重组菌株及其在利用甲酸或其衍生物中的应用和方法

bmfalddh连接、转化，得到质粒ptrc99a-bmfalddh-hps+phi；
10.3)将步骤2)得到的质粒ptrc99a-bmfalddh-hps+phi转化进大肠杆菌e.coli mg1655，得到所述重组菌株。
11.优选地，所述步骤1)中，采用如seq id no.1所示的引物bmfalddh
–
f和如seq id no.2所示的引物bmfalddh-r扩增得到所述bmfalddh基因，用于与所述ptrc99a质粒连接、转化，得到所述质粒ptrc99a-bmfalddh。
12.优选地，所述步骤1)中，采用如seq id no.3所示的引物ptrc99a-f和如seq id no.4所示的引物ptrc99a-r扩增得到所述ptrc99a质粒，用于与所述bmfalddh基因连接、转化，得到所述质粒ptrc99a-bmfalddh。
13.优选地，所述步骤2)中，采用如seq id no.5所示的引物hps+phi-f和如seq id no.6所示的引物hps+phi-r扩增得到所述hps+phi基因，用于与所述质粒ptrc99a-bmfalddh连接、转化，得到所述质粒ptrc99a-bmfalddh-hps+phi。
14.优选地，所述步骤2)中，采用如seq id no.7所示的引物ptrc99a-f-1和如seq id no.8所示的引物ptrc99a-r-1扩增得到所述ptrc99a-bmfalddh质粒，用于与所述hps+phi基因连接、转化，得到所述质粒ptrc99a-bmfalddh-hps+phi。
15.优选地，所述步骤3)中，采用热激转化法将所述质粒ptrc99a-bmfalddh-hps+phi转化进所述大肠杆菌e.coli mg1655。
16.优选地，以gibson无缝连接的方式进行所述bmfalddh基因与所述ptrc99a质粒的连接。
17.优选地，以gibson无缝连接的方式进行所述hps+phi基因与所述质粒ptrc99a-bmfalddh的连接。
18.本发明解决其技术问题所采用的技术方案之二是：
19.一种上述的重组菌株在利用甲酸或其衍生物中的应用。
20.本发明解决其技术问题所采用的技术方案之三是：
21.一种利用上述的重组菌株同化甲酸或其衍生物的方法，将所述重组菌株接种于含有氨苄青霉素抗性lb培养基中，在36～38℃进行多级扩大培养得到菌液，加入诱导剂并在28～32℃进行诱导培养，随后与甲酸或其衍生物混合，所述重组菌株以甲酸或其衍生物为碳源进行生长代谢，实现对甲酸或其衍生物的同化。
22.本发明所述的利用甲酸或其衍生物，指的是该重组菌株能同化甲酸或其衍生物，即能够以甲酸或其衍生物为碳源进行生长代谢。具体地，所述重组菌株在利用甲酸或其衍生物中的应用例如为分解甲酸或其衍生物，或者利用甲酸或其衍生物制备甲醇、乙醇、甲醛、甘氨酸、丝氨酸、丙酮酸等物质，但并不以此为限。
23.具体地，本发明所述的甲酸的衍生物为甲酸盐。
24.本发明的一个优选的实施例示例如下：
25.1.构建ptrc99a-bmfalddh-hps+phi重组质粒并转化进入e.coli mg1655：
26.通过基因合成服务合成目的基因，经过pcr技术，采用相应的引物：引物bmfalddh-f(如seq id no.1所示)和引物bmfalddh-r(如seq id no.2所示)，引物ptrc99a-f(如seq id no.3所示)和引物ptrc99a-r(如seq id no.4所示)，利用高保真酶，以目的基因bmfalddh和ptrc99a质粒为模板扩增得到bmfalddh基因和ptrc99a骨架，然后通过gibson无
缝连接的方式将bmfalddh基因片段和载体骨架片段ptrc99a进行连接，连接产物转化大肠杆菌t1细胞，涂板，过夜培养，选取具有氨苄青霉素抗性的阳性菌株扩大培养，采用质粒小提试剂盒得到重组质粒ptrc99a-bmfalddh(质粒图谱如图1)。采用42℃热激法将得到的ptrc99a-bmfalddh质粒转化大肠杆菌感受态细胞e.coli mg1655，提取质粒测序验证。
27.再采用引物hps+phi-f(如seq id no.5所示)和引物hps+phi-r(如seq id no.6所示)，引物ptrc99a-f-1(如seq id no.7所示)和引物ptrc99a-r-1(如seq id no.8所示)，利用高保真酶，通过pcr扩增得到hps+phi基因和ptrc99a-bmfalddh载体骨架。然后再以gibson无缝连接的方式将hps+phi基因片段和载体骨架片段ptrc99a进行连接，同上方法进行转化测序，得到重组质粒ptrc99a-bmfalddh-hps+phi(质粒图谱如图2)。
28.(seq id no.1)bmfalddh-f：agaccatggaattcaggaggatgagcagcaatcgtggtgt
29.(seq id no.2)bmfalddh-r：gatccccgggtaccgagctcttaggcggccagcaggccat
30.(seq id no.3)ptrc99a-f：atggcctgctggccgcctaagagctcggtacccggggatc
31.(seq id no.4)ptrc99a-r：acaccacgattgctgctcatcctcctgaattccatggtct
32.(seq id no.5)hps+phi-f：aggaggaattaaccaggaggatggaactgcagctggcact
33.(seq id no.6)hps+phi-r：ttgcatgcctgcaggtcgacttattccagattggcatgac
34.(seq id no.7)ptrc99a-f-1：gtcatgccaatctggaataagtcgacctgcaggcatgcaa
35.(seq id no.8)ptrc99a-r-1：agtgccagctgcagttccatcctcctggttaattcctcct
36.(seq id no.9)甲酸脱氢酶(bmfalddh)基因：
37.atgagcagcaatcgtggtgttgtgtatctgggtccgggtaaagttgaagtgcagaaaattgattatccgaaaatggtggaccctagtggtcgcgcaattggccatggtgttattctgaaagtggtgagtaccaatatttgcggtagtgatcagcacatggtgcgcggccgcaccaccgcacctgtgggtttagtgctgggccatgaaattaccggtgaagtggttgaagtgggtcgtgatgttgaaaccctgaaaattggtgatctggttagtgttccgtttaatgtggcctgcggtcgctgcgcaatgtgcaaagaaacccataccggcgtgtgcctgaatgtgaatccgagtcgcgcaggtggtgcctatggctatgttgatatgggcggttggattggcggccaggcagaatatgttctggtgccgtatgccgattttaatctgctgaaatttccggatcgtgatcaggccatggccaaaattcgcgatctgacctgtctgagtgatattctgccgaccggctatcatggcgcagtgagcgcaggtgtgaaaccgggcagcaccgtgtatattgcaggcgcaggtccggttggtatggcagcagccgcaagtgcacgcctgctgggtgcagcagttaccattgtgggcgatatgaatgcagaacgtctggcccatgcaaaagcaatgggctttgaaaccgtggatctgagcaaagatgccaccctgggtgaacagattgcacagattctgggcaaaccggaaattgattgcgccgttgattgtgttggctttgaagcacatggtcatggtagcagcggccatgccgaagaagcacctgcaaccgttctgaatagtctgatggaaattacccgtccggccggcgcaattggtattccgggtctgtatgtgaccgatgatccgggtgcccaggataaagccgcacagcatggtagcctgagtattcgctttggtctgggctgggccaaaagtcatagcttttttaccggccagacacctgtgctgaaatataatcgtaatctgatgcaggcaattctgtatgatcgtctgccgattgccaaaattgtgaatgttaccgtgattagtctggatgatgcaccggaaggctataaaaaatttgatggcggtgcaccgcgtaaatttgtgattgatccgcatggcctgctggccgcctaa
38.(seq id no.10)3-己酮糖-6-磷酸合酶+6-磷酸-3-己酮糖异构酶(hps+phi)基因：
39.atggaactgcagctggcactggatctggtgaatattgaagaagcaaaacaggttgtggccgaagtgcaggaatatgtggatattgttgaaattggcacacctgtgattaaaatttggggcctgcaggccgttaaagccgttaaagatgcatttccgcatctgcaggtgctggcagatatgaaaaccatggatgcagcagcatacgaagttgcaaaagccgcagaacatggtgccgatattgttaccattctggcagccgccgaagatgtgagtattaaaggtgcagtggaagaagcaaag
aaactgggcaaaaaaattctggtggatatgattgccgttaaaaatctggaagaacgtgcaaaacaggtggatgaaatgggtgttgattatatttgtgtgcatgccggttatgatctgcaggcagtgggcaaaaatccgctggatgatctgaaacgcattaaagccgtggttaaaaatgcaaaaaccgccattgccggtggtattaaactggaaaccctgccggaagttattaaagccgaaccggatctggttattgtgggcggtggtattgcaaatcagaccgataaaaaagccgcagcagaaaaaattaataagctggttaaacagggcctgtaaaaggagatgattagcatgctgaccaccgaatttctggcagaaattgtgaaagaactgaatagcagcgtgaatcagattgccgatgaagaagcagaagcactggttaatggtattctgcagagtaaaaaagtgtttgttgcaggtgccggtcgtagcggctttatggccaaaagttttgcaatgcgtatgatgcacatgggtattgatgcatacgttgttggcgaaaccgtgacacctaattatgaaaaagaagatattctgatcatcggcagcggtagcggcgaaaccaaaagcctggtgagtatggcccagaaagcaaaaagcattggtggcaccattgccgccgtgaccattaatccggaaagcaccattggccagctggccgatattgtgattaaaatgccgggtagcccgaaagataaaagtgaagcccgcgaaaccattcagccgatgggtagtctgtttgaacagaccctgctgctgttttatgatgcagttattctgcgctttatggaaaaaaaaggtctggataccaaaaccatgtatggccgtcatgccaatctggaataa
40.2.ptrc99a-bmfalddh-hps+phi转化进大肠杆菌e.coli mg1655：
41.采用氯化钙法制备化学感受态的大肠杆菌，使用42℃热激转化的方式将重组质粒ptrc99a-bmfalddh-hps+phi转化至化学感受态的大肠杆菌，涂布于含有氨苄青霉素抗性的lb平板，过夜培养，筛选阳性菌株扩大培养，将生长的克隆子挑选至含有氨苄青霉素抗性lb液体培养基中扩大培养，取4ml菌液用质粒小提试剂(tiangen)提取阳性克隆质粒，测序验证。
42.3.改造的大肠杆菌工程菌株发酵培养及甲酸利用情况分析
43.将上述基因重组大肠杆菌在筛选培养基中进行筛选培养，选取长势良好的菌落得到筛选菌株；将获得的筛选菌株在含有氨苄青霉素抗性lb培养基中，扩大培养，得到种子液；将种子液中按一定的接种量接种至含有氨苄青霉素抗性lb培养基中再次进行扩大培养，获得扩大菌液，向扩大菌液中加入诱导剂，诱导培养，再向发酵液中加入甲酸，根据发酵液中甲酸终浓度的不同，选择不同的间隔进行取样检测。
44.本发明所涉及的设备、试剂、工艺、参数等，除有特别说明外，均为常规设备、试剂、工艺、参数等，不再作实施例。
45.本发明所列举的所有范围包括该范围内的所有点值。
46.本技术方案与

背景技术：
相比，它具有如下优点：
47.1.本发明以ptrc99a为过表达载体，在e.coli胞内重组表达来自多噬伯克霍尔德氏菌基因组中的甲醛脱氢酶(bmfalddh)基因、来自鞭毛甲基小杆菌基因组中的3-己酮糖-6-磷酸合酶(hps)基因以及来自鞭毛甲基小杆菌基因组中的6-磷酸-3-己酮糖异构酶(phi)基因，实现对甲酸或甲酸盐的同化；
48.2.本发明通过对三种外源基因的高效表达，强化了核酮糖单磷酸(rump)循环途径，实现了工程化菌株对甲酸或甲酸盐的高效利用。
附图说明
49.图1为本发明实施例的ptrc99a-bmfalddh质粒构建图谱。
50.图2为本发明实施例的ptrc99a-bmfalddh-hps+phi质粒构建图谱。
51.图3为本发明实施例中甲酸终浓度为2g/l时重组菌株利用甲酸实验结果。
具体实施方式
52.下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
53.实施例1：
54.构建能够有效利用甲酸的能力的基因工程化大肠杆菌菌株，具体操作步骤如下：
55.1.ptrc99a-bmfalddh载体的构建：
56.通过商业化基因合成服务合成目的基因。将合成的目的基因bmfalddh，采用引物bmfalddh
–
f(如seq id no.1所示)和引物bmfalddh-r(如seq id no.2所示)，通过在pcr体系中加入高保真酶，经过扩增得到bmfalddh基因(如seq id no.9所示)。将ptrc99a质粒载体，采用引物ptrc99a-f(如seq id no.3所示)和引物ptrc99a-r(如seq id no.4所示)，高保真酶，进行pcr扩增得到ptrc99a质粒载体，pcr的条件为：95℃预变性5min，95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min，30个循环。
57.使用琼脂糖凝胶回收试剂盒(购自omega公司)将pcr得到的bmfalddh基因、ptrc99a质粒载体切胶回收，用gibson酶连接法进行连接，连接条件：37℃，1h。将连接产物通过42℃热激法转化进入t1感受态细胞，首先将t1感受态细胞放置于冰上，将连接产物取10μl冰浴10min，放置于42℃水浴锅中热激90s，再次冰浴2min，加入600μl无抗lb液体培养基，放置在37℃、150r/min振荡培养60min后5000r/min离心5min，弃400μl上清液，重新吹打混匀，吸取100μl涂布到含氨苄青霉素抗性lb平板上，过夜培养，筛选阳性菌株扩大培养，将生长的克隆子挑选至含有氨苄青霉素抗性lb液体培养基中扩大培养，取4ml菌液用质粒小提试剂(tiangen)提取阳性克隆质粒ptrc99a-bmfalddh，保存于4℃冰箱备用。
58.2.ptrc99a-bmfalddh-hps+phi载体的构建：
59.通过商业化基因合成服务合成目的基因。将合成的目的基因组dna，采用引物hps+phi-f(如seq id no.5所示)和引物hps+phi-r(如seq id no.6所示)，通过在pcr体系中加入高保真酶，经过扩增得到hps+phi基因(如seq id no.10所示)，将之前构造好的ptrc99a-bmfalddh质粒载体，采用引物ptrc99a-f-1(如seq id no.7所示)和引物ptrc99a-r-1(如seq id no.8所示)，高保真酶，进行pcr扩增得到ptrc99a-bmfalddh质粒载体，pcr的条件为：95℃预变性5min，95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min，30个循环。
60.使用琼脂糖凝胶回收试剂盒(购自omega公司)将pcr得到的hps+phi基因、ptrc99a-bmfalddh质粒载体切胶回收，用gibson酶连接法进行连接，连接条件：37℃，1h。将连接产物通过42℃热激法转化进入t1感受态细胞，涂布于含有氨苄青霉素抗性的lb平板，过夜培养，筛选阳性菌株扩大培养，将生长的克隆子挑选至含有氨苄青霉素抗性lb液体培养基中扩大培养，取4ml菌液用质粒小提试剂(tiangen)提取阳性克隆质粒ptrc99a-bmfalddh-hps+phi，保存于4℃冰箱备用。
61.3.ptrc99a-bmfalddh-hps+phi转化进大肠杆菌e.coli mg1655：
62.将氯化钙法制备化学感受态的大肠杆菌放置于冰上，将保存于4℃冰箱备用的ptrc99a-bmfalddh-hps+phi质粒取0.5μl冰浴10min，放置于42℃水浴锅中热激90s，再次冰浴2min，加入600μl无抗lb液体培养基，放置在37℃、150r/min振荡培养60min后5000r/min离心5min，弃400μl上清液，重新吹打混匀，吸取100μl涂布到含氨苄青霉素抗性lb平板上，过夜培养，筛选阳性菌株扩大培养，将生长的克隆子挑选至5ml含有氨苄青霉素抗性lb液体培养基中扩大培养，取4ml菌液用质粒小提试剂(tiangen)提取阳性克隆质粒，测序验证。
63.4.改造的大肠杆菌工程菌株发酵培养及甲酸利用情况分析
64.将上述基因重组大肠杆菌在筛选培养基中进行筛选培养，选取长势良好的菌落得到筛选菌株；将获得的筛选菌株在3ml含有氨苄青霉素抗性lb培养基中，在温度为37℃、转速220r/min的条件下扩大培养12小时，得到种子液；将种子液中按一定的接种量接种至50ml含有氨苄青霉素抗性lb培养基中进行扩大培养，获得扩大菌液，在菌种od
600
等于0.5～0.6区间时(od
600
表示溶液在600nm波长处的吸光值)，向扩大菌液中加入诱导剂，在温度为30℃、转速150r/min的条件下诱导培养12h，再向发酵液中加入甲酸，根据发酵液中甲酸终浓度的不同，选择不同的间隔进行取样检测；
65.经过hplc检测结果显示，改造过的重组菌株在2小时之内能够将浓度为1g/l的甲酸完全利用；当发酵液中甲酸终浓度为2g/l时，没有经过改造的e.coli几乎不能同化甲酸或甲酸盐，而重组菌能够快速将甲酸或甲酸盐利用并完全同化。甲酸终浓度为2g/l实验结果如图3。
66.以上所述，仅为本发明较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。