一种基于肠道微生物的结直肠癌辅助筛查标志物组合的制作方法

1.本发明属于肠癌筛查的技术领域，特别涉及一种基于肠道微生物的结直肠癌辅助筛查标志物。


背景技术：

2.结直肠癌一种常见的消化道恶性肿瘤，已成为全球第3大高发和第2高死亡率的癌症，其在我国的发病率呈逐年上升的趋势。约25％的结直肠癌患者在诊断时已出现远处转移，此外，25％的患者在治疗过程中发生转移，晚期患者预后较差，5年生存率不足15％。从早期腺瘤发展至肠癌，往往需要十年左右的时间，早期如果能进行干预，可有效降低肠癌发病率和死亡率，90％的早期患者经过有效治疗能够治愈。世界卫生组织已经明确，肠癌是具有筛查普查价值的癌症。
3.结直肠癌发病原因与遗传、生活方式及环境等有着密切的关系。现有数据表明，绝大部分结直肠癌都是散发病例，遗传因素仅占10％，环境因素占据了90％。而对于肠道来说，生活在其中的微生物就是最大的环境因素。相关的微生物研究结果表明，肠道微生态可诱发或促进结直肠癌。在正常状态下，肠道微生物维持稳定，在营养摄取、维护肠黏膜屏障、调节肠道免疫等方面有重要作用。一旦肠道微生物群结构改变，发生失调，便可通过多种机制促进肿瘤的发生，如释放细菌毒素导致肠道炎症产生、诱导肠黏膜上皮细胞发生遗传学改变、改变肠道微环境等。
4.传统的结直肠癌筛查方法包括免疫粪便潜血检测(fit)、结肠镜等。然而这些筛查手段应用于人群筛查时存在一定的局限性，如内镜检查属于侵入性操作、人群依从性较差、对操作人员技术水平要求较高；fit对结直肠癌前病变诊断效能有限等。因此，提供一种非侵入性、方便有效的结直肠癌筛查方法，有助于提高受检人群的意愿，促进早发现早治疗，降低结直肠癌的发病率和死亡率。


技术实现要素：

5.为解决上述问题，本发明的首要目的在于提供一种基于肠道微生物的结直肠癌辅助筛查标志物组合，该标志物组合能够辅助结直肠癌的筛查与诊断，提高人群筛查意愿。
6.本发明的另一个目的是提供了一种基于肠道微生态的结直肠癌筛查标志物组合，该标志物组合通过对粪便样本dna进行微生物标志物及16s rdna检测，旨在采用无创的方法，通过肠道微生物来辅助结肠癌筛查，增加肠癌筛查方式，提高肠癌筛查意愿。
7.为实现上述目的，本发明的技术方案如下。
8.一种基于肠道微生物的结直肠癌辅助筛查标志物组合，包括以下菌种：厌氧消化链球菌(peptostreptococcus anaerobius)，双歧杆菌属(bifidobacterium)，粪肠球菌(enterococcus faecalis)，具核梭杆菌(fusobacterium nucleatum)以及16s rdna。
9.其中，所述厌氧消化链球菌，其上游引物(f)的引物序列为：agacgaattcaagtcagtaaataca，下游引物(r)的引物序列为：ctcctatccaccaggatatcaa。
10.所述双歧杆菌属，其上游引物(f)的引物序列为：tcgcgtccggtgtgaaag，下游引物(r)的引物序列为：ccacatccagcatccac。
11.所述粪肠球菌，其上游引物(f)的引物序列为：atcaagtacagttagtctttattag，下游引物(r)的引物序列为：acgattcaaagctaactgaatcagt。
12.所述具核梭杆菌，其上游引物(f)的引物序列为：caaccattactttaactctaccatgttca，下游引物(r)的引物序列为：gttgactttacagaaggagattatgtaaaaatc。
13.所述16s rdna，其上游引物(f)的引物序列为：caaccattactttaactctaccatgttca，下游引物(r)的引物序列为：gttgactttacagaaggagattatgtaaaaatc。
14.将上述标志物组合应用于辅助结直肠癌筛查的诊断应用中，其具体实现步骤包括：
15.1)结直肠息肉、结直肠腺瘤、结直肠癌及健康人群招募，所有入组的人群签署知情同意书。结直肠息肉、结直肠腺瘤及结直肠癌均为活体组织经病理学确认结果，健康人为常规体检正常且肠镜排除肠道病变的人群。
16.2)采集所述结直肠息肉、结直肠腺瘤、结直肠癌和健康人群的新鲜粪便样本，取花生粒大小的中段、内层粪便样本到粪便常温保存管中，并颠倒混匀数次，使粪便样品与常温保存液充分混匀接触。
17.3)采用粪便基因组dna提取试剂盒对粪便样本进行基因组dna提取，测定粪便基因组dna的浓度和纯度，采用琼脂糖凝胶电泳检测粪便基因组dna的质量。
18.4)将所述的粪便基因组dna的浓度稀释到1ng/μl。
19.5)对上述粪便基因组dna进行四种微生物菌种及16s rdna进行荧光定量pcr检测，测定上述微生物标志物的ct值，所述微生物标志物为厌氧消化链球菌、双歧杆菌属、粪肠球菌、具核梭杆菌的特异序列，根据所述微生物标志物含量得到四种微生物菌种及16s rdna的检测ct值。
20.6)根据所述四种微生物菌种及16s rdna的检测ct值进行相对丰度分析。
21.7)根据所述四种微生物菌种的相对丰度进行结直肠癌的辅助筛查与诊断。
22.本发明通过采集受检者的粪便样本和健康人群的粪便样本，采用粪便基因组dna提取试剂盒对所述粪便样本进行粪便基因组dna的提取，对所述粪便基因组dna进行厌氧消化链球菌、双歧杆菌属、粪肠球菌、具核梭杆菌及16s rdna的sybr染料法实时荧光定量pcr检测，获得检测ct值，并根据检测ct值进行相对丰度分析，得到分析结果用于辅助结直肠癌筛查。
23.本发明示出的辅助结直肠癌筛查的组合物及应用，具有高度的特异性和敏感度，检测结果稳定，在示例样本中检测灵敏度平均可达95.2％，特异性平均可达84.2％，具有较高的临床参考价值。
24.本发明的有益效果在于：
25.本发明首次证实了四种肠道微生物菌种厌氧消化链球菌、双歧杆菌属、粪肠球菌、具核梭杆菌在结直肠息肉、结直肠腺瘤及结直肠癌人群及健康人群粪便标本中的客观差异存在，能够为结直肠癌筛查提供新的辅助筛查工具。
26.本发明示出的技术方案具有较高的准确率，能提高人群结直肠癌筛查意愿，在结
直肠癌早诊早治中起到重大作用。
附图说明
27.图1为本发明的结直肠癌筛查标志物组合及应用步骤图。
28.图2为本发明结直肠息肉(crp)和健康(hs)人群厌氧消化链球菌(pa)、双歧杆菌属(bif)、粪肠球菌(ef)检测结果的相对丰度示意图。
29.图3为本发明结直肠腺瘤(cra)和健康(hs)人群厌氧消化链球菌(pa)、双歧杆菌属(bif)、粪肠球菌(ef)检测结果的相对丰度。
30.图4为本发明结直肠癌(crc)和健康(hs)人群双歧杆菌属(bif)、具核梭杆菌(fn)、粪肠球菌(ef)检测结果的相对丰度示意图。
具体实施方式
31.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
32.本发明所设计的是一种基于肠道微生态的结直肠癌筛查标志物组合，该标志物组合通过对粪便样本dna进行微生物标志物及16s rdna检测，旨在采用无创的方法，通过肠道微生物来辅助结肠癌筛查，增加肠癌筛查方式，提高肠癌筛查意愿。
33.所述标志物为厌氧消化链球菌、双歧杆菌属、粪肠球菌、具核梭杆菌及16s rdna，微生物标志物的检测主要采用对保守序列进行检测的特异性引物，其相关信息如表1所示：
34.[0035][0036]
表1微生物标志物的特异性引物
[0037]
基于肠道微生态的结直肠癌筛查应用，其实验方法如图1所示。
[0038]
1)人群样本：
[0039]
从2017.05-2019.01招募了51例结直肠息肉、47例结直肠腺瘤、30例结直肠癌及54例健康人，所有入组的患者签署知情同意书。结直肠息肉、结直肠腺瘤及结直肠癌均为活体组织经病理学确认结果，健康人为常规体检正常且肠镜排除肠道病变的人群。
[0040]
2)采集所述结直肠息肉、结直肠腺瘤及结直肠癌人群的粪便样本和健康人群的新鲜粪便样本。
[0041]
粪便样品采集方法为：
[0042]
获取所述人群的新鲜粪便样本，取花生粒大小的中段、内层粪便样本到粪便常温保存管中，并颠倒混匀数次，使粪便样品与常温保存液充分混匀接触。
[0043]
3)采用粪便基因组dna提取试剂盒对所述粪便样本进行粪便基因组dna的提取，测定所述粪便基因组dna的浓度和纯度，采用琼脂糖凝胶电泳法对所述粪便基因组dna进行质量检测。
[0044]
所述粪便基因组dna的提取方法为：
[0045]
将常温储存的粪便样本充分涡旋混匀，移液器吸取约500微升；采用粪便基因组dna提取试剂盒对所述粪便基因组dna进行提取，所述试剂盒为(qiagen，51604，germany)；所述测定所述粪便基因组dna的浓度和纯度的仪器采用nano drop 2000超微量分光光度计，所述琼脂糖凝胶浓度为1％；
[0046]
4)将所述粪便基因组dna稀释至1ng/μl，保存于负20摄氏度冰箱备用。
[0047]
5)对所述粪便基因组dna进行微生物标志物的sybr染料法实时荧光定量pcr检测，测定微生物标志物含量，所述微生物标志物为厌氧消化链球菌、双歧杆菌属、粪肠球菌、具核梭杆菌及16s rdna的保守序列；根据所述微生物标志物含量得到四种微生物菌种及16s rdna的检测ct值。
[0048]
所述四种微生物菌种及16s rdna应用sybr染料法实时荧光定量pcr检测的步骤为：
[0049]
对提取且稀释好的粪便基因组dna进行实时荧光定量pcr反应体系配制，所述配制体系为：2.0ul dna，0.5ul表1中上游引物，0.5ul表1中下游引物，10.0ul实时荧光定量pcr反应mix，7.0μl无菌去离子水，总体积20.0μl。
[0050]
进行pcr扩增，所述扩增条件为：50℃孵育2min；95℃预变性3min、95℃变性10sec、60℃退火延伸30sec，共进行40个反应循环；并进行溶解曲线采集。
[0051]
查看溶解曲线，验证pcr产物是否为单一特异性扩增条带，同时获得四种微生物菌种及16s rdna的检测ct值。
[0052]
所述ct值为指每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。
[0053]
所述四种微生物菌种的检测ct值大于16s rdna的检测ct值。
[0054]
所述四种微生物菌种及16s rdna的检测，对应阴性质控的检测ct值＞35.0或为undetermined。
[0055]
所述阴性质控为不加入粪便样本基因组dna的反应体系检测结果。
[0056]
6)根据所述四种微生物菌种及16s rdna的检测ct值进行相对丰度分析；
[0057]
所述四种微生物菌种及16s rdna的检测ct值进行相对丰度分析的方法为：
[0058]
检测样本的四种微生物菌种的检测ct值减去16s rdna检测ct值，得到
△
ct值；
[0059]
求得健康对照组样本的
△
ct值的平均值mean
△
ct值；
[0060]
各检测样本的
△
ct值减去mean
△
ct值，得到各检测样本的
△△
ct值；
[0061]
用上述
△△
ct值，求得各检测样品的2^(
‑△△
ct值)，即为各检测样品的相对丰度；
[0062]
7)根据所述四种微生物菌种的相对丰度进行结直肠癌的辅助筛查与诊断：
[0063]
所述辅助诊断依据如表2所示：
[0064][0065]
表2辅助诊断依据
[0066]
参阅图2，图2为一可行性实施例中厌氧消化链球菌(pa)、双歧杆菌属(bif)和粪肠球菌(ef)应用sybr染料法实时荧光定量pcr在54例健康(hs)人群及51例结直肠息肉(crp)人群中的检测结果；相对于54例健康人群粪便标本，厌氧消化链球菌和双歧杆菌属在51例结直肠息肉人群粪便中相对丰度上调，粪肠球菌在51例结直肠息肉人群粪便中相对丰度下调。经计算，能有效区分出患有结直肠息肉人群的相对丰度为：厌氧消化链球菌》＝4.352、双歧杆菌属》＝3.364、粪肠球菌《＝0.051。该检测灵敏度可达93.75％，特异性可达84.21％。
[0067]
参阅图3，图3为一可行性实施例中厌氧消化链球菌(pa)、双歧杆菌属(bif)和粪肠球菌(ef)应用sybr染料法实时荧光定量pcr在54例健康(hs)人群及47例结直肠腺瘤(cra)人群中的检测结果；相对于54例健康人群粪便标本，厌氧消化链球菌和双歧杆菌属在47例结直肠腺瘤人群粪便中相对丰度上调，粪肠球菌在47例结直肠腺瘤人群粪便中相对丰度下调。经计算，能有效区分出患有结直肠腺瘤人群的相对丰度为：厌氧消化链球菌》＝3.986、双歧杆菌属》＝7.504、粪肠球菌《＝0.051。该检测灵敏度可达92.96％，特异性可达86.84％。
[0068]
参阅图4，图4为一可行性实施例中双歧杆菌属(bif)、具核梭杆菌(fn)和粪肠球菌(ef)应用sybr染料法实时荧光定量pcr在54例健康(hs)人群及30例结直肠癌(crc)人群中的检测结果；相对于54例健康人群粪便标本，双歧杆菌属和具核梭杆菌在30例结直肠癌人群粪便中相对丰度上调，粪肠球菌在xx例结直肠癌人群粪便中相对丰度下调。经计算，能有效区分患有结直肠癌人群的相对丰度为：双歧杆菌属》＝13.359、具核梭杆菌》＝4.247、粪肠球菌《＝0.028。该检测灵敏度可达95.23％，特异性可达76.32％。
[0069]
上述实施例结果表明，厌氧消化链球菌、双歧杆菌属、粪肠球菌、具核梭杆菌在健康人群和结直肠息肉、结直肠腺瘤、结直肠癌人群粪便中相对丰度存在差异。厌氧消化链球菌、双歧杆菌属在结直肠息肉人群中相对丰度较高，粪肠球菌在结直肠息肉人群中相对丰度较低；厌氧消化链球菌、双歧杆菌属在结直肠腺瘤人群中相对丰度较高，粪肠球菌在结直肠腺瘤人群中相对丰度较低；双歧杆菌属和具核梭杆菌在结直肠癌人群中相对丰度较高，粪肠球菌在结直肠息肉人群中相对丰度较低。因此，厌氧消化链球菌、双歧杆菌属、粪肠球菌、具核梭杆菌能够用于辅助结直肠癌的筛查。
[0070]
以上仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。