猪FAPs细胞分离鉴定方法及FAPs细胞的用途

猪faps细胞分离鉴定方法及faps细胞的用途
技术领域
1.本发明涉及一种猪成纤维/成脂祖细胞 (fibro-adipogenic progenitors, faps) 分离与检测的方法及faps细胞的用途，属于现代农业和食品研究领域的应用技术。


背景技术：

2.faps细胞是位于肌束间和肌纤维间的一类间充质细胞亚群，其典型的分子标记基因为血小板来源生长因子受体α（platelet derived growth factor receptor alpha, pdgfrα）。faps细胞发挥多种重要的生理功能，参与调节肌肉组织微环境、骨骼肌发育及肌肉损伤修复等。研究发现，faps细胞是人和小鼠肌肉再生过程中肌内脂肪细胞的主要来源，具有分化成脂肪细胞和成纤维细胞的潜能。在猪肉生产中，肌内脂肪直接影响着猪肉品质，如何调控肌内脂肪沉积对于优质猪肉生产具有重要意义。faps细胞的增殖、成脂分化能力及数量可能直接影响猪肉肌内脂肪的含量，但目前缺乏高效、快捷的猪faps细胞分离方法，关于猪faps细胞成脂分化命运的调控机制还未见报道。
3.就目前猪肌内脂肪细胞体外培养相关研究报道来看，存在一系列技术难题，比如：1）常用的差速贴壁法得到的肌内脂肪前体细胞往往包含多种类型的细胞，其成脂分化能力一般，在很大程度上制约了其在肌内脂肪形成机制和细胞培养肉等研究领域的应用； 2）由于缺乏猪肌肉中faps细胞的分离鉴定方法，其在体外的培养方法、有效成脂分化培养基及方法尚不得而知，其分化聚酯能力及是否可用于基因功能相关研究也需要进一步探究。


技术实现要素：

4.为了克服现有技术中的问题，本发明的目的是提供一种猪 faps 细胞分离鉴定的方法及faps细胞的用途。
5.faps 细胞、分离鉴定方法及用途，包括以下步骤：1）猪背最长肌的分离和消化：取3～5日龄仔猪，经麻醉后处死并用酒精消毒，在无菌的超净工作台中，取背最长肌，用手术剪充分剪碎组织后按组织体积：消化酶体积=1：3加入0.2% 胶原酶
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，在 37 ℃ 消化1 h，先后经70 μm和40 μm的滤网过滤，500 g离心6 min；2）利用磁珠分选猪 faps 细胞：将1) 得到的细胞沉淀用洗涤液重悬，以细胞悬液体积：1
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红细胞裂解液=1：9的加入红细胞裂解液，置于4 ℃裂解5 min，随后400 g 离心5 min；用1 ml的1
×
binding buffer重悬细胞，加入100 μl 死细胞去除剂在室温孵育15 min，随后400 g 离心5 min；1
×
binding buffer重悬细胞，用细胞计数器检测细胞浓度，按2.5μg / 106个细胞加入cd140a-biotin 抗体（130-101-905, miltenyi biotec），于4 ℃ 孵育5 min，400 g 离心4 min；80 μl1
×
binding buffer重悬细胞，加入20 μl anti-biotin microbeads（130-090-485, miltenyi biotec），4 ℃ 孵育15 min，400 g 离心4 min；用200 μl的 1
×
binding buffer重悬细胞，过磁柱，停留于吸附柱上的细胞即为猪 faps 细胞，收集细胞；
3) 猪 faps 细胞的免疫荧光鉴定：将猪 faps 细胞接种于24孔板培养3天，3天后采用不同的pdgfrα 抗体进行免疫荧光检测，筛选得到可以用于鉴定猪faps细胞的特异性抗体（a2103, abclonal technology）；4）猪 faps 细胞成脂分化聚酯能力及脂质代谢相关基因检测：将分离得到的 faps 接种到 12 孔细胞培养板中培养，用成脂诱导培养基 (mdi medium) 诱导 faps 向成脂方向分化 4 天后更换为分化培养基 (ins medium)，继续培养 2 天， 采用bodipy 染色检测分化聚酯情况，并通过实时荧光定量pcr 检测脂肪合成与代谢相关基因（pparg, adipoq, fabp4等）的表达情况；同时将经差速贴壁法得到肌内前体脂肪细胞诱导分化，通过bodipy 染色比较二者分化聚酯能力；5) 基因功能研究：用带gfp荧光标签的sv40慢病毒转染猪 faps 细胞，转染72小时后检测gfp荧光。
6.一种根据所述的分离和检测方法得到的高纯度猪 faps 细胞，表达pdgfrα；一种根据所述的猪 faps 细胞分离与检测的方法及用途，用于研究猪肌内脂肪细胞形成、细胞培养肉的生产，用于研究猪 faps 细胞分化聚酯调控，还可用于肌内脂肪沉积相关基因表达规律以及基因功能研究；所述的用途，猪 faps 细胞在体外具有很好的增殖和成脂分化潜力，并可用于基因功能研究。
7.本发明的有益效果：本发明提供了一种的猪 faps 细胞分离与检测的方法，借助磁珠分选技术得到的猪 faps 细胞，相比流式分选法具有方便、快捷的优点；同时，确定了可以用于猪faps 细胞磁珠分选及免疫荧光染色的特异性抗体；通过体外培养、成脂分化诱导证实了猪 faps 细胞具有良好的分化聚酯能力，确定了诱导猪 faps 细胞成脂分化的配方，这为猪肌内脂肪的沉积调控和细胞培养肉的研发提供新方法。
8.本发明得到的猪 faps 细胞在体外具有良好的增殖和成脂分化潜力，是研究猪肌内脂肪的沉积的关键细胞模型，可用于体外探究调控猪 faps 细胞成脂、成纤维分化等方面的研究，开拓了目前研究猪肌内脂肪沉积及 faps 细胞分化命运调控研究的新方法；其次，分离得到的猪 faps 细胞可用于3d 细胞培养，可以探究体内条件下肌内脂肪的形成机制；而且，faps 细胞是肌内脂肪的主要细胞来源，可以当作种子细胞在体外用于细胞培养肉的研发、生产，应用前景广泛。
附图说明
9.图 1 是免疫磁珠分选的技术图。
10.图 2 是猪 faps 细胞的白光图片，分别拍摄于第1天和第4天。
11.图 3 是免疫荧光染色的检测猪 faps细胞结果图。
12.图 4 是猪 faps 细胞成脂分化过程中形态变化图，拍摄于诱导第2、4、6天。箭头所指样细胞为faps分化成的成熟肌内脂肪细胞。
13.图 5 是磁珠分选得到的猪 faps 细胞和差速贴壁法得到的肌内脂肪前体细胞成脂分化后，用bodipy染色检测其脂滴沉积情况。箭头所指样细胞为faps分化成的成熟肌内脂肪细胞。
14.图 6 是猪 faps 细胞成脂分化后，脂肪合成、代谢关键基因表达的qpcr检测结果。
15.图 7 是sv40慢病毒感染猪 faps 细胞72小时后的荧光检测图片。
具体实施方式
16.下面结合附图和具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。
17.（一）、猪背最长肌的分离和消化1、分离原代细胞前的准备提前一天将手术剪、手术刀放入高压灭菌锅灭菌处理，超净工作台紫外灯照射30 min；提前配制好75% 乙醇，用无菌的50 ml离心管分装若干管 75% 乙醇和pbs，并将其置于冰上预冷。
18.2、猪背最长肌的分离与消化1）将购自杭州灯塔种猪有限公司的3～5日龄仔猪经心脏放血处死，用75% 乙醇擦拭仔猪全身，经灭菌处理后，将仔猪转移至超净工作台，取出仔猪背最长肌先放入盛有75% 乙醇的50ml离心管中，经涮洗几次后转移至已预冷处理的pbs中，先洗涤两次除去所含血液，再将背最长肌转移至新的pbs中。
19.2）取出其中一小块肌肉置于含有pbs的无菌细胞培养皿里，用手术剪将其剪成小块，再将其转移至无菌的5 ml离心管中，用手术剪快速将其剪碎至1 mm3的大小，将剪碎后的组织转移至无菌的15 ml离心管中。
20.3）按组织体积：消化酶体积=1：3加入0.2% 胶原酶
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（由pbs溶液配制）。将组织、消化酶混合液置于 37℃ 水浴锅消化1 h（具体消化时间根据实际消化情况决定）。
21.4）加入1/2体积含血清的培养基，先后经70 μm、40 μm的滤网过滤。
22.5）收集滤液，500 g离心6 min）。
23.（二）、利用差速贴壁法获取肌内脂肪前体细胞将细胞用完全培养基重悬，接种于细胞培养盘，培养2 h后换液，得到肌内脂肪前体细胞。
24.（三）、利用免疫磁珠分选猪 faps 细胞（如图1所示）1、去除红细胞1）去掉离心后的上清液，用1 ml洗涤液重悬细胞，并充分吹散细胞。
25.洗涤液组成：含有0.1% bsa的fbs溶液。
26.2）加入9 ml 红细胞裂解液（博士德生物），额外加入1 ml胰酶（赛默飞公司）防止聚团，充分混匀后在4 ℃裂解4 min。
27.3）300 g离心4 min。
28.2、去除死细胞1）去掉离心后的上清液，用1 ml 1
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的binding buffer（miltenyi biotec）重悬细胞，加入100 μl的死细胞去除剂（miltenyi biotec）。
29.2）充分混匀后在室温静置15 min，300 g离心4 min。
30.3、孵育pdgfrα（cd140a）-biotin抗体
μg/ml和地塞米松1 μm。
48.ins medium：用完全培养基配制，包含胰岛素10 μg/ml。
49.结果为：在分化第2天，诱导组出现明显的形态改变，在分化第4和第6天出现明显的脂滴（图4）；bodipy染色进一步证明，对照组几乎没有脂滴出现，而诱导组出现较多脂滴，且猪faps 细胞中的脂滴明显多于肌内脂肪前体细胞（图5）；qpcr检测结果表明，诱导组猪faps 细胞中pparg, adipoq, fabp4等基因表达显著高于对照组（图6）。结果提示，猪 faps 细胞在体外可诱导分化为成熟的脂肪细胞，经磁珠分选得到的猪 faps 细胞为研究猪肌内脂肪沉积、细胞培养肉的生产提供了稳定的细胞模型。
50.（五）、基因功能研究用带gfp荧光标签的sv40慢病毒转染猪 faps 细胞，转染3天后检测gfp荧光（图7）。
51.结果为：sv40慢病毒转染猪 faps 细胞的效率较高（图7），且感染慢病毒后细胞具有正常的形态和活力，证明猪 faps 细胞在体外可用于基因功能研究。
52.最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形，比如用于药物筛选和制备。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。