特异性结合il-23的纳米抗体及其用途
技术领域：
：1.本发明涉及免疫学领域，具体而言，本发明涉及经亲和力成熟的抗il-23的纳米抗体或其抗原结合片段，编码它们的核酸分子、载体及宿主细胞，所述纳米抗体或其抗原结合片段的衍生物，以及它们用于疾病治疗的用途。技术背景2.炎症性肠病(inflammatoryboweldisease,ibd)是一种以肠道炎症为特征的慢性复发性疾病，ibd具有渐进性和破坏性，可导致包括狭窄、脓肿、瘘管、肠外表现、结肠炎相关肿瘤和癌等的各种并发症，在临床上常见为克罗恩病(crohn’sdisease,cd)、溃疡性结肠炎(ulcerativecolitis,uc)。ibd是一种终生疾病，是全球发病率显著的主要医疗负担。20世纪下半叶，ibd的发病率和患病率显著上升，进入21世纪以来，ibd一直被认为是新兴工业化国家发病率最高、发病率最高的胃肠道疾病之一。尽管尚不清楚ibd的发病因素，但近年来越来越多的遗传、临床和实验研究表明，ibd是一种多因素疾病，其发病机制与宿主的遗传易感性、肠道微生物群、其他环境因素和免疫异常有关。3.已有研究表明il-23是多种炎性疾病或自身免疫性疾病的病程发展中的关键促炎细胞因子。il-23是oppmann等人于2000年发现的il-12细胞因子家族的新成员，它是由一个没有生物活性的p19亚基和与il-12共有的p40亚基通过二硫键连接的异源二聚体。il-23主要由树突细胞、吞噬细胞、小胶质细胞等抗原呈递细胞产生，并作用于记忆性t细胞。4.il-23有两个受体：il-12rβ1和il-23r，其中il-12rβ1主要与p40亚基相结合，il-23r主要和p19亚基结合。il-12rβ1可以激活酪氨酸蛋白激酶(tyk2)，而il-23r能激活蛋白酪氨酸激酶(jak2)，il-23与受体结合后可以导致下游jaks分子的激活，并磷酸化受体胞内区的stat结合位点，stat分子以二聚体的形式聚集，再由jaks将其磷酸化，磷酸化的stats二聚体入核，作用于下游的靶基因，诱导包括il-17a、il-22、ifn-γ、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)等在内的细胞因子表达，这些过表达的细胞因子可以将th17细胞反应转变成致病模式，且这些细胞因子又可以进一步引起il-23的过表达，造成肠道严重的炎症反应。5.虽然目前已有靶向il-23的单克隆抗体上市，例如乌司奴单抗(ustekinumab)、skyriz、特诺雅(guselkumab)等，然而传统单克隆抗体分子量大，难以渗透进入组织间，到底有效部位剂量小，不适用于治疗炎症性肠病。并且单抗的生产周期长、人源化比较困难，因此，寻找具有更小分子量的抗体比较重要。6.纳米抗体(nanobody)又称为单域抗体(sdab)，是从骆驼科动物或鲨鱼的血清中分离出的一种抗体，单域抗体仅由重链构成，具有分子量小，稳定性好等特点。2017年desmyter等人筛选得到针对hil-23的p19亚基的纳米抗体37d5(alined,silvias,carlob,etal..frontimmunol,2017,8:884.)。然而，中和型抗体在应用于靶向治疗时，通常需要优化抗体，使其结合亲和力增强来减少注射剂量，以此来限制不良反应和减低治疗成本。技术实现要素：7.抗体通常需要经历一个或多个亲和力成熟周期来提高亲和力，这使得传统的亲和力成熟办法显得捉襟见肘。本技术的发明人利用计算机辅助的体外亲和力成熟技术，在纳米抗体37d5的基础上进一步获得了对hil-23亲和力提高的纳米抗体突变体，与亲本抗体相比其不仅具备更高的亲和力，还具备更优的中和活性，由此完成了以下发明。8.纳米抗体9.在一个方面，本发明提供了特异性结合il-23(例如il-23的p19亚基)的纳米抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区(vhh)中所包含的cdr1、cdr2和cdr3，所述vhh与seqidno:1所示的序列相比包含选自y108w、y31w、t28d中的一个或多个(例如1个、2个或3个)氨基酸置换。10.本文中所述的纳米抗体通常包括由4个构架区(frs)和3个互补决定区(cdrs)组成的vhh，称为fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3及fr4，所述抗原结合片段包含该纳米抗体的至少一部分，该部分足以赋予该片段特异性结合il-23(例如il-23的p19亚基)的能力。在一些实施方案中，本发明所述的纳米抗体可在n端或c端处截短以使其仅包含部分fr1和/或fr4，或缺少那些骨架区中的一个或两个，只要其实质上保持抗原结合和特异性即可。11.在某些实施方案中，所述vhh中所包含的cdr1、cdr2和cdr3通过imgt编号系统确定。12.在某些实施方案中，所述纳米抗体或其抗原结合片段包含：13.如gfx1ldx2la(seqidno:17)所示的cdr1，其中，x1选自t或d，x2选自y或w；14.如seqidno:14所示的cdr2；以及15.如atdpecyrvrgx3yngeydy(seqidno:18)所示的cdr3；其中，x3选自y或w。16.在某些实施方案中，所述纳米抗体或其抗原结合片段不包含下述cdr区：seqidno:11所示的cdr1、seqidno:14所示的cdr2、以及seqidno:15所示的cdr3；17.在某些实施方案中，所述vhh与seqidno:1所示的序列相比包含(i)y108w和/或y31w、或(ii)t28d。18.在某些实施方案中，所述纳米抗体或其抗原结合片段包含：19.(1)seqidno:13所示的cdr1、seqidno:14所示的cdr2、以及seqidno:16所示的cdr3；20.(2)seqidno:11所示的cdr1、seqidno:14所示的cdr2、以及seqidno:16所示的cdr3；21.(3)seqidno:13所示的cdr1、seqidno:14所示的cdr2、以及seqidno:15所示的cdr3；或，22.(4)seqidno:12所示的cdr1、seqidno:14所示的cdr2、以及seqidno:15所示的cdr3。23.在某些实施方案中，所述纳米抗体或其抗原结合片段进一步包含源自人免疫球蛋白的重链框架区(例如，人重链胚系抗体基因所编码的氨基酸序列中所包含的重链框架区)，所述重链框架区任选地包含一个或多个(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个)从人源残基至驼源残基的回复突变。24.在某些实施方案中，所述纳米抗体或其抗原结合片段进一步包含源自驼源重链抗体的框架区。25.在某些实施方案中，所述纳米抗体或其抗原结合片段包含：seqidno:19所示的fr1、seqidno:20所示的fr2、seqidno:21所示的fr3、以及seqidno:22所示的fr4。26.在某些实施方案中，所述纳米抗体或其抗原结合片段包含seqidnos:9、7、5、3任一项所示的序列。此处所示序列在其n端不包含起始密码子(如atg)编码的氨基酸(如甲硫氨酸(met))。本领域技术人员理解，在通过基因工程制备蛋白的过程中，由于起始密码子的作用，所产生的多肽链第一位经常为起始密码子编码的氨基酸(如met)。本发明的纳米抗体或其抗原结合片段不仅囊括在其n末端不包含起始密码子编码的氨基酸(如met)的氨基酸序列，也囊括在其n末端包含起始密码子编码的氨基酸(如met)的氨基酸序列。因此，在上述氨基酸序列的n端进一步包含起始密码子编码的氨基酸(如met)的序列也在本发明的保护范围内。27.在本发明中，本发明的纳米抗体或其抗原结合片段可以包括这样的变体，所述变体与其所源自的纳米抗体或其抗原结合片段相比差异仅在于一个或多个(例如，至多20个、至多15个、至多10个、或至多5个氨基酸的保守置换)氨基酸残基的保守置换，或者与其所源自的抗体或其抗原结合片段具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性，且基本保留了其所源自的纳米抗体或其抗原结合片段的生物学功能(例如特异性结合il-23，中和il-23的生物活性)。28.双特异性或多特异性抗体29.另一方面，本发明提供了一种双特异性或多特异性抗体，其包含本发明的纳米抗体或其抗原结合片段。为产生所述双特异性或多特异性抗体，可以将本发明的纳米抗体或其抗原结合片段连接(例如通过化学偶联、基因融合、非共价缔合或其他方式)至一个或多个其他结合分子(例如另外的抗体、抗体片段、肽或结合模拟物)。30.在某些实施方案中，所述双特异性或多特异性抗体特异性结合il-23，并且额外地特异性结合一个或多个其他靶标。31.在某些实施方案中，所述双特异性或多特异性抗体还包含至少一种具有针对第二靶标的第二结合特异性的第二抗体。32.抗体的制备33.本发明的抗体可以本领域已知的各种方法来制备，例如通过基因工程重组技术来获得。例如，通过化学合成或pcr扩增获得编码本发明抗体的dna分子，将所得dna分子插入表达载体内，然后转染宿主细胞。然后，在特定条件下培养转染后的宿主细胞，并表达本发明的抗体。本发明的抗原结合片段可以通过水解完整的抗体分子获得。34.另一方面，本发明提供了一种分离的核酸分子，其编码本发明的纳米抗体或其抗原结合片段或本发明的双特异性或多特异性抗体。在某些实施方案中，所述分离的核酸分子包含seqidno:4,6,8,10任一项所示的序列或由遗传密码的简并性形成的与上述序列相关的dna序列。35.另一方面，本发明提供了一种载体(例如克隆载体或表达载体)，其包含本发明的分离的核酸分子。在某些实施方案中，本发明的载体是例如质粒，粘粒，噬菌体等。36.另一方面，本发明提供了一种宿主细胞，其包含如上所述的分离的核酸分子或载体。此类宿主细胞包括但不限于，原核细胞例如大肠杆菌细胞，以及真核细胞例如酵母细胞，昆虫细胞，植物细胞和动物细胞(如哺乳动物细胞，例如小鼠细胞、人细胞等)。37.另一方面，提供了制备本发明的纳米抗体或其抗原结合片段或双特异性或多特异性抗体的方法，其包括，在允许蛋白表达的条件下，培养如上所述的宿主细胞，和从培养的宿主细胞培养物中回收所述抗体或其抗原结合片段或双特异性或多特异性抗体。38.缀合物39.另一方面，本发明还提供了缀合物，其本发明的纳米抗体或其抗原结合片段或双特异性或多特异性抗体以及偶联部分。40.在某些实施方案中，本发明的纳米抗体或其抗原结合片段任选地通过接头与所述偶联部分缀合。41.在某些实施方案中，所述偶联部分选自蛋白标签(proteintag)。这类蛋白标签是本领域熟知的，其实例包括但不限于his、flag、gst、mbp、ha、myc、gfp或生物素，并且本领域技术人员已知如何根据期望目的(例如，纯化、检测或示踪)选择合适的蛋白标签。在某些示例性实施方案中，本发明的纳米抗体或其抗原结合片段的c端连接有his标签(例如6×his)。42.在某些实施方案中，所述偶联部分选自可检测的标记，例如酶(例如辣根过氧化物酶)、放射性核素、荧光染料、发光物质(如化学发光物质)或生物素。本发明所述的可检测的标记可以是可通过荧光、光谱、光化学、生物化学、免疫学、电学、光学或化学手段检测的任何物质。这类标记是本领域熟知的，其实例包括但不限于，酶(例如，辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、脲酶、葡萄糖氧化酶，等)、放射性核素(例如，3h、125i、35s、14c或32p)、荧光染料(例如，异硫氰酸荧光素(fitc)、荧光素、异硫氰酸四甲基罗丹明(tritc)、藻红蛋白(pe)、德克萨斯红、罗丹明、量子点或花菁染料衍生物(例如cy7、alexa750))、发光物质(例如化学发光物质，如吖啶酯类化合物)、磁珠(例如，)、测热标记物例如胶体金或有色玻璃或塑料(例如，聚苯乙烯、聚丙烯、乳胶，等)珠、以及用于结合上述标记物修饰的亲和素(例如，链霉亲和素)的生物素。在某些实施方案中，此类标记能够适用于免疫学检测(例如，酶联免疫测定法、放射免疫测定法、荧光免疫测定法、化学发光免疫测定法等)。在某些实施方案中，可通过不同长度的接头(linker)将如上所述的可检测的标记连接至本发明的纳米抗体或其抗原结合片段，以降低潜在的位阻。43.在某些实施方案中，所述偶联部分选自治疗剂，例如抗炎药物或免疫抑制剂。44.在某些实施方案中，所述偶联部分选自另外的生物活性多肽。45.药物组合物46.另一方面，本发明提供了一种药物组合物，其含有本发明所述的纳米抗体或其抗原结合片段、双特异性或多特异性抗体、分离的核酸分子、载体、宿主细胞、或缀合物，以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。47.在某些实施方案中，所述药物组合物还可以包含另外的药学活性剂。48.在某些实施方案中，所述另外的药学活性剂是抗炎药物或免疫抑制剂。49.在某些实施方案中，在所述药物组合物中，本发明的纳米抗体或其抗原结合片段、双特异性或多特异性抗体、分离的核酸分子、载体、宿主细胞、或缀合物与所述另外的药学活性剂可以作为分离的组分或作为混合的组分提供。因此，本发明的纳米抗体或其抗原结合片段、双特异性或多特异性抗体、分离的核酸分子、载体、宿主细胞、或缀合物与所述另外的药学活性剂可以同时、分开或相继施用。50.在某些实施方案中，所述药学上可接受的载体和/或赋形剂可以包含无菌可注射液体(如水性或非水性悬浮液或溶液)。在某些示例性实施方案中，此类无菌可注射液体选自注射用水(wfi)、抑菌性注射用水(bwfi)、氯化钠溶液(例如0.9％(w/v)nacl)、葡萄糖溶液(例如5％葡萄糖)、含有表面活性剂的溶液(例如0.01％聚山梨醇20)、ph缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲溶液)、ringer氏溶液及其任意组合。51.本发明的药物组合物可以包括“治疗有效量”或“预防有效量”的本发明所述的纳米抗体或其抗原结合片段、双特异性或多特异性抗体、分离的核酸分子、载体、宿主细胞、或缀合物。“预防有效量”是指，足以预防，阻止，或延迟疾病的发生的量。“治疗有效量”是指，足以治愈或至少部分阻止已患有疾病的患者的疾病和其并发症的量。治疗有效量可根据如下因素发生变化：待治疗的疾病的严重度、患者自己的免疫系统的总体状态、患者的一般情况例如年龄，体重和性别，药物的施用方式，以及同时施用的其他治疗等等。52.治疗应用53.另一方面，本发明提供了在受试者中预防和/治疗与il-23有关的疾病的方法，其包括向有此需要的受试者施用本发明的纳米抗体或其抗原结合片段、双特异性或多特异性抗体、分离的核酸分子、载体、宿主细胞、或缀合物或本发明的药物组合物。本发明还涉及所述纳米抗体或其抗原结合片段、双特异性或多特异性抗体、分离的核酸分子、载体、宿主细胞、或缀合物或药物组合物用于制备药物的用途，所述药物用于在受试者中预防和/治疗与il-23有关的疾病。54.在某些实施方案中，所述与il-23有关的疾病以il-23表达升高和/或过度的il-23活性为特征。55.在某些实施方案中，所述与il-23有关的疾病为炎性疾病或自身免疫性疾病。56.在某些实施方案中，所述与il-23有关的疾病为炎症性肠病、克罗恩病、溃疡性结肠炎、类风湿性关节炎、多发性硬化症、银屑病、系统性红斑狼疮、强直性脊椎炎、移植物抗宿主病。57.在某些实施方案中，所述受试者为哺乳动物，例如人。58.在某些实施方案中，所述纳米抗体或其抗原结合片段、双特异性或多特异性抗体、分离的核酸分子、载体、宿主细胞、或药物组合物单独使用，或与另外的药学活性剂(例如抗炎药物或免疫抑制剂)联合使用。59.本发明的纳米抗体或其抗原结合片段、双特异性或多特异性抗体、分离的核酸分子、载体、宿主细胞、或缀合物或本发明的药物组合物可以配制成医学领域已知的任何剂型，例如，片剂、丸剂、混悬剂、乳剂、溶液、凝胶剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、酏剂、锭剂、栓剂、注射剂(包括注射液、注射用无菌粉末与注射用浓溶液)、吸入剂、喷雾剂等。优选剂型取决于预期的给药方式和治疗用途。60.一种优选的剂型是注射剂。此类注射剂可以是无菌注射溶液。例如，可通过下述方法来制备无菌注射溶液：在适当的溶剂中掺入必需剂量的本发明的抗体或其抗原结合片段，以及任选地，同时掺入其他期望的成分(包括但不限于，ph调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂，等渗剂、防腐剂、稀释剂，或其任何组合)，随后过滤除菌。此外，可以将无菌注射溶液制备为无菌冻干粉剂(例如，通过真空干燥或冷冻干燥)以便于储存和使用。此类无菌冻干粉剂可在使用前分散于合适的载体中，例如注射用水(wfi)、抑菌性注射用水(bwfi)、氯化钠溶液(例如0.9％(w/v)nacl)、葡萄糖溶液(例如5％葡萄糖)、含有表面活性剂的溶液(例如0.01％聚山梨醇20)、ph缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲溶液)、ringer氏溶液及其任意组合。61.本发明的纳米抗体或其抗原结合片段、双特异性或多特异性抗体、分离的核酸分子、载体、宿主细胞、或缀合物或本发明的药物组合物可以通过本领域已知的任何合适的方法来施用，包括但不限于，口服、口腔、舌下、眼球、局部、肠胃外、直肠、叶鞘内、内胞浆网槽内、腹股沟、膀胱内、局部(如，粉剂、药膏或滴剂)，或鼻腔途径。但是，对于许多治疗用途而言，优选的给药途径/方式是胃肠外给药(例如静脉注射或推注，皮下注射，腹膜内注射，肌内注射)。技术人员应理解，给药途径和/或方式将根据预期目的而发生变化。在某些实施方案中，本发明的纳米抗体或其抗原结合片段、双特异性或多特异性抗体、分离的核酸分子、载体、宿主细胞、或缀合物或本发明的药物组合物通过静脉注射或推注给予。62.检测应用63.另一方面，本发明提供了检测il-23在样品中的存在或其量的方法，其包括使用本发明的纳米抗体或其抗原结合片段或缀合物。64.在某些实施方案中，所述方法是免疫学检测，例如免疫印迹法、酶免疫测定法(例如elisa)、化学发光免疫分析法、荧光免疫分析法或放射免疫测定法。65.在某些实施方案中，用于所述方法的缀合物包含本发明的纳米抗体或其抗原结合片段以及可检测的标记。66.在某些实施方案中，用于所述方法的纳米抗体或其抗原结合片段带有可检测的标记。67.在某些实施方案中，用于所述方法的纳米抗体或其抗原结合片段不带有可检测的标记。因此，所述方法还可以包括使用带有可检测的标记的其他试剂(如第二抗体)来检测本发明的纳米抗体或其抗原结合片段。68.在某些实施方案中，所述方法包括以下步骤：69.(1)将所述样品与本发明的纳米抗体或其抗原结合片段或缀合物接触；70.(2)检测所述纳米抗体或其抗原结合片段或缀合物与il-23之间复合物的形成或检测所述复合物的量。71.所述复合物的形成表明存在il-23或表达il-23的细胞。72.所述方法可以用于诊断目的，或者非诊断目的(例如，所述样品是细胞样品，而非来自患者的样品)。73.在某些实施方案中，所述方法用于诊断受试者是否患有与il-23有关的疾病。在此类实施方案中，所述方法还可以包括：将所述il-23在来自所述受试者的样品中的量与参考值进行比较的步骤。所述参考值可以是il-23在来自已知不具有与il-23有关的疾病的受试者(例如健康对照)的样品中的水平(也称作“阴性参考值”)。例如，如果il-23在来自所述受试者的样品中的量相对于阴性参考值升高时，则指示所述受试者患有与il-23有关的疾病。74.在某些实施方案中，所述与il-23有关的疾病以il-23表达升高和/或过度的il-23活性为特征。在某些实施方案中，所述与il-23有关的疾病为炎性疾病或自身免疫性疾病。在某些实施方案中，所述与il-23有关的疾病为炎症性肠病、克罗恩病、溃疡性结肠炎、类风湿性关节炎、多发性硬化症、银屑病、系统性红斑狼疮、强直性脊椎炎、移植物抗宿主病。75.在某些实施方案中，所述样品可以选自尿液、血液、血清、血浆、唾液、腹水、循环细胞、循环肿瘤细胞、非组织缔合的细胞(即游离细胞)、组织(例如手术切除的肿瘤组织、活体组织切片或细针抽吸组织)、组织学制备物等。76.在某些实施方案中，所述il-23是人il-23。77.另一方面，提供了本发明的纳米抗体或其抗原结合片段或缀合物在制备检测试剂中的用途，所述检测试剂用于检测il-23在样品中的存在或其水平或者用于诊断受试者是否患有与il-23有关的疾病。78.在某些实施方案中，用于制备检测试剂的缀合物包含本发明的纳米抗体或其抗原结合片段以及可检测的标记。79.在某些实施方案中，用于制备检测试剂的纳米抗体或其抗原结合片段带有可检测的标记。80.在某些实施方案中，用于制备检测试剂的纳米抗体或其抗原结合片段不带有可检测的标记。在此类实施方案中，所述检测试剂可以进一步包含能够检测本发明的纳米抗体或其抗原结合片段的其他试剂(如第二抗体)。81.术语定义82.在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的细胞培养、分子生物学、生物化学、核酸化学、免疫学等操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。83.当本文使用术语“例如”、“如”、“诸如”、“包括”、“包含”或其变体时，这些术语将不被认为是限制性术语，而将被解释为表示“但不限于”或“不限于”。84.除非本文另外指明或根据上下文明显矛盾，否则术语“一个”和“一种”以及“该”和类似指称物在描述本发明的上下文中(尤其在以下权利要求的上下文中)应被解释成覆盖单数和复数。85.如本文中所使用的，术语“驼源抗体”是指，经免疫接种或抗原入侵的骆驼科(camelidae)动物(包括骆驼(camel)、羊驼(alpaca)和大羊驼(l.glama))所产生的针对该抗原的抗体。本领域技术人员已知，在骆驼科动物所产生的抗体中存在缺失轻链的“重链抗体”(camelidheavy-chainantibody,hcab)，这种抗体只包含一个重链可变区(variabledomainofheavychainofhcab,vhh)和两个常规的ch2与ch3区，并且单独克隆并表达出来的vhh区具有很好的结构稳定性与抗原结合活性，vhh是目前己知的可结合目标抗原的最小单位。86.如本文中所使用的，术语“纳米抗体(nanobody)”具有本领域技术人员通常理解的含义，其是指由单个单体可变抗体结构域(例如单个重链可变区)所组成的抗体片段，通常来源于重链抗体(例如骆驼科动物抗体或鲨鱼抗体)的可变区。典型地，纳米抗体由4个构架区和3个互补性决定区组成，具有fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4的结构。纳米抗体可在n端或c端处截短以使其仅包含部分fr1和/或fr4，或缺少那些骨架区中的一个或两个，只要其实质上保持抗原结合和特异性即可。纳米抗体也称为单域抗体(single-domainantibody,sdab)，两者可互换使用。87.如本文中所使用的，术语纳米抗体的“抗原结合片段”是指包含纳米抗体的片段的多肽，其保持特异性结合纳米抗体所结合的相同抗原的能力，和/或与纳米抗体竞争对抗原的特异性结合，其也被称为“抗原结合部分”。通常参见，fundamentalimmunology,ch.7(paul,w.,ed.,第2版，ravenpress,n.y.(1989)，其以其全文通过引用合并入本文，用于所有目的。可通过重组dna技术或通过本发明纳米抗体的酶促或化学断裂产生本发明抗体的抗原结合片段。在一些实施方案中，所述纳米抗体的“抗原结合片段”与全长纳米抗体相比可在n端或c端处截短以使其仅包含部分fr1和/或fr4，或缺少那些骨架区中的一个或两个，只要其实质上保持抗原结合和特异性即可。88.可使用本领域技术人员已知的常规技术(例如，重组dna技术或酶促或化学断裂法)从给定的纳米抗体(例如本发明提供的纳米抗体)获得纳米抗体的抗原结合片段，并且以与用于完整纳米抗体的方式相同的方式就特异性筛选纳米抗体的抗原结合片段。89.在本文中，除非上下文明确指出，否则当提及术语“纳米抗体”时，其不仅包括完整纳米抗体，而且包括纳米抗体的抗原结合片段。90.如本文中所使用的，术语“互补决定区”或“cdr”是指抗体可变区中负责抗原结合的氨基酸残基。在纳米抗体中含有三个cdr，命名为cdr1、cdr2和cdr3。这些cdr的精确边界可根据本领域已知的各种编号系统进行定义，例如可按照kabat编号系统(kabatetal.,sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,5thed.publichealthservice,nationalinstitutesofhealth,bethesda,md.,1991)、chothia编号系统(chothia&lesk(1987)j.mol.biol.196:901-917；chothia等人(1989)nature342:878-883)或imgt编号系统(lefrancetal.,dev.comparat.immunol.27:55-77,2003)中的定义。对于给定的纳米抗体，本领域技术人员将容易地鉴别各编号系统所定义的cdr。并且，不同编号系统之间的对应关系是本领域技术人员熟知的(例如，可参见lefrancetal.,dev.comparat.immunol.27:55-77,2003)。91.如本文中所使用的，术语“构架区”或“fr”残基是指，抗体可变区中除了如上定义的cdr残基以外的那些氨基酸残基。92.如本文中所使用的，术语“特异性结合”是指，两分子间的非随机的结合反应，如抗体和其所针对的抗原之间的反应。特异性结合相互作用的强度或亲和力可以该相互作用的平衡解离常数(kd)表示。在本发明中，术语“kd”是指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数，其用于描述抗体与抗原之间的结合亲和力。平衡解离常数越小，抗体-抗原结合越紧密，抗体与抗原之间的亲和力越高。93.两分子间的特异性结合性质可使用本领域公知的方法进行测定。一种方法涉及测量抗原结合位点/抗原复合物形成和解离的速度。“结合速率常数”(ka或kon)和“解离速率常数”(kdis或koff)两者都可通过浓度及缔合和解离的实际速率而计算得出(参见malmqvistm,nature,1993,361:186-187)。kdis/kon的比率等于解离常数kd(参见davies等人,annualrevbiochem,1990；59:439-473)。可用任何有效的方法测量kd、kon和kdis值。在某些实施方案中，可以使用表面等离子体共振术(spr)在biacore中来测量解离常数。除此以外还可用生物发光干涉测量法或kinexa来测量解离常数。94.如本文中所使用的，术语“载体(vector)”是指，可将多聚核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体，例如酵母人工染色体(yac)、细菌人工染色体(bac)或p1来源的人工染色体(pac)；噬菌体如λ噬菌体或m13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括但不限于，逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如sv40)。一种载体可以含有多种控制表达的元件，包括但不限于，启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。95.如本文中所使用的，术语“宿主细胞”是指，可用于导入载体的细胞，其包括但不限于，如大肠杆菌或枯草菌等的原核细胞，如酵母细胞或曲霉菌等的真菌细胞，如s2果蝇细胞或sf9等的昆虫细胞，或者如纤维原细胞，cho细胞，cos细胞，nso细胞，hela细胞，bhk细胞，hek293细胞或人细胞等的动物细胞。宿主细胞可以包括单个细胞或细胞群体。96.如本文中所使用的，术语“同一性”用于指两个多肽之间或两个核酸之间序列的匹配情况。当两个进行比较的序列中的某个位置都被相同的碱基或氨基酸单体亚单元占据时(例如，两个dna分子的每一个中的某个位置都被腺嘌呤占据，或两个多肽的每一个中的某个位置都被赖氨酸占据)，那么各分子在该位置上是同一的。两个序列之间的“百分数同一性”是由这两个序列共有的匹配位置数目除以进行比较的位置数目×100的函数。例如，如果两个序列的10个位置中有6个匹配，那么这两个序列具有60％的同一性。例如，dna序列ctgact和caggtt共有50％的同一性(总共6个位置中有3个位置匹配)。通常，在将两个序列比对以产生最大同一性时进行比较。这样的比对可通过使用，例如，可通过计算机程序例如align程序(dnastar,inc.)方便地进行的needleman等人(1970)j.mol.biol.48：443-453的方法来实现。还可使用已整合入align程序(版本2.0)的e.meyers和w.miller(comput.applbiosci.，4:11-17(1988))的算法，使用pam120权重残基表(weightresiduetable)、12的缺口长度罚分和4的缺口罚分来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。此外，可使用已整合入gcg软件包(可在www.gcg.com上获得)的gap程序中的needleman和wunsch(jmoibiol.48:444-453(1970))算法，使用blossum62矩阵或pam250矩阵以及16、14、12、10、8、6或4的缺口权重(gapweight)和1、2、3、4、5或6的长度权重来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。97.如本文中所使用的，术语“保守置换”意指不会不利地影响或改变包含氨基酸序列的蛋白/多肽的预期性质的氨基酸置换。例如，可通过本领域内已知的标准技术例如定点诱变和pcr介导的诱变引入保守置换。保守氨基酸置换包括用具有相似侧链的氨基酸残基替代氨基酸残基的置换，例如用在物理学上或功能上与相应的氨基酸残基相似(例如具有相似大小、形状、电荷、化学性质，包括形成共价键或氢键的能力等)的残基进行的置换。已在本领域内定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸和组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，优选用来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基替代相应的氨基酸残基。鉴定氨基酸保守置换的方法在本领域内是熟知的(参见，例如，brummell等人，biochem.32:1180-1187(1993)；kobayashi等人proteineng.12(10):879-884(1999)；和burks等人proc.natlacad.setusa94:412-417(1997)，其通过引用并入本文)。98.本文涉及的二十个常规氨基酸的编写遵循常规用法。参见例如，immunology-asynthesis(2ndedition,e.s.golubandd.r.gren,eds.,sinauerassociates,sunderland,mass.(1991))，其以引用的方式并入本文中。在本发明中，术语“多肽”和“蛋白质”具有相同的含义且可互换使用。并且在本发明中，氨基酸通常用本领域公知的单字母和三字母缩写来表示。例如，丙氨酸可用a或ala表示。99.如本文中所使用的，术语“药学上可接受的载体和/或赋形剂”是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性成分相容的载体和/或赋形剂，其是本领域公知的(参见例如remington'spharmaceuticalsciences.editedbygennaroar,19thed.pennsylvania:mackpublishingcompany,1995)，并且包括但不限于：ph调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂，稀释剂，维持渗透压的试剂，延迟吸收的试剂，防腐剂。例如，ph调节剂包括但不限于磷酸盐缓冲液。表面活性剂包括但不限于阳离子，阴离子或者非离子型表面活性剂，例如tween-80。离子强度增强剂包括但不限于氯化钠。防腐剂包括但不限于各种抗细菌试剂和抗真菌试剂，例如对羟苯甲酸酯，三氯叔丁醇，苯酚，山梨酸等。维持渗透压的试剂包括但不限于糖、nacl及其类似物。延迟吸收的试剂包括但不限于单硬脂酸盐和明胶。稀释剂包括但不限于水，水性缓冲液(如缓冲盐水)，醇和多元醇(如甘油)等。防腐剂包括但不限于各种抗细菌试剂和抗真菌试剂，例如硫柳汞，2-苯氧乙醇，对羟苯甲酸酯，三氯叔丁醇，苯酚，山梨酸等。稳定剂具有本领域技术人员通常理解的含义，其能够稳定药物中的活性成分的期望活性，包括但不限于谷氨酸钠，明胶，spga，糖类(如山梨醇，甘露醇，淀粉，蔗糖，乳糖，葡聚糖，或葡萄糖)，氨基酸(如谷氨酸，甘氨酸)，蛋白质(如干燥乳清，白蛋白或酪蛋白)或其降解产物(如乳白蛋白水解物)等。在某些示例性实施方案中，所述药学上可接受的载体或赋形剂包括无菌可注射液体(如水性或非水性悬浮液或溶液)。在某些示例性实施方案中，此类无菌可注射液体选自注射用水(wfi)、抑菌性注射用水(bwfi)、氯化钠溶液(例如0.9％(w/v)nacl)、葡萄糖溶液(例如5％葡萄糖)、含有表面活性剂的溶液(例如0.01％聚山梨醇20)、ph缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲溶液)、ringer氏溶液及其任意组合。100.如本文中所使用的，术语“预防”是指，为了阻止或延迟疾病或病症或症状(例如，与il-23有关的疾病)在受试者体内的发生而实施的方法。如本文中所使用的，术语“治疗”是指，为了获得有益或所需临床结果而实施的方法。为了本发明的目的，有益或所需的临床结果包括但不限于，减轻症状、缩小疾病的范围、稳定(即，不再恶化)疾病的状态，延迟或减缓疾病的发展、改善或减轻疾病的状态、和缓解症状(无论部分或全部)，无论是可检测或是不可检测的。此外，“治疗”还可以指，与期望的存活期相比(如果未接受治疗)，延长存活期。101.如本文中使用的，术语“受试者”是指哺乳动物，例如灵长类哺乳动物，例如人。在某些实施方式中，所述受试者(例如人)患有与il-23有关的疾病。102.发明的有益效果103.il-23是多种炎性疾病或自身免疫性疾病的病程发展中的关键促炎细胞因子，il-23能够通过与细胞膜表面的受体il-23r结合，激活th17产生特异性转录因子ror-γt，从而进一步地刺激th17细胞扩增，最终导致促炎细胞因子风暴。靶向中和固有层中的il-23能有效抑制病程发展，然而单克隆抗体组织穿透性差，稳定性差，对ph变化耐受较低，到达有效部位的剂量小，且免疫原性高容易引起继发性耐药和抗药抗体的产生。104.本发明提供了对il-23具备高亲和力的纳米抗体，其能够高效中和il-23的生物活性，并且作为纳米抗体，其免疫原性低、分子量小、组织穿透性强、结构稳定，是治疗炎性疾病或自身免疫性疾病的潜在治疗方案，具有重大的临床价值。105.下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将理解，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得可实施。附图说明106.图1：37d5与il-23对接的复合物结构，紫色为抗原结构，绿色为纳米抗体结构，红色、黄色、蓝色分为cdr1、cdr2、cdr3区。107.图2：37d5单点突变的亲和力预测结果。108.图3：37d5单点突变的表达纯化，m：蛋白marker1-3：t28d,y31w,y108w。109.图4：37d5和突变体对hil-23的elisa结果。110.图5：37d5及其突变体的spr结果。111.图6：37d5及其突变体抑制il-23依赖的细胞增殖实验。112.图7：37d5及其突变体对细胞因子hil-23的中和活性实验。113.序列信息114.表1：本发明涉及的序列的信息描述于下面的表中：115.116.具体实施方式117.现参照下列意在举例说明本发明(而非限定本发明)的实施例来描述本发明。118.除非特别指明，本发明中所使用的分子生物学实验方法和免疫检测法，基本上参照j.sambrook等人，分子克隆：实验室手册，第2版，冷泉港实验室出版社，1989，以及f.m.ausubel等人，精编分子生物学实验指南，第3版，johnwiley&sons,inc.，1995中所述的方法进行。本领域技术人员知晓，实施例以举例方式描述本发明，且不意欲限制本发明所要求保护的范围。119.实施例1：纳米抗体突变体的设计120.1、纳米抗体突变位点的确定121.本研究中，通过对纳米抗体37d5(pct/ep2008/066365中的seqinno:2490)进行亲和力成熟，进一步亲和力提高的纳米抗体突变体。通过使用interprosurf对37d5纳米抗体(氨基酸序列seqidno:1，核苷酸序列seqidno:2)与抗原形成的抗原-抗体复合物pdb结构的进行分析，确定纳米抗体与抗原的结合区域，并进一步使用pymol软件对抗原-抗体复合物进行分析，以确定参与对接界面的氨基酸。纳米抗体中cdr区主要负责与抗原的结合，所以选择cdr区作为引入氨基酸突变区域。122.37d5中参与和il-23中p19亚基结合的位于cdr区的氨基酸有13个，再使用interprosurf分析复合物对接界面，除去不参与突变的半胱氨酸和脯氨酸，最终确定参与突变的氨基酸共涉及cdr1、cdr2和cdr3共10个位点，分别为：t28,y31,l32,s52,y57,e101,y103,r106,y108,e112。37d5和il-23对接复合物结构如图1所示。123.2、突变前的结构预处理124.确定突变位点后，还需对复合物结构进行预处理：使用pymol去除复合物结构中的结晶水和盐离子；使用mainpage在线服务器向复合物结构中添加缺失的h离子，并优化h键网络。125.3、体外亲和力成熟126.使用vimas平台(minhu等人,invitroaffinitymaturationtoimprovetheefficacyofahypoxia-induciblefactor1αsingle-domainintrabody,biochemicalandbiophysicalresearchcommunications,volume529,issue4,2020,pages936-942)对纳米抗体序列37d5进行计算机辅助的体外亲和力成熟，该平台涉及到3三种算法mcsm-ab、foldx和ospry。鉴于二硫键对纳米抗体稳定性的影响以及脯氨酸自身结构的原因，所以将每个待突变的氨基酸突变成除半胱氨酸和脯氨酸外的其他的17个氨基酸。针对37d5，第一轮共选择了10个氨基酸进行单点突变，总共计算评估了170个突变。分别使用上述的亲和力预测模拟软件进行突变预测，根据每个软件输出的结果确定最终合适的单点突变。结果如图2所示。127.在37d5中，第一轮结果显示，一共涉及到37d5的3个氨基酸的共3种突变，涉及到的氨基酸为thr28，tyr31，tyr108。128.4、突变后可溶性预测129.点突变将改变纳米抗体的等电点及亲疏水性进而影响其溶解性，然而抗体需要在可溶状态下才能发挥结合抗原和治疗疾病的作用，部分突变体有自聚集的倾向，所以在重组蛋白的表达中，蛋白质的溶解性是必须要考虑的因素。在本实验中，通过使用camsol来分析蛋白质序列中每一个氨基酸残基的溶解度贡献度，分数大于1的区域表示为高溶性区域，分数小于-1时，表示为低溶性区域。37d5及其突变体的分数如表2所示。三种点突变都不涉及极性氨基酸到非极性氨基酸的转变，三种点突变的intrinsicsolubilityscore变化不大，均处于可溶的状态。130.表2：37d5及突变体的溶解度分数[0131][0132]实施例2：纳米抗体突变体的表达纯化[0133]1、cpec法构建单点突变[0134](1)首先使用引物对纳米抗体的碱基序列引入点突变，以实验室保存的pet-32a为模板，使用snapgene软件设计突变位点上下游引物，并且在突变位点大致对称的位置在质粒上设计上下游引物，通过pcr的方式对目的蛋白进行扩增。质粒上的上游引物为seqidno:23，质粒上的下游引物为seqidno:24。[0135](2)纳米抗体37d5单点突变所用引物(下划线碱基为引入突变氨基酸的碱基序列)：[0136]t28d上游引物和下游引物分别为seqidno:25和26；[0137]y31w上游引物和下游引物分别为seqidno:27和28；[0138]y108w上游引物和下游引物分别为seqidno:29和30。[0139](3)pcr反应结束后，用核酸凝胶电泳验证结果，然后使用dna凝胶快速纯化试剂盒对pcr产物进行切胶回收。对纯化后的pcr产物进行cpec环化，构建环形质粒。[0140](4)从-80℃冰箱中取出trans5α感受态细胞置于冰上，静置10min，随后在无菌操作台中使用移液枪吸取10μlcpec连接产物，缓慢地加入到感受态细胞中，在无菌超净台中静置30min，静置结束后在42℃的水浴锅中热激45s，热激后迅速置于冰上静置2min，最后向其中加入500μllb培养基复苏1h，最后4000rpm离心2min菌体，弃掉400μl上清液，用移液枪重悬菌体后，转移至amp抗性的平板中，涂布均匀，在37℃培养箱中倒置过夜培养，次日，挑取单克隆菌落在试管中培养，培养10-12h后保存成甘油菌，由苏州金唯智生物科技有限公司测序，验证氨基酸单点突变是否引入成功。[0141](5)将单点突变引入成功的质粒化转至transb感受态细胞中，化转方式同上，测序成功后，甘油菌置于-20℃冰箱中备用。[0142]2、37d5纳米抗体突变体的表达纯化[0143]测序正确的菌株在lb培养基中进行发酵培养，收集菌体，进行超声破碎，过0.45μmpes滤膜备用。使用aktaprimeplus蛋白纯化仪对单点突变纳米抗体进行纯化，将收集的所有组分用过sds-page凝胶电泳鉴定分析，结果如图3所示。[0144]3、尺寸排阻纯化[0145]为进一步提高抗体纯度，可以使用aktapure蛋白纯化仪以及superdextm75increase10/300gl预装柱对上述纯化得到的突变体进一步sec纯化，以提高后续实验的准确性。[0146]4、双点突变体的设计[0147]结合camsol溶解度和单点突变纳米抗体的sds-page胶图进行分析，37d5的3个位点的3种突变均有较好的表现，对37d5进行第二轮突变，3种突变共组成3种双点突变，使用foldx对其进行计算评估。结果如表3所示，37d5的双点突变仅有一个的结合能是小于0的，其余两个都较野生型有更低的亲和力，故而将t28d&y31w和t28d&y108w这两种双点突变体排除。[0148]表3：37d5双突变体结合能计算结果[0149][0150]基于上述结果，最终选择3个单点突变体和一个双点突变体用于后续的理化性质的验证，即t28d、y31w、y108w、y31w&y108w，为方便描述，命名为37d5m1(氨基酸序列seqidno:3，核苷酸序列seqidno:4)、37d5m2(氨基酸序列seqidno:5，核苷酸序列seqidno:6)、37d5m3(氨基酸序列seqidno:7，核苷酸序列seqidno:8)、37d5m4(氨基酸序列seqidno:9，核苷酸序列seqidno:10)；上述各纳米抗体的c端融合表达6his标签(hhhhhh,caccaccaccaccaccac)，以供纯化需要。[0151]实施例3：纳米抗体突变体的结合活性[0152]间接法elisa可以粗略地评估抗原-抗体的结合能力，可用于验证突变体较野生型，亲和力是否得到提高，具体实验方法如下：[0153](1)使用nanodrop测定抗原的浓度，然后使用包被缓冲液将抗原稀释至10μg/ml，每孔100μl加入到96孔板，bsa做阴性对照，4℃过夜包被；[0154](2)次日弃去包被液，每孔中加入200μlpbst溶液，洗涤3次，每次5min；[0155](3)向每孔中加入100μl封闭液，37℃培养箱中封闭1h；[0156](4)弃去封闭液，向每孔中加入200μlpbst溶液，共洗涤5次，每次5min；[0157](5)设置纳米抗体浓度为：200,150,100,12.5,1.5625,0.1953,0.0244,0.003μg/ml，向每孔加入100μl纳米抗体溶液，每个浓度设置三个平行，37℃培养箱中孵育2h；[0158](6)弃去孔内液体，每孔中加入200μlpbst溶液，洗涤5次，每次5min；[0159](7)向每孔内加入100μl1:10000稀释的带hrp标记的鼠源anti-his单克隆抗体(武汉三鹰，6*his,his-tagantibody(66005-1-ig))，37℃培养箱中孵育1h；[0160](8)弃去孔内液体，向每孔中加入200μlpbst溶液，共洗涤3次，每次10min，再向每孔内加入200μlpbs溶液，洗涤3次，每次5min；[0161](9)向每孔内加入100μl先配的tmb显色液(a液和b液1:1混合)，室温避光孵育15min；[0162](10)继续向孔内加100μl终止液，反应5min后，使用酶标仪测定每孔在od450下的吸光度。[0163]结果如图4所示，突变体相对于亲本对抗原的结合活性均有所提高。[0164]实施例4：纳米抗体突变体的亲和力测定[0165]使用biacoret200测定抗体对hil-23的结合常数kd：[0166]1、氨基偶联法捕获抗原：[0167](1)在仪器上安装cm5芯片，使用仪器自带的ph4.0、4.5、5.0的醋酸钠溶液稀释hil-23抗原(abcam，重组人il-23蛋白(active)(ab109153))至5μg/ml，使用manualrun程序，流速为10μl/min，进样时间为120s，对抗原进行预富集，选择最合适的醋酸钠溶液；[0168](2)使用ph4.5的醋酸钠溶液将il-23稀释至5μg/ml。使用wizard程序，il-23的targetlevel设置成1500ru。按照程序放置好抗原稀释液、50mmnaoh再生液、碳二亚胺/n-羟基丁二酰亚胺溶液、乙醇胺溶液，运行程序；[0169](3)ru值到targetlevel时，抗原成功偶联至cm5芯片上，将芯片置于pbs-ep+溶液中，4℃保存备用。[0170]2、kinectandaffinity程序测定抗体kd值：[0171](1)使用pbs-ep+溶液将37d5及突变体37d5m1-4梯度稀释成200-1.5625nm，对37d5及其突变体，流速为30μl/min，进样时间为100s，解离时间为600s，再生液为ph2.5的甘氨酸-盐酸溶液，再生时间为30s；[0172](2)使用biacoret200evaluationsoftware进行分析，选择5-6个浓度进行拟合分析，按照1.1:1binding模型分析动力学数据，计算kd值。[0173]结果如图5所示，分析后的kd值如表4所示。突变体相对于亲本对抗原的结合活性均有所提高。[0174]表4：37d5及突变体对hil-23的kd值[0175][0176]实施例5：纳米抗体突变体的细胞增殖抑制实验[0177]hil-23能诱导人淋巴t细胞系kit-225细胞(otwo(华拓)，htx2261)增殖，用以评价纳米抗体及突变体阻断il-23与其受体结合的结合活性。具体实验步骤如下：[0178](1)使用含有10％血清的培养基洗涤细胞，去除原培养基中的il-2。计数并制备细胞悬液，将4*104个细胞接种到96孔板中；[0179](2)同时加入终浓度为2ng/ml的hil-23(abcam，重组人il-23蛋白(active)(ab109153))以及不同浓度的anti-il-23纳米抗体及其突变体，设置纳米抗体浓度为：200,150,100,12.5,1.5625,0.1953,0.0244,0.003μg/ml，细胞在37℃，5％co2的环境养，使用cck-8试剂测量细胞数量。[0180](3)以未加入抗体和hil-23的对照组作为空白对照，以仅加入hil-23的对照组作为参照，计算抑制百分比，每组进行三次实验。[0181]结果如图6所示，anti-il-23纳米抗体能有效抑制hil-23诱导的kit-225细胞增殖，并且突变体抑制il-23依赖的细胞增殖较亲本具有明显提升。[0182]实施例6：纳米抗体突变体对il-23的中和活性测定[0183]本实施例检测纳米抗体及其突变体对hil-23生物功能的中和活性。hil-23的生物功能可以包括有效促进pbmc增殖及抗肿瘤活性，因此本研究选取对数生长期的人结直肠腺癌细胞caco-2(atcc,htb-37tm)作为靶细胞，通过检测纳米抗体及其突变体对hil-23促进的pbmc抗肿瘤活性的抑制作用，来测定检测纳米抗体及其突变体的中和活性。具体实验步骤如下：[0184](1)使用胰酶-edta消化caco-2细胞，计数，使用含有10％血清的培养基重悬细胞，调节细胞浓度为1*105个/ml：[0185](2)使用50ng/ml的hil-23处理1天，3天或5天的效应细胞pbmc(北京诺为生物技术有限公司，932057)，计数，使用培养基稀释细胞浓度为2*106个/ml，按照效靶比20:1的比例混合后，加入96孔板中进行共培养；[0186](3)设置靶细胞对照孔，效应细胞对照孔，每组样片设置3个复孔，重复三次；[0187](4)根据前期预实验结果，向实验组中加入终浓度为50μg/mlanti-il-23纳米抗体及其突变体并在37℃，5％co2的培养箱中孵育20小时后，使用cck-8试剂盒测定活细胞数量；[0188](5)杀伤率计算公式为：杀伤率(％)＝[a靶+a效-a(靶+效)]/a靶*100％。[0189]结果如图7所示，anti-il-23纳米抗体及其突变体均能有效抑制hil-23促进的pbmc抗肿瘤活性，表明其具备对hil-23的中和活性，并且突变体对il-23的中和活性均高于亲本。[0190]尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，但本领域技术人员将理解：根据已经公布的所有教导，可以对细节进行各种修改和变动，并且这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部分为由所附权利要求及其任何等同物给出。当前第1页12当前第1页12