蒲公英提取物、蒲公英活性小分子组合物的制备及应用的制作方法

1.本发明涉及蒲公英提取物、蒲公英活性小分子组合物的制备及应用，更具体地讲，本发明涉及蒲公英提取物、蒲公英二萜化合物的组合物的制备方法及其在制备具有抗炎、止痒作用的化妆品/药品中的应用。


背景技术：

2.瘙痒性皮肤病中相关的调节介质大致分为诱导介质、抑制介质及各种细胞因子和炎症细胞。西医治疗皮肤瘙痒主要用抗组胺药物，虽能治愈，但具有一些副作用。中药治疗皮肤病的历史悠久，可控制反复发作性皮肤病或延长其复发时间，减轻或避免化学药的副作用。
3.蒲公英为菊科，蒲公英属多年生草本植物，全科入药，具有清热、燥湿、利尿、缓泻、等功效。蒲公英中含有大量的蒲公英醇、蒲公英素等活性成分，蒲公英提取物在放置病虫害、免疫及抗肿瘤等方面有着重要的活性。
4.例如，中国专利申请201710298174.4公开了一种利用植物提取液防治菊花病虫害的制剂及制备方法。将香樟根、狼毒大戟根和蒲公英全草按重量比1∶1∶1的比例混合，用粉碎机加工成颗粒,过60目筛，放入提取釜中进行萃取，加入75％乙醇,在80～85℃的温度下蒸煮、浓缩，即成香樟根、狼毒大戟根和蒲公英全草复合提取物浓缩膏及结晶体，对菊花病虫害有较高的防治作用。
5.中国专利201310744612.7公开了一种野菊花浸膏与蒲公英浸膏互配的浸膏类烟用香料及其制备方法和应用。野菊花中含有丰富的黄酮、挥发油及多种葡萄糖苷、萜烯类等成分；蒲公英是一种常用的中药材，有抗菌、利胆、通乳、抗肿瘤的功效。此烟用香料对吸烟引发的一系列咽喉炎症有一定的抑制作用。
6.中国专利申请201610343484.9公开了一种复方红豆杉免煎颗粒、其制备方法和用途。其利用含红豆杉、生薏米、丹参、黄柏、紫芍、败浆草、大青叶、蒲公英、知母、黄芩、金银花、泽泻、蜈蚣的物质为原料，经提取、精制、喷雾干燥制备成可用于药品或化妆品的免煎颗粒，对治疗粉刺痤疮可短时间达到理想效果。
7.中国专利201710413443.7公开了一种含有核桃青皮提取物的抗氧化组合物，该抗氧化组合物由以下重量份数的原料制成：核桃青皮提取物35～65份、丹参提取物15～45份、小红参提取物5～35份和蒲公英提取物1～10份。其优点是：具有抗氧化，除皱和保湿的功效。
8.中国专利201810387780.8公开了一种祛痘复方精油制剂及其制备方法和应用，其包括连翘精油、荆芥精油、蛇床子精油、石菖蒲精油、薄荷精油、薰衣草精油、蒲公英精油、蛇油、葡萄籽油、玉米胚芽油、茶树油和荷荷巴油，改善了现有西药祛痘药物毒副作用大且成本高、单方精油作用单一、疗效不显著的技术问题。
9.中国专利201811593435.6公开了一种护肤复合水果植物抗敏提取液、其制备方法和应用，该提取液原料包括质量比为(1～5)：(5～ 10)：(2～5)：(1～5)：(1～3)：(0.1～
0.5)的板蓝根、粉防己、茯苓、苦参根、蒲公英、中华猕猴桃。所得提取液具有保湿、预防、缓解敏感性皮肤过敏炎症的功能。
10.蒲公英提取物在治疗皮肤瘙痒方面鲜有报道。萜类化合物是蒲公英中含有的重要生物活性成分。蒲公英萜类化合物是否具有抗炎、舒缓、止痒的功效未见报道。
11.因此，有必要对蒲公英二萜类化合物进行有区别的分离、富集，以开发具有抗炎、舒缓、止痒的蒲公英二萜类化合物或其组合物并应用于化妆品或药品，将具有重要的应用价值。


技术实现要素：

12.本发明的发明目的之一是提供利用活性追踪法制备的蒲公英活性小分子及其制备方法；本发明的另一发明目的是提供通过活性分析制备的蒲公英提取物；本发明的再一发明目的是提供上述蒲公英活性小分子的组合物以及蒲公英提取物在制备消炎、止痒类化妆品或药品中的应用。
13.一方面，为了实现上述的发明目的，本发明提供了由蒲公英优选全株蒲公英通过活性追踪法制备的、下述结构式中式1至式8所示的蒲公英活性小分子化合物，其中：
14.式1所示的蒲公英活性小分子命名为蒲公英二萜-1，其结构式如下所示：
[0015][0016]
式2所示的蒲公英活性小分子命名为蒲公英二萜-2，其结构式如下所示：
[0017][0018]
式3所示的蒲公英活性小分子命名为蒲公英二萜-3，其结构式如下所示：
[0019][0020]
式4所示的蒲公英活性小分子命名为蒲公英二萜-4，其结构式如下所示：
[0021][0022]
式5所示的蒲公英活性小分子命名为蒲公英二萜-5，其结构式如下所示：
[0023][0024]
式6所示的蒲公英活性小分子命名为蒲公英二萜-6，其结构式如下所示：
[0025][0026]
式7所示的蒲公英活性小分子命名为蒲公英二萜-7，其结构式如下所示：
[0027][0028]
式8所示的蒲公英活性小分子命名为蒲公英二萜-8，其结构式如下所示：
[0029][0030]
另一方面，为了实现上述的发明目的，本发明还提供了一种制备上述蒲公英活性小分子的方法，该活性小分子是在下述的蒲公英提取物的基础上制得的。其中，蒲公英提取物是通过包括如下过程的方法利用活性追踪法制备的：
[0031]
(1)将蒲公英(全株)粉碎；
[0032]
(2)粉碎后的蒲公英用乙醇-水进行渗漉提取；
[0033]
(3)合并减压浓缩步骤(2)所得的提取液，得到浸膏；
[0034]
(4)用水混悬步骤(3)所得的浸膏，得到混悬液；
[0035]
(5)步骤(4)所得的混悬液用乙酸乙酯进行萃取，萃取液浓缩后得乙酸乙酯萃取物；
[0036]
(6)将乙酸乙酯萃取物通过硅胶柱层析分离，采用石油醚-乙酸乙酯混合溶剂进行梯度洗脱，得到若干馏分；
[0037]
(7)构建2,4-二硝基氯苯诱导的正常人皮肤成纤维细胞(nhdf) 的损伤模型，评价步骤(6)所得各馏分的活性；
[0038]
(8)将步骤(7)中具有最佳保护活性的馏分用凝胶柱分离，采用氯仿-甲醇进行梯度洗脱，进一步得到若干馏分；
[0039]
(9)基于构建的2,4-二硝基氯苯诱导的正常人皮肤成纤维细胞 (nhdf)的损伤模型，评价步骤(8)所得各馏分的活性；
[0040]
步骤(9)所得的具有最佳保护活性的馏分即为蒲公英提取物。
[0041]
其中，步骤(5)中选用乙酸乙酯进行萃取也是在活性分析的基础上选择的：第一步，先将步骤(4)所得的混悬液依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取，将各萃取液浓缩后分别得石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物；第二步，基于构建的2,4-二硝基氯苯暴露正常人皮肤成纤维细胞(nhdf)的损伤模型，评价第一步中所得石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物的保护活性，发现乙酸乙酯萃取物具有最佳的保护活性。
[0042]
进一步地，本发明在制备上述蒲公英提取物的基础上，制备出上述的蒲公英活性小分子，其方法包括：
[0043]
a、提供上述的蒲公英提取物；
[0044]
b、步骤a中的蒲公英提取物经制备型hplc分离纯化，得如式1 至式8所示的蒲公英活性小分子即蒲公英二萜化合物。
[0045]
在本发明的制备过程中，步骤(1)所使用的蒲公英优选是全株蒲公英。
[0046]
在本发明的制备过程中，步骤(2)中蒲公英与酒精-水的质量比可以为1:(10-100)。
[0047]
在本发明的制备过程中，步骤(2)中所采用的乙醇-水为30％-75％的乙醇，优选为35％-75％的乙醇，更优选为40％-60％的乙醇，例如45％的乙醇。此处，所说的乙醇浓度为
体积浓度，例如45％的乙醇是指乙醇与水的体积比为45:65。
[0048]
在本发明的制备过程中，步骤(6)中乙酸乙酯萃取物经硅胶柱色谱分离时，选用的硅胶可为80-100目或200-300目或300-400目，优选的硅胶为80-100目或200-300目，更优选的硅胶为200-300目。
[0049]
在本发明的制备过程中，步骤(8)中用凝胶柱分离时，可采用 sephadex lh-20凝胶柱色谱分离，用氯仿-甲醇(100∶0
→
0∶100) 进行梯度洗脱，优选用氯仿-甲醇(100∶30
→
30∶100)进行梯度洗脱，更优选用氯仿-甲醇(100∶50
→
50∶100)进行梯度洗脱。
[0050]
作为本发明制备方法的一种具体实施方式，可采用蒲公英全株 10kg，粉碎，乙醇(100l，45％)的渗漉提取，合并减压浓缩提取液，得浸膏550g；用水溶解浸膏得混悬液，总浸膏用适量水混悬，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取，将各萃取液浓缩后分别得石油醚萃取物(121g)，乙酸乙酯萃取物(202g)，正丁醇萃取物(61.4g)；基于构建的dncb诱导的nhdf细胞损伤模型，评价蒲公英提取物石油醚萃取物，乙酸乙酯萃取物，正丁醇萃取物保护活性；将具有最佳保护活性的蒲公英提取物乙酸乙酯萃取物通过硅胶柱 (200-300目)层析分离，采用石油醚-乙酸乙酯(100:10
→
10:100) 混合溶剂梯度洗脱，得到馏分fr.1-7；基于构建的dncb诱导的nhdf 细胞损伤模型，评价馏分fr.1-7的保护活性；将具有最佳保护活性的fr.3采用sephadex lh-20凝胶柱分离，采用氯仿-甲醇(100∶50
ꢀ→
50∶100)梯度洗脱，得到馏分fr.a1-a10；基于构建的dncb诱导的nhdf细胞损伤模型，评价馏分fr.a1-a10的保护活性；其中，具有最佳保护活性的fr.a6组分作为本发明的蒲公英提取物，其继续经制备型hplc(meoh-h2o)分离纯化得式1所示化合物(454mg)、式2 所示化合物(559mg)、式3所示化合物(324mg)、式4所示化合物 (440mg)、式5所示化合物(489mg)、式6所示化合物(341mg)、式7所示化合物(221mg)、式8(229mg)所示化合物。
[0051]
在本发明中，蒲公英二萜类化合物可以从蒲公英中基于活性追踪法分离提取得到，为其制备提供了一个新的途径。
[0052]
再一方面，为了实现上述的发明目的，本发明还提供了一种用于抗炎、止痒的蒲公英二萜组合物，该组合物包括如上述式1至式8所示的蒲公英活性小分子即蒲公英二萜化合物。
[0053]
优选地，在本发明的蒲公英二萜组合物中，式1至式8的蒲公英二萜化合物的质量比为1:(1-100):(1-100):(1-100): (1-100):(1-100):(1-100):(1-100)；
[0054]
更优选地，在本发明的蒲公英二萜组合物中，式1至式8的蒲公英二萜化合物的质量比为1:(1-50):(1-50):(1-50): (1-50):(1-50):(1-50):(1-50)；
[0055]
进一步优选地，在本发明的蒲公英二萜组合物中，式1至式8的蒲公英二萜化合物的质量比为1:(1-10):(1-10):(1-10): (1-10):(1-10):(1-10):(1-10)。
[0056]
例如，在本发明的蒲公英二萜组合物中，式1至式8的蒲公英二萜化合物的质量比大致为1:1:1:1:1:1:1:1，但此处并非是严格执行的比例。
[0057]
又一方面，为了实现上述的发明目的，本发明还提供了上述蒲公英提取物或上述蒲公英二萜组合物在制备消炎、止痒类化妆品或药品中的应用。
[0058]
在本发明的应用中，该应用可通过提高nhdf细胞活力、抑制nhdf 细胞内ros含量、抑制nhdf细胞炎性细胞因子分泌、抑制nhdf细胞 nlrp3信号通路激活、抑制nhdf细胞nf-κb信号通路激活、降低血清中ige水平、和/或降低皮肤中par-2受体数量而得以实现。
[0059]
在本发明的应用中，用于抗炎、止痒类化妆品或药品可为外用制剂，其形式可为喷剂、慕斯、膏剂、乳剂、或液体制剂。
[0060]
在本发明的应用中，止痒所涉及的痒症可以是由皮肤干燥症、皮炎、荨麻疹、湿疹、或浅部真菌感染之类皮肤病所引起的痒症。
[0061]
在本发明的应用中，所采用的外用制剂可以为相应的缓控释剂，其形式可为用于涂抹给药的包合物、微球、纳米粒、脂质体、或乳剂。
[0062]
在本发明的应用中，止痒药品可以为复方制剂，其包括辅料以及上述的蒲公英提取物或上述的蒲公英二萜组合物。
[0063]
在本发明的应用中，蒲公英提取物或蒲公英二萜组合物可以作为化妆品或护肤品的添加剂，加入至化妆品或护肤品中，作为抗炎、止痒的有效成分。
[0064]
相对于现有技术，本发明至少具有如下的有益效果：
[0065]
(1)本发明的蒲公英二萜组合物、蒲公英提取物能显著抑制皮肤瘙痒模型小鼠炎性细胞因子的过度分泌；
[0066]
(2)本发明的蒲公英二萜组合物、蒲公英提取物能显著减少皮肤瘙痒模型小鼠搔抓次数；
[0067]
(3)本发明的蒲公英二萜组合物抗炎、止痒活性强于蒲公英二萜单独使用。
[0068]
下面将结合具体实施方式和附图对本发明技术方案进行清楚、完整描述。本领域技术人员可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅是本发明一部分的实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明的精神，本领域的普通技术人员可以在不作出创造性劳动的前提下进行相应的替换、变换、改变或改进，但这些替换、变换、改变或改进，仍属于本发明的保护范围。
附图说明
[0069]
图1-图4分别是蒲公英二萜-1的hr-esi-ms谱图、1hnmr谱图、
13
cnmr谱图、dept-135谱图；
[0070]
图5-图8分别是蒲公英二萜-2的hr-esi-ms谱图、1hnmr谱图、
13
cnmr谱图、dept-135谱图；
[0071]
图9-图12分别是蒲公英二萜-3的hr-esi-ms谱图、1hnmr谱图、
13
cnmr谱图、dept-135谱图；
[0072]
图13-图16分别是蒲公英二萜-4的hr-esi-ms谱图、1hnmr谱图、
13
cnmr谱图、dept-135谱图；
[0073]
图17-图20分别是蒲公英二萜-5的hr-esi-ms谱图、1hnmr谱图、
13
cnmr谱图、dept-135谱图；
[0074]
图21-图24分别是蒲公英二萜-6的hr-esi-ms谱图、1hnmr谱图、
13
cnmr谱图、dept-135谱图；
[0075]
图25-图28分别是蒲公英二萜-7的hr-esi-ms谱图、1hnmr谱图、
13
cnmr谱图、dept-135谱图；
[0076]
图29-图32分别是蒲公英二萜-8的hr-esi-ms谱图、1hnmr谱图、
13
cnmr谱图、dept-135谱图；
[0077]
图33显示了蒲公英提取物、蒲公英二萜组合物抑制2,4-二硝基 氯苯诱导(dcnb)诱导的nhdf细胞活力下降以及细胞内ros含量升 高；
[0078]
图34显示了蒲公英提取物、蒲公英二萜组合物抑制dcnb诱导的 nhdf细胞炎性细胞因子分泌；
[0079]
图35显示了蒲公英提取物、蒲公英二萜组合物抑制dcnb诱导的 nhdf细胞nf-κb/mapks信号通路激活；
[0080]
图36显示了蒲公英提取物、蒲公英二萜组合物调控dcnb诱导的 小鼠血清ige及炎性因子含量变化。
[0081]
具体实施方式
[0082]
本发明具体实施方式中所采用的主要试验仪器和主要材料来源为：化合物的核磁检测用bruker av-500或bruker av-400mhz核磁共振仪测定核磁(nmr)，并以tms为内标(德国bruker公司)；用agilent 6210lc/msd tof型质谱仪测定高分辨质谱；用thermofinnigan lcq advantage max质谱仪(美国thermo公司)测定质谱 (esi-ms)；hplc采用dionex型高效液相色谱仪(美国dionex公司)；phplc采用varian制备型高效液相色谱仪(美国varian公司) 和agilent 1100lc/msd型高校色谱仪(美国agilent公司)；cosmosil c-1(8250mm
×
4.6mm,5μm)色谱柱。sephadex lh-20层析填料购于pharmacia公司；ods柱色谱材料购于德国merck公司；柱色谱用硅胶购于青岛海洋化工厂；核磁用氘代试剂购自美国cil公司；所用试剂均为分析纯和色谱纯。
[0083]
实施例1蒲公英提取物的制备
[0084]
蒲公英全株10kg，粉碎，乙醇(100l，45％)的渗漏提取，合并减压浓缩提取液，得浸膏550g。用水溶解浸膏得混悬液，总浸膏用适量水混悬，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取，将各萃取液浓缩后分别得石油醚萃取物(121g)，乙酸乙酯萃取物(202g)，正丁醇萃取物(61.4g)；
[0085]
构建dncb诱导的nhdf细胞损伤模型，评价蒲公英提取物石油醚萃取物，乙酸乙酯萃取物，正丁醇萃取物保护活性；
[0086]
将具有最佳保护活性的蒲公英提取物乙酸乙酯萃取物通过硅胶柱(200-300目)层析分离，采用石油醚-乙酸乙酯(100:10
→
10:100) 混合溶剂梯度洗脱，得到馏分fr.1-7；
[0087]
利用前述dncb诱导的nhdf细胞损伤模型，评价fr.1-7的保护活性；将具有最佳保护活性的fr.3采用sephadex lh-20凝胶柱分离，采用氯仿-甲醇(100∶50
→
50∶100)梯度洗脱，得到馏分 fr.a1-a10；
[0088]
基于构建的dncb诱导的nhdf细胞损伤模型，评价fr.a1-a10的保护活性；具有最佳保护活性的fr.a6组分为本发明的蒲公英提取物。
[0089]
实施例2蒲公英二萜分离、制备
[0090]
将实施例1获得的具有最佳保护活性的fr.a6经制备型hplc (meoh-h2o)分离纯化得式1所示化合物(454mg)、式2所示化合物 (559mg)、式3所示化合物(324mg)、式4所示化合物(440mg)、式5所示化合物(489mg)、式6所示化合物(341mg)、式7所示化合物(221mg)、式8(229mg)所示化合物。
[0091]
蒲公英二萜-1的结构鉴定：
[0092]
请参阅图1-图4。蒲公英二萜-1为无色油状物，其hr-esi-ms谱则显示m/z 301.2135[m+na]
+
(c
18h30
nao2，理论计算值为301.2138)。结合该化合物的nmr谱，由此推断出化合物的分子式为c
18h30
o2，不饱和度(ω)为4。
[0093]1h nmr(400mhz,cdcl3)谱提示该化合物有2个烯氢质子信号 [δ
h 6.82(1h,dd,j＝15.7,10.5hz),6.18(1h,d,j＝15.7 hz)]，而其
13
c nmr(100mhz,cdcl3)谱则提示该化合物含有1对双键碳信号(δ
c 144.9，135.6)，结合其dept-135谱，可判断化合物中含有-ch＝ch-。此外，1h nmr谱中还有5个甲基单峰质子信号[δh2.25(3h,s),1.24(3h,s),0.97(3h,s),0.87(3h,s), 0.80(3h,s)]，而其
13
c nmr谱结合dept-135谱可判断出化合物中还包含1个酮羰基碳信号(δc197.8)，以及1个连氧的季碳信号(δc72.6)。再结合化合物的不饱和度(4)，除去1个酮羰基和1个双键，可知化合物结构中含有2个环。综上所述，推测化合物结构如式1所示。
[0094]
蒲公英二萜-2的结构鉴定：
[0095]
请参阅图5-图8。蒲公英二萜-2为无色油状物，其hr-esi-ms谱则显示m/z 317.2088[m+na]
+
(c
18h30
nao3，理论计算值为317.2087)。结合该化合物的nmr谱，由此推断其分子式为c
18h30
o3，不饱和度为4。
[0096]1h nmr(400mhz,cdcl3)谱提示该化合物有2个烯氢质子信号 [δh6.82(1h,dd,j＝15.8,10.3hz),6.17(1h,d,j＝15.8 hz)]，
13
c nmr(100mhz,cdcl3)谱则提示该化合物含有1对双键碳信号(δc143.3，135.8)，结合其dept-135谱，可判断化合物中含有1个-ch＝ch-。此外，1h nmr谱中还有5个甲基单峰质子信号[δh2.26(3h,s),1.21(3h,s),0.97(3h,s),0.88(3h,s), 0.82(3h,s)]，而其
13
c nmr谱结合dept-135谱可判断出还包含1 个酮羰基碳信号(δc197.9)，1个连氧的次甲基信号(δc79.7)，以及1个连氧的季碳信号(δc76.2)。再结合其不饱和度(4)，除去1个酮羰基和1个双键，可知化合物结构中含有2个环。综上所述，推测化合物结构如式2所示。
[0097]
蒲公英二萜-3的结构鉴定：
[0098]
请参阅图9-图12。蒲公英二萜-3为无色油状物，hr-esi-ms谱则显示m/z 309.2436[m+h]
+
(c
19h33
o3，理论计算值为309.2424)。再结合该化合物的nmr谱，由此推断出其分子式为c
19h32
o3，不饱和度为4。1h nmr(400mhz,cdcl3)谱显示该化合物有1个醛基质子信号[δh9.34(1h,s)]，而
13
c nmr(100mhz,cdcl3)谱结合dept-135 谱则提示该化合物含有1个醛羰基碳信号(δc195.7)，可含有
ꢀ‑
cho。此外，1h nmr谱中还有1个烯氢质子信号[δh6.59(1h,t, j＝7.5hz)]，
13
c nmr谱则提示该化合物含有1对双键碳信号(δc158.7，137.6)，结合其dept-135谱，含有1个-ch＝c-。1h nmr谱中还有5个甲基单峰质子信号[δh1.75(3h,s),1.14(3h,s), 0.87(3h,s),0.86(3h,s),0.80(3h,s)]，
13
c nmr谱结合 dept-135谱可判断出化合物中还包含1个连氧的次甲基信号(δ
c 80.7)，以及1个连氧的季碳信号(δc77.7)。再结合化合物的不饱和度(4)，除去1个醛羰基和1个双键，可知化合物结构中含有2个环。综上所述，推测化合物结构如式3所示。
[0099]
蒲公英二萜-4的结构鉴定：
[0100]
请参阅图13-图16。蒲公英二萜-4为黄色油状物，hr-esi-ms谱则显示m/z 311.2341[m+na]
+
(c
20h32
nao,理论计算值为311.2345)。结合该化合物的nmr谱，推断出分子
式为c
20h32
o，不饱和度(ω)为5。
[0101]1h nmr(400mhz,cdcl3)谱提示该化合物有6个烯氢质子信号 [δh6.30(1h,dd,j＝17.6,10.7hz),5.37(1h,t,j＝6.5hz), 5.02(1h,d,j＝17.3hz),4.85(1h,d,j＝10.7hz),4.81(1h, d,j＝1.4hz),4.44(1h,d,j＝1.4hz)]，
13
c nmr(100mhz,cdcl3) 谱则提示该化合物含有6个双键碳信号(δc148.1,141.8,134.0, 133.6,110.1 108.1)，由此，可判断化合物中含有3个双键。此外，1h nmr谱中还有4个甲基单峰质子信号[δh1.72(3h,s),0.97 (3h,s),0.76(3h,s),0.71(3h,s)]，而其
13
c nmr谱结合 dept-135谱可判断出化合物中还包含1个连氧的次甲基信号(δ
c 79.0)。再结合其不饱和度(5)，除去3个双键，可知化合物结构中含有2个环。综上所述，推测化合物结构如式4所示。
[0102]
蒲公英二萜-5的结构鉴定：
[0103]
请参阅图17-图20。蒲公英二萜-5为白色晶体(ch3oh)，hr-esi-ms 谱则显示m/z 345.2400[m+na]
+
(c
20h34
nao3，理论计算值为 345.2400)。再结合该化合物的nmr谱，由此推断出其分子式为 c
20h34
o3，不饱和度(ω)为4。1h nmr(400mhz,cdcl3)谱提示该化合物有1个烯氢质子信号[δ
h 5.79(1h,t,j＝6.7hz)]，
13
cnmr(100mhz,cdcl3)谱则提示该化合物含有1对双键碳信号(δc138.9,122.2)，结合其dept-135谱，可判断化合物中含有1个
ꢀ‑
c＝ch-。此外，化合物的1h nmr谱中还有5个甲基单峰质子信号 [δh1.58(3h,s),1.09(3h,s),0.84(3h,s),0.78(6h,s)]。而其
13
c nmr谱中还包含4个连氧的碳信号(δc85.8,82.0,78.8, 59.2)。再结合化合物的不饱和度(4)，除去1个双键，可知化合物结构中含有3个环。综上所述，推测化合物结构如式5所示。
[0104]
蒲公英二萜-6的结构鉴定：
[0105]
请参阅图21-图24。蒲公英二萜-6为无色油状物，hr-esi-ms谱则显示m/z 345.2432[m+na]
+
(c
20h34
nao3，理论计算值为345.2400)。结合该化合物的nmr谱，推断出分子式为c
20h34
o3，不饱和度(ω)为4。
[0106]1h nmr(300mhz,cdcl3)谱提示该化合物有3个烯氢质子信号 [δh5.84(1h,dd,j＝17.2,10.7hz),δh5.27(1h,d,j＝17.2 hz),δh5.07(1h,d,j＝10.7hz)]，
13
c nmr(75mhz,cdcl3)谱则提示该化合物含有1对双键碳信号(δc142.4,113.9)，结合其dept-135谱，判断化合物中含有1个-ch＝ch2。此外，化合物的1h nmr谱中还有5个甲基单峰质子信号[δh1.17(3h,s), 1.09(3h,s),0.83(3h,s),0.76(6h,s)]。
13
c nmr谱中还包含 4个连氧的碳信号(δc85.7,82.3,78.0,74.8)。再结合化合物的不饱和度(4)，除去1个双键，可知化合物结构中含有3个环。综上所述，推测化合物结构如式6所示。
[0107]
蒲公英二萜-7的结构鉴定：
[0108]
请参阅图25-图28。蒲公英二萜-7为黄色晶体(ch3oh)，hr-esi-ms 谱则显示m/z 345.2414[m+na]
+
(c
20h34
nao3，理论计算值为 345.2400)。结合该化合物的nmr谱，由此确定化合物的分子式为 c
20h34
o3，不饱和度(ω)为4。1h nmr(300mhz,cdcl3)谱提示该化合物有3个烯氢质子信号[δh6.00(1h,dd,j＝17.8,11.4hz), δh4.95(1h,d,j＝11.4hz),δh4.92(1h,d,j＝17.8hz)]，而其
13
c nmr(75mhz,cdcl3)谱则提示该化合物含有1对双键碳信号(δc146.1,111.0)，结合其dept-135谱，可判断化合物中含有1个-ch＝ch2。此外，化合物的1h nmr谱中还有5个甲基单峰质子信号[δh1.17(3h,s),1.15(3h,s),0.83(3h,s),0.75 (3h,s),0.70(3h,s)]。
13
c nmr谱中还包含4个连氧的碳信号(δc80.3,80.0,76.2,68.9)。再结合
化合物的不饱和度(4)，除去 1个双键，可知化合物结构中含有3个环。综上所述，推测化合物结构如式7所示。
[0109]
蒲公英二萜-8的结构鉴定：
[0110]
请参阅图29-图32。蒲公英二萜-8为无色油状物，hr-esi-ms谱则显示m/z 301.2181[m+h]
+
(c
20h29
o2，理论计算值为301.2162)。结合该化合物的nmr谱，由此推断出化合物的分子式为c
20h28
o2，不饱和度(ω)为7。1h nmr(300mhz,cdcl3)谱提示该化合物有 3个芳氢质子信号[δh7.14(1h,d,j＝8.2hz),6.97(1h,d, j＝8.2hz),6.86(1h,s)]，
13
c nmr(75mhz,cdcl3)谱则提示该化合物含有6个苯环碳信号(δc147.0,145.9,134.9,127.1, 124.3,124.1)，结合其dept-135谱，可判断化合物中含有一个不对称三元取代的苯环。此外，化合物的1h nmr谱中还有4个甲基单峰质子信号[δh1.25(3h,s),1.21(3h,s),1.19(6h,s)]。
13
c nmr谱中还包含1个羰基碳信号(δc184.1)。再结合化合物的不饱和度(7)，除去1个羰基和1个苯环，可知化合物结构中还有2个环。综上所述，推测化合物结构如式8所示。
[0111]
实施例3蒲公英提取物、二萜组合物抗炎活性(细胞试验)
[0112]5×
103细胞/孔，nhdf细胞接种于96孔细胞培养板，培养24h。加入2,4-二硝基氯苯(10μm)处理细胞12h。收集细胞，冷pbs清洗2遍，加入新的培养基并加入终浓度为10μg/ml的蒲公英二萜-1、蒲公英二萜-2、蒲公英二萜-3、蒲公英二萜-4、蒲公英二萜-5、蒲公英二萜-6、蒲公英二萜-7、蒲公英二萜-8或蒲公英二萜组合物(蒲公英二萜-1：蒲公英二萜-2：蒲公英二萜-3：蒲公英二萜-4：蒲公英二萜-5：蒲公英二萜-6：蒲公英二萜-7：蒲公英二萜-8质量比为 1:1:1:1:1:1:1:1)或蒲公英提取物共培育24h后，分离细胞及上清液备用。
[0113]
其中，蒲公英二萜组合物组标记为pet；空白组标记为con，2,4
‑ꢀ
二硝基氯苯组标记为dcnb；蒲公英提取物组标记为pt。
[0114]
图33-a所示的实验结果显示，相比于空白对照组(细胞活力， 100％)，dcnb暴露使nhdf细胞活力降低23.1％，而蒲公英二萜-1、蒲公英二萜-2、蒲公英二萜-3、蒲公英二萜-4、蒲公英二萜-5、蒲公英二萜-6、蒲公英二萜-7、蒲公英二萜-8组细胞活力均高于dcnb组；说明蒲公英二萜-1、蒲公英二萜-2、蒲公英二萜-3、蒲公英二萜-4、蒲公英二萜-5、蒲公英二萜-6、蒲公英二萜-7、蒲公英二萜-8对dcnb 诱导的细胞活力降低有抑制作用，对nhdf细胞有保护活性。
[0115]
图33-b所示的进一步实验结果显示，相比于空白对照组(细胞活力，100％)，dcnb暴露使nhdf细胞活力降低23.1％，而pet,pt 组细胞活力高于dcnb组；其中pet组细胞活力提高最为显著，高于同浓度的pt组；相比于dcnb组，pet组细胞活力提高17.9％。
[0116]
细胞内活性氧化物(ros)含量过高是诱导细胞氧化应激、氧化损伤的毒性因子。图33-c所示的实验结果显示，相比于con组(100％)， dcnb暴露使nhdf细胞内ros含量增加451％；而相比于dncb组，pet,pt 组细胞内ros含量升高被抑制；pet,pt组细胞内ros含量均减少；相比于dcnb组，pet,pt组细胞内ros含量减少25.6％，61.3％。
[0117]
炎性细胞因子在免疫调节和炎症应答中具有重要作用，是机体正常防御系统的重要组成部分，主要有前炎性细胞因子和抗炎性细胞因子。前炎性细胞因子具有促进炎症反应的活性，主要包括il-1、il-5、 il-6、il-8、ifn-γ、tnf-α等。抗炎性细胞因子具有抑制炎症反应活性，主要包括il-4、il-10、il-13等。
[0118]
图34所示的实验结果显示，dncb暴露使nhdf细胞炎性细胞因子(il-17a、il-6、
ifn-γ、tnf-α、il-4、il-10、il-18及il-1 β)及no、pge2分泌显著增加。实验结果说明dcnb暴露诱发nhdf 细胞炎性损伤，而pet,pt处理后，细胞炎性因子及no、pge2过度分泌被抑制。其中pet对dncb诱导的炎性因子及no、pge2过度分泌含量升高抑制活性优于pt。
[0119]
炎症小体是参与机体固有免疫的大分子、多蛋白复合体。目前发现的炎症小体主要分为nlrp1炎症小体、nlrp3炎症小体等。nlrp3 炎症小体是由nlrp3、凋亡相关点状蛋白(asc)和caspase-1的前体 (pro-caspase-1)组成。nlrp3炎症小体组装、活化后，pro-caspase-1 自身酶解为活性状态，活化的caspase-1可诱导促炎因子il-1β和 il-18的惰性前体物质成熟并分泌至胞外，从而诱导炎症级联反应。
[0120]
图35所示的实验结果显示，dcnb暴露使nhdf细胞nlrp3信号通路中nlrp3、asc-1及caspase-1蛋白的含量显著增加，而pro-caspase-1蛋白减少，说明dcnb暴露后诱导nhdf细胞nlrp3信号通路激活。而pet,pt处理后，nhdf细胞nlrp3信号通路中nlrp3、 asc-1及caspase-1蛋白增加被抑制，说明dcnb暴露后诱导的nhdf 细胞nlrp3信号通路激活被抑制。
[0121]
nlrp3信号通路由2个信号通路激活，分别是启动信号和激活信号。启动信号由炎症刺激引发，可诱导nf-κb介导的nlrp3和 pro-il-1β的表达。nf-κb则信号通路是介导炎症反应关键的转录因子，激活的nf-κb信号通路会进一步上调炎性因子的转录翻译，促进炎症。本研究中，dcnb暴露使nhdf细胞信号通路激活，同时， dcnb暴露使nhdf细胞炎性细胞因子il-1β和il-18分泌显著增加。
[0122]
因此，我们进一步检测了nf-κb信号通路相关蛋白的表达变化，图35所示的实验结果显示，dcnb暴露使nhdf细胞nf-κb信号通路中p65，iκbα蛋白的含量显著减少，并诱导了p65，iκbα蛋白的磷酸化，说明dcnb暴露nhdf细胞诱导了nf-κb信号通路激活。而 pet,pt处理后，nhdf细胞nf-κb信号通路中p65，iκbα蛋白的含量减少被抑制，p65，iκbα蛋白的磷酸化也被抑制，我们推测dcnb 暴露诱导的nhdf细胞nf-κb信号通路激活被pet,pt抑制。
[0123]
实施例4蒲公英二萜组合物抗炎、止痒活性(动物模型)
[0124]
昆明种小鼠，spf级，雄性，体重(21
±
2)g，恒温环境饲养，温度(20
±
2)℃，湿度50％，饲养环境为光照节律12h:12h，自由进食进水，适应性喂养1周。将小鼠随机分为4组，每组8只，分别为正常组、皮肤瘙痒模型组、蒲公英二萜组合物组(蒲公英二萜-1：蒲公英二萜-2：蒲公英二萜-3：蒲公英二萜-4：蒲公英二萜-5：蒲公英二萜-6：蒲公英二萜-7：蒲公英二萜-8质量比为 1:1:1:1:1:1:1:1)、蒲公英提取物组。实验开始后，除正常组外，剃须后，用200μl 2％dncb溶液在1
×
1cm贴片上涂抹小鼠背部皮肤1周，并用200μl 0.2％dncb溶液每周2次再次激发。
[0125]
第21天开始，各用药组小鼠按0.25mg/cm2涂抹给药，于每日傍晚给药1次，连续14天(正常组、皮肤瘙痒模型组每日给予同等剂量蒸馏水)。实验过程中，小鼠颈背部剃毛，保持颈背部无毛。于第 28天涂药30min后，记录小鼠搔抓表现；摘眼球取血，3000r/min 离心10min，取血清，elisa法检测血清ige、il-18、il-10及il-1 β含量。
[0126]
本实验部分，蒲公英二萜组合物标记为pet；空白组标记为con， 2,4-二硝基氯苯标记为dcnb；蒲公英提取物标记为pt。
[0127]
从表1数据中可以看出，与正常组比较，皮肤瘙痒小鼠模型组瘙痒潜伏时间显著缩短，皮肤瘙痒次数明显增多。而pt,pet用药后小鼠皮肤瘙痒潜伏时间延长，小鼠皮肤瘙痒次数减少，其中pet组小鼠皮肤瘙痒潜伏时间延长最长，小鼠皮肤瘙痒次数减少最为显著。
[0128]
表1蒲公英二萜组合物对小鼠瘙痒潜伏时间及瘙痒次数的影响
[0129][0130]
与con组比较
#
p＜0.05,
##
p＜0.01；与dcnb组比较
*
p＜0.05,
**
p＜0.01.
[0131]
研究报道，皮肤瘙痒模型小鼠在皮炎发作后会出现血清ige升高的现象。因此，我们检测pt、pet用药能否抑制dcnb介导的皮肤瘙痒小鼠血清ige升高及炎性因子(il-18、il-10及il-1β)分泌增加。
[0132]
图36所示的实验结果显示，相比于正常组，皮肤瘙痒模型组小鼠血清ige含量显著性升高。而pt,pet处理后，与dcnb组比较，小鼠血清ige含量显著降低。其中，pet组ige含量降低最显著。
[0133]
从图36数据中可以看出，与正常组比较，皮肤瘙痒模型组小鼠血清炎性细胞因子il-18、il-10及il-1β含量显著性升高，说明模型组小鼠受到dcnb诱导的严重的炎性损伤。而与皮肤瘙痒模型组比较，pt,pet用药后炎性细胞因子il-18、il-10及il-1β含量升高被抑制，说明pt,pet均具有抑制dcnb诱导的小鼠皮肤炎性损伤的活性。此外，pet抑制小鼠皮肤瘙痒模型小鼠炎性因子il-18、il-10 及il-1β分泌活性高于pt。
[0134]
蛋白酶活化受体2(proteinase activated receptor-2,par-2) 属于g蛋白偶联受体家族(g protein coupled receptor,gpcr)成员，介导跨膜信号转导，可以被丝氨酸蛋白酶激活，par-2在包括皮肤在内的不同组织细胞均有表达，具有广泛的生物学活性。par-2与瘙痒的发生密切相关，和健康人体皮肤组织相比，特应性皮炎患者的类胰蛋白酶分泌明显增多，par-2还可促进血管内皮白细胞黏附迁移，促进il-1β等表达与释放，具有重要的促炎效应和介导组织损伤的作用。因此，par-2是治疗皮肤瘙痒的有益靶点。
[0135]
从表2数据中可以看出，与正常组比较，dcnb组par-2含量显著性升高。pt,pet用药后，与皮肤瘙痒模型dcnb组比较，pt,pet组 par-2含量显著降低。而相比于pt组，pet组par-2降低最显著。
[0136]
表2蒲公英二萜组合物对皮肤瘙痒模型小鼠血清par-2的影响
[0137][0138]
与con组比较
#
p＜0.05,
##
p＜0.01；与dcnb组比较
*
p＜0.05,
**
p＜0.01。