向yap蛋白的功能或表达可能是一种很有前途的胃癌治疗策略。
3.虽然在生理条件下，yap蛋白的水平和活性受到一系列hippo信号激酶的严格控制，但yap蛋白在恶性肿瘤中过表达或过激活仍旧是个谜。mst1/2-lats1/2-yap的磷酸化级联反应已被证明在调节hippo/yap活性中发挥核心作用，但最近的研究揭示了其他一些翻译后修饰-如泛素化-也在hippo信号中发挥重要作用。泛素化修饰是一个可逆的过程，它受到e3泛素连接酶和去泛素酶之间的微妙平衡的影响。去泛素化酶(dub)主要从底物中裂解泛素，并与泛素连接酶进行蛋白质降解。人类基因组中约存在100个dub，usp(泛素特异性蛋白酶)家族是最大的去泛素化酶家族。虽然有报道称一些dub家族成员可以调节hippo/yap活性和人类癌症进展，但目前尚不完全清楚哪些dub是hippo信号传导和癌症进展的关键调节因子。


技术实现要素：

4.为了弥补现有技术的不足，本发明特提供otub1基因、其检测试剂和抑制剂在胃癌诊断和治疗中的相关应用。
5.第一方面，本发明提供检测otub1基因表达水平的试剂在制备诊断胃癌的产品中的应用。
6.进一步的，所述otub1基因在胃癌患者体内表达升高。
7.更进一步的，所述试剂选自：
8.特异性识别所述otub1基因的探针；或
9.特异性扩增所述otub1基因的引物；或
10.特异性结合所述otub1基因编码的蛋白的特异性结合剂。
11.更进一步的，特异性扩增所述otub1基因的引物序列如seq id no.4-5所示。
12.第二方面，本发明提供所述otub1基因在筛选治疗胃癌的潜在物质中的应用，所述物质为下调所述otub1基因表达水平的物质。
13.第三方面，本发明提供所述otub1基因的表达抑制剂在制备治疗胃癌的药物中的应用。
14.进一步的，所述抑制剂包括能够靶向干扰所述otub1基因的sirna或shrna。
15.更进一步的，所述sirna的序列如seq id no.1-2所示，所述shrna的序列如seq id no.8-9所示。
16.第四方面，本发明提供一种用于治疗胃癌的药物组合物，所述药物组合物包括治疗有效量的所述的抑制剂。
17.进一步的，所述药物组合物还包括与所述抑制剂配伍的其他药类以及药学上可接受的载体和/或辅料。
18.本发明的有益效果：
19.本发明首次在临床样本和实验研究中发现otub1基因与胃癌的发生。我们证实了otub1基因在胃癌中表达升高，并与低生存率相关。通过检测受试者中所述otub1基因的表达水平，可以判断受试者是否患有胃癌以及患胃癌的风险。
20.本发明首次发现otub1消耗可抑制体内外胃癌的进展，由此可见，以otub1基因作为靶点进行胃癌的治疗具有较好的可行性及推广性。
附图说明
21.图1为tcga数据分析胃癌组织与正常癌旁组织中otub1基因mrna表达水平的散点图。
22.图2为tcga数据分析不同分期胃癌组织与正常癌旁组织中otub1基因mrna表达水平的散点图。
23.图3为组织芯片和免疫组化分析otub1蛋白在胃癌组织与正常癌旁组织的差异表达的结果图，a为胃癌组织和癌旁组织的强染色照片，b为胃癌组织和癌旁组织的平均光密度评分。
24.图4为靶向otub1基因的sirna的沉默效率验证，a为ags细胞的rt-qpcr检测结果图，b为ags细胞的western blot检测结果图，c为mkn28细胞的rt-qpcr检测结果图，d为mkn28细胞的western blot检测结果图。
25.图5为沉默otub1基因对胃癌细胞增殖的影响，a为ags细胞的测定结果，b为mkn28细胞的测定结果。
26.图6为沉默otub1基因对胃癌细胞中edu阳性细胞的影响，a为ags细胞的测定结果，b为a的具体量化结果，c为mkn28细胞的测定结果，d为c的具体量化结果。
27.图7为沉默otub1基因对胃癌细胞周期的影响，a为ags细胞的周期统计，b为mkn28细胞的周期统计。
28.图8为沉默otub1基因对胃癌细胞迁移的影响，a为ags细胞在指定时间的划痕图片，b为a的具体量化结果，c为mkn28细胞在指定时间的划痕图片，d为c的具体量化结果。
29.图9为沉默otub1基因对胃癌细胞侵袭的影响，a为ags细胞在transwell实验中的结晶紫染色图片，b为a的具体量化结果，c为mkn28细胞在transwell实验中的结晶紫染色图
片，d为c的具体量化结果。
30.图10为沉默otub1基因对胃癌细胞克隆数量的影响，a为ags细胞在克隆形成实验中的结晶紫染色图片，b为a的具体量化结果，c为mkn28细胞在克隆形成实验中的结晶紫染色图片，d为c的具体量化结果。
31.图11为沉默otub1基因对胃癌细胞球体数量的影响，a为ags细胞在3d培养实验中的拍照图，b为a的具体量化结果，c为mkn28细胞在3d培养实验中的拍照图，d为c的具体量化结果。
32.图12为沉默otub1基因对胃癌细胞凋亡的影响，a为ags细胞的测定结果，b为mkn28细胞的测定结果。
33.图13为沉默otub1基因对胃癌肿瘤生长影响的测定结果，a为瘤体体积的图像分析结果，b为瘤体重量的量化结果，c为注射胃癌细胞后不同时间瘤体体积的量化结。
34.图14为沉默otub1基因对mkn28细胞的肺转移能力的影响，a为肺转移瘤图像分析结果，b为转移性肺结节数统计。
具体实施方式
35.下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明的限制。如未特殊说明，下述实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
36.本发明经过广泛而深入的研究，确定了otub1(gene id:55611)是胃癌进展的一个关键因素。otub1与yap相关，并调节yap蛋白的活性和稳定性，随后对hippo的开启或关闭状态产生关键作用。由于otub1已被证明是hippo信号通路中重要的去泛素酶，靶向otub1的功能或调节otub1的表达可能是胃癌中合理的一种治疗策略。本发明的附加方面和优点将在以下实施例的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
37.实施例1：分析otub1基因在tcga数据库中的表达情况
38.从tcga数据库中下载440例胃癌组织与440例癌旁组织的otub1表达谱数据，分析otub1在胃癌组织和癌旁组织中的表达水平；绘制散点图。
39.结果表明：otub1 mrna在胃癌组织中的表达高于正常胃组织(图1)，与正常胃组织相比，不同胃癌分期的otub1均有升高(图2)。
40.实施例2：组织芯片和免疫组化分析otub1基因的差异表达
41.20对石蜡包埋样本来自上海芯超生物技术公司(http://www.superchip.com.cn)。所有胃肿瘤标本均采用病理专科检查，其病理分级来自上海芯超生物技术公司。该样本的使用已由上海芯超生物技术公司批准，并获得所有患者的书面知情同意。采用anti-otub1抗体(稀释1：1000，abcam，#ab270959)检测人类样本的染色密度。根据整个组织中阳性肿瘤细胞的强度和百分比计算评分，根据fromowitz标准进行评分。染色强度分级为：无染色，0；弱阳性，1；中度阳性，2，强阳性。阳性细胞的比例分为四类：0-25％染色，1；26-50％染色，2；51-75％染色，3和76-100％染色，4。染色1、2低表达，染色3、4高表达。所有染色在200倍放大下进行评估，每个核心至少计算3个场。
42.结果如图3所示，其中图3a为胃癌组织和癌旁组织的强染色照片，图3b为胃癌组织和癌旁组织的平均光密度评分，结果证实了otub1在胃癌中的表达高于正常胃组织。
43.实施例3：otub1 sirna的干扰效果检测
44.1、细胞培养
45.ags、mkn28来源于美国标准生物中心(atcc)。ags和mkn28细胞与添加2mm l-谷氨酰清和10％胎牛血清(10270,life technologies)的rpmi-1640(hyclone)一起培养。
46.2、设计sirna
47.siotub1-1(seq id no.1)：5'-gacggcaacuguuucuauc-3'；
48.siotub1-2(seq id no.2)：5'-gacggacugucaaggaguu-3'。
49.sictrl(seq id no.3)：5'-uucuccgaacgugucacgutt-3'。
50.3、转染
51.使用lipofectamine 2000说明书对细胞进行常规转染，转染48小时后，用rt-qpcr以及westernblot检测敲低效率。
52.rt-qpcr：用trizol试剂(invitrogen)分离总rna，然后用hiscript ii q rt supermix(vazyme，#r233-01)逆转录成第一链cdna。采用sybr-greenpcr混合物(cwbio，#cw0659)系统)，采用基因特异性引物对cdna进行实时定量pcr。36b4作为内参。使用的引物如下：
53.otub1-f(seq id no.4)：5'-gtctgccaagagcaaggaag-3'；
54.otub1-r(seq id no.5)：5'-gcttctccacctgctcaatc-3'；
55.36b4-f(seq id no.6)：5'-cgacctggaagtccaactac-3'；
56.36b4-r(seq id no.7)：5'-atctgctgcatctgcttg-3'。
57.westernblot：收集细胞，用含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物的ripa缓冲液(biomake，#b14001，#b15001)裂解。蛋白质在sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)上进行电泳分离，并转移到硝化纤维素膜上(beyotime，#ffn08)，使用的抗体为anti-otub1抗体(稀释1：1000，abcam，#ab270959)，anti-tubulin(稀释1：1000，proteintech,#cat no.11224-1-ap)。结果在三个生物学上独立的实验中重现。
58.结果如图4所示，qpcr检测结果显示，otub1 mirna可以通过两个独立的sirna有效地进行沉默(图4a和图4c)。westernblot检测结果显示，两个sirna均可显著降低otub1蛋白水平(图4b和图4d)。
59.实施例4：敲低otub1对胃癌细胞及肿瘤的影响
60.1、细胞活力测定
61.转染24小时后，收集细胞数量，并将3000个细胞接种到96孔板中。使用cck-8试剂盒(biomake,#b34302)在指定的时间点检测细胞活性。结果在三个生物学上独立的实验中重现。
62.2、edu分析
63.转染48h后，细胞加入edu，继续孵育2h。然后，用4％的多聚甲醛溶液固定细胞30分钟。染色过程根据试剂的说明进行处理。使用evosfl自动显微镜(life technologies)捕获图像，并使用imagej软件计算阳性细胞的数量。结果在三个生物学上独立的实验中重现。
64.3、细胞周期和细胞凋亡分析
65.采用碘化丙啶(pi)染色法测定细胞周期分析。细胞(1
×
107)用pbs洗涤，用70％乙醇室温固定30分钟。用pbs洗涤三次后，细胞用pi结合rnasea(thermo，#f10797)染色。红色
信号用facscan(微孔成像仪)测量。fsc数据采用modfitltv3.1软件进行分析。在凋亡检测中，mkn28和ags采用annexinv和碘化丙啶(pi)双染色，使用annexinv-fitc凋亡检测试剂盒(vazyme，#a211-02)和碘化丙啶(pi)双染色。用facscan(微孔成像仪)测量荧光。fsc数据采用flowjo7.6软件进行分析。结果在三个生物学上独立的实验中重现。
66.4、划痕及迁移实验
67.在划痕试验中，将含有siotub1或sictrl的ags和mkn28细胞接种在6孔板中，直到融合，然后用无菌枪头尖端损伤。在刮后的指定时间点获取细胞图片。划痕两边之间的距离测量使用imagej软件。transwell实验用(8μm孔径，康宁)用于细胞迁移和侵袭，侵袭实验中上室涂上基质(bd生物涂层，美国)24小时后，胃癌细胞迁移到底部的插入膜固定，用结晶紫染色和计数，
×
20物镜下实验重复三次。
68.5、克隆形成实验
69.将含有siotub1或sictrl(50nm)的ags和mkn28细胞接种在6孔板过夜。24小时后，用pbs洗涤胃癌细胞，胰蛋白酶化，低密度镀上(6孔板中每孔约5000个细胞)。细胞培养10天，每2天或3天更新一次培养基。这些细胞团固定后使用结晶紫染色。在每种条件下，计算一个给定区域内的克隆数。
70.6、3d培养实验
71.转染后的mkn28和ags在含有rpmi1640的超低附着板(nunc，#174931)中生长，该1640培养基(servicebio,#g4530)，添加b27(gibco,grand island,ny,usa)，20ng/mlegf和20ng/mlbfgf(peprotech,rocky hill,nj,usa)。培养14天后，计数直径为》为40μm的球。
72.7、动物模型
73.皮下注射，将用shotub1或shnc干扰后的mkn28癌细胞约5
×
106注射到4周龄雌性nsg小鼠的下背部区域，每组6只小鼠。6周后处死小鼠。对于肺转移模型，用同样干扰后的mkn28癌细胞约1
×
106单细胞悬液通过尾静脉注射到4周龄的雌性nsg小鼠体内。直到其中一只老鼠出现严重的呼吸抑制处死所有的小鼠，解剖并观察动物肺转移瘤体积。使用的shrna序列如下：
74.shotub1-1(seq id no.8)：5'-ggatccgttaactgtctggcctatgattcaagagatcataggccagacagttaattttttgaattc-3'；
75.shotub1-2(seq id no.9)：5'-gggatccggacggactgtcaaggagttttcaagagaaactccttgacagtccgtcttttttgaattc-3'；
76.shnc(seq id no.10)：5'-ttctccgaacgtgtcacgtttacgtgacacgttcggagaattaactgtaggccagacacttgtctg-3'。
77.结果：cck-8实验显示，otub1消耗后抑制了ags和mkn28细胞的癌细胞增殖(图5)。edu实验表明，otub1沉默显著降低了ags和mkn28细胞中的edu阳性细胞(图6)。facs分析显示，在ags和mkn28细胞中，otub1缺失均可导致g1细胞周期阻滞(图7)。而在划痕实验中，我们发现otub1消耗抑制了ags和mkn28细胞的划痕愈合速度(图8)。trans-well实验显示，沉默otub1可以抑制ags和mkn28细胞的侵袭能力(图9)，而克隆形成实验显示，沉默otub1可以显著减少ags和mkn28细胞的克隆数量(10)。3d培养实验表明，在ags和mkn28细胞中，球体的形成需要otub1(图11)。碘化丙啶(pi)结合annexinv染色显示，沉默otub1可促进ags和mkn28细胞的癌细胞凋亡(图12)。我们进一步研究了otub1在体内的作用。异种移植模型显
示，沉默otub1显著降低了体内肿瘤的生长(图13)。最后，我们进行了体内转移实验，其中，沉默otub1可以降低mkn28细胞的肺转移能力(图14)。所有这些数据表明，otub1在促进胃癌进展中发挥了重要作用，以otub1基因作为靶标进行胃癌的治疗具有较好的可行性及推广性。
78.尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
79.显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。