一种结合SSX2抗原的TCR分子及其应用的制作方法

本发明属于生物，涉及一种结合ssx2抗原的tcr分子及其应用，具体涉及一种能够识别衍生自ssx2蛋白多肽的t细胞受体(t cell receptor，tcr)及其制备方法和用途。

背景技术：

1、仅仅有两种类型的分子能够以特异性的方式识别抗原。其中一种是免疫球蛋白或抗体；另一种是t细胞受体(tcr)。tcr是由α链/β链或者γ链/δ链以异二聚体形式存在的细胞膜表面的糖蛋白，在人类中，tcr中95％的t细胞受体由α链和β链组成，分别由tra和 trb编码。tcr对pmhc(抗原肽-主要组织相容性复合体)的识别涉及到两种结合：tcr 与mhc分子的结合以及tcr与多肽抗原的结合。

2、tcr上的结合面来自6个区域：tcrα、β链上各自的cdrl、cdr2以及cdr3。cdr1 与cdr2主要结合相对保守的mhc分子，cdr3则主要结合多变的抗原多肽。这种结合模式可以很好地保证tcr特异地结合mhc分子，并能识别多变的抗原。其中以cdr3的变异最大，直接决定了tcr的抗原结合特异性。

3、在免疫系统中，通过抗原特异性的tcr与pmhc复合物的结合引发t细胞与抗原呈递细胞(apc)直接的物理接触，然后t细胞及apc两者的其他细胞膜表面分子就发生相互作用，这就引起了一系列后续的细胞信号传递和其他生理反应，从而使得不同抗原特异性的t 细胞对其靶细胞发挥免疫效应。

4、ssx2是滑膜肉瘤x断点，也被称为hom-mel-40。ssx2是ssx家族十种高度同源的核酸蛋白之一。ssx蛋白是肿瘤睾丸抗原，只在肿瘤细胞以及没有mhc表达的睾丸胚细胞中表达。ssx2在多种人类癌细胞中表达，包括但不限于，肝癌、肺癌、纤维肉瘤、乳腺癌、结肠癌、前列腺癌。ssx2在细胞内生成后被降解成小分子多肽，并与mhc(主组织相容性复合体)分子结合形成复合物，被呈递到细胞表面，aqipekiqk是衍生自ssx2抗原的短肽。

5、本发明致力于开发能够结合aqipekiqk-hla a1101复合物且对肿瘤的治疗具有很高的应用价值的tcr。例如，能够靶向该肿瘤细胞标记的tcr可用于将细胞毒性剂或免疫刺激剂递送到靶细胞，或被转化入t细胞，使表达该tcr的t细胞能够破坏肿瘤细胞，以便在被称为过继免疫治疗的治疗过程中给予患者。

技术实现思路

1、针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种结合ssx2抗原的tcr分子及其应用。本发明提供了一种特异性识别并结合aqipekiqk-hla a1101复合物的tcr分子，本发明还提供了提供一种所述tcr分子的制备方法及所述tcr分子的用途。

2、为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

3、本发明的第一方面，提供了一种tcr分子，所述tcr分子包含tcrα链可变域和tcrβ链可变域，所述tcr分子具有结合aqipekiqk-hla a1101复合物的活性，并且所述tcrα链可变域的氨基酸序列与seq id no:1所示的氨基酸序列有至少90％的序列同源性(例如可以是91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)；和所述tcrβ链可变域的3个cdr区的氨基酸序列为：

4、βcdr1-sghvs (seq id no:16)

5、βcdr2-fqneaq (seq id no:17)

6、βcdr3-asslvgyeqy (seq id no:18)。

7、在另一优选例中，所述tcrα链可变域的氨基酸序列与seq id no:1所示的氨基酸序列有至少90％的序列同源性，和所述tcrβ链可变域的氨基酸序列与seq id no:7所示的氨基酸序列有至少90％的序列同源性(例如可以是91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、 98％、99％或100％)。

8、在本发明中，所述tcr分子的α链可变域相对于seq id no:1所示的序列，有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11个氨基酸残基插入、缺失、替换或其组合。

9、在本发明中，所述tcr分子的β链可变域相对于seq id no:7所示的序列，有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11个氨基酸残基插入、缺失、替换或其组合。

10、在另一优选例中，所述tcr分子为αβ异质二聚tcr。

11、优选地，所述tcr分子具有α链恒定区序列trac*01和β链恒定区序列trbc1*01或trbc2*01。

12、在另一优选例中，所述tcr分子包含α链恒定区与β链恒定区，所述α链恒定区为鼠的恒定区和/或所述β链恒定区为鼠的恒定区。

13、在另一优选例中，所述tcr分子的α与β链的恒定区分别为鼠源的α与β链的恒定区。

14、在另一优选例中，所述tcrα链可变域包含3个cdr区，和所述tcrβ链可变域包含3个cdr区，其中所述tcrβ链可变域的3个cdr区的氨基酸序列为：

15、βcdr1-sghvs (seq id no:16)

16、βcdr2-fqneaq (seq id no:17)

17、βcdr3-asslvgyeqy (seq id no:18)。

18、在另一优选例中，所述tcr分子的α链可变域为与seq id no:1所示的氨基酸序列有至少95％的序列同源性的氨基酸序列，和所述tcr分子的β链可变域为与seq id no:7所示的氨基酸序列有至少95％的序列同源性的氨基酸序列。

19、在另一优选例中，所述tcr分子的β链可变域氨基酸序列为seq id no:7。

20、在另一优选例中，所述tcrα链可变域包含3个cdr区，和所述tcrβ链可变域包含3个cdr区，其中所述tcrα链可变域的3个cdr区的氨基酸序列为：

21、αcdr1-ssysps (seq id no:13)

22、αcdr2-ytsaatlv (seq id no:14)

23、αcdr3-vvssgntplv (seq id no:15)。

24、在另一优选例中，所述tcr分子的α链可变域为与seq id no:1所示的氨基酸序列有至少95％的序列同源性的氨基酸序列；和所述tcrβ链可变域的3个cdr区的氨基酸序列为：

25、βcdr1-sghvs (seq id no:16)

26、βcdr2-fqneaq (seq id no:17)

27、βcdr3-asslvgyeqy (seq id no:18)。

28、在另一优选例中，所述tcr分子的α链可变域为与seq id no:1所示的氨基酸序列有至少95％的序列同源性的氨基酸序列；和所述tcr分子的β链可变域氨基酸序列为seq idno:7。

29、在另一优选例中，所述tcr具有选自下组的cdr，如表1所示：

30、表1

31、

32、作为本发明的优选技术方案，所述tcr分子的α链可变域的3个cdr区的氨基酸序列为：

33、αcdr1-ssysps (seq id no:13)

34、αcdr2-ytsaatlv (seq id no:14)

35、αcdr3-vvssgntplv (seq id no:15)；

36、所述tcr分子的β链可变域的3个cdr区的氨基酸序列为：

37、βcdr1-sghvs (seq id no:16)

38、βcdr2-fqneaq (seq id no:17)

39、βcdr3-asslvgyeqy (seq id no:18)。

40、作为本发明的优选技术方案，所述tcr分子的α链可变域的3个cdr区的氨基酸序列为：

41、αcdr1-ssyspy (seq id no:24)

42、αcdr2-ytsaatlv (seq id no:14)

43、αcdr3-vislgntplv (seq id no:25)；

44、所述tcr分子的β链可变域的3个cdr区的氨基酸序列为：

45、βcdr1-sghvs (seq id no:16)

46、βcdr2-fqneaq (seq id no:17)

47、βcdr3-asslvgyeqy (seq id no:18)。

48、在另一优选例中，所述tcr分子的α链可变域氨基酸序列为：seq id no:1、seq idno:21之一；和/或所述tcr分子的β链可变域氨基酸序列选自：seq id no:7。

49、在另一优选例中，所述tcr分子选自下组：

50、(1)α链可变域序列为seq id no:1，和β链可变域序列为seq id no:7；

51、(2)α链可变域序列为seq id no:21，和β链可变域序列为seq id no:7。

52、在另一优选例中，所述tcr分子包含(ⅰ)除其跨膜结构域以外的全部或部分tcrα链，和(ⅱ)除其跨膜结构域以外的全部或部分tcrβ链，其中(ⅰ)和(ⅱ)均包含tcr链的可变域和至少一部分恒定域。

53、在另一优选例中，所述tcr分子的α链恒定区与β链恒定区之间含有人工链间二硫键。

54、优选地，所述形成人工链间二硫键的半胱氨酸残基取代了选自下列的一组或多组位点：

55、trac*01外显子1的thr48和trbc1*01或trbc2*01外显子1的ser57；

56、trac*01外显子1的thr45和trbc1*01或trbc2*01外显子1的ser77；

57、trac*01外显子1的tyr10和trbc1*01或trbc2*01外显子1的ser17；

58、trac*01外显子1的thr45和trbc1*01或trbc2*01外显子1的asp59；

59、trac*01外显子1的ser15和trbc1*01或trbc2*01外显子1的glu15；

60、trac*01外显子1的arg53和trbc1*01或trbc2*01外显子1的ser54；

61、trac*01外显子1的pro89和trbc1*01或trbc2*01外显子1的ala19；

62、或trac*01外显子1的tyr10和trbc1*01或trbc2*01外显子1的glu20。

63、在另一优选例中，本发明所述tcr分子是人源的。

64、在另一优选例中，本发明所述tcr分子是人源化的。

65、在另一优选例中，所述tcr分子是可溶的。

66、在另一优选例中，所述tcr分子为单链tcr。

67、优选地，所述单链tcr是α链可变域和β链可变域由一柔性短肽序列(linker)连接而成。

68、在另一优选例中，所述tcr分子的α链和/或β链的c-或n-末端结合有偶联物。

69、优选地，所述偶联物包括可检测标记物、治疗剂或pk修饰部分中任意一种或至少两种的组合。

70、最优选地，与所述tcr分子结合的治疗剂为连接于所述tcr分子的α或β链的c-或n-末端的抗-cd3抗体。

71、本发明的第二方面，提供了一种多价tcr复合物，所述多价tcr复合物包含至少两个 tcr分子，并且其中的至少一个tcr分子为本发明第一方面所述的tcr分子。

72、本发明的第三方面，提供了一种核酸分子，所述核酸分子包含编码本发明第一方面所述的tcr分子的核苷酸序列，或编码本发明第一方面所述的tcr分子的核苷酸序列的互补序列。

73、本发明的第四方面，提供了一种载体，所述载体含有本发明第三方面所述的核酸分子。

74、优选地，所述载体为病毒载体。

75、更优选地，所述载体为慢病毒载体。

76、本发明的第五方面，提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞中含有本发明第四方面所述的载体，或所述宿主细胞的基因组中整合有外源的本发明第三方面所述的核酸分子。

77、本发明的第六方面，提供了一种分离的细胞，所述分离的细胞表达本发明第一方面所述的tcr分子。

78、优选地，所述分离的细胞包括t细胞、nk细胞或nkt细胞。

79、在另一优选例中，所述分离的细胞表达本发明第一方面所述的tcr分子，并且还表达外源的cd8受体。

80、优选地，所述cd8受体是cd8α。

81、本发明的第七方面，提供了一种药物组合物，所述药物组合物含有本发明第一方面所述的tcr分子、本发明第二方面所述的多价tcr复合物或本发明第六方面所述的分离的细胞中任意一种或至少两种的组合。

82、优选地，所述药物组合物还含有药学上可接受的载体。

83、本发明的第八方面，提供了一种治疗疾病的方法，所述治疗疾病的方法包括给需要治疗的对象施用适量的本发明第一方面所述的tcr分子、本发明第二方面所述的多价tcr复合物、本发明第六方面所述的分离的细胞或本发明第七方面所述的药物组合物中任意一种或至少两种的组合。

84、优选地，所述疾病包括ssx2阳性肿瘤。

85、本发明的第九方面，提供了本发明第一方面所述的tcr分子、本发明第二方面所述的多价tcr复合物、本发明第六方面所述的分离的细胞中任意一种或至少两种的组合在制备治疗肿瘤或自身免疫疾病的药物中的用途。

86、优选地，所述肿瘤包括ssx2阳性肿瘤。

87、本发明的第十方面，提供了本发明第一方面所述的tcr分子、本发明第二方面所述的多价tcr复合物或本发明第六方面所述的分离的细胞中任意一种或至少两种的组合用作治疗肿瘤或自身免疫疾病的药物。

88、优选地，所述肿瘤包括ssx2阳性肿瘤。

89、本发明的第十一方面，提供了一种细胞，所述细胞转导有本发明第三方面所述的核酸分子或本发明第四方面所述的载体。

90、优选地，所述细胞包括t细胞、nk细胞或nkt细胞。

91、本发明的第十二方面，提供了一种本发明第一方面所述的tcr分子的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：

92、(i)培养本发明第五方面所述的宿主细胞，从而表达本发明第一方面所述的tcr分子；

93、(ii)分离或纯化出所述tcr分子。

94、应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

95、本发明所述的数值范围不仅包括上述例举的点值，还包括没有例举出的上述数值范围之间的任意的点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。

96、相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

97、(1)本发明的tcr分子能够与ssx2抗原短肽复合物aqipekiqk-hla a1101特异性结合。

98、(2)针对阳性靶细胞，转导本发明tcr分子的效应细胞能够被特异性激活，同时，转导本发明tcr分子的效应细胞还具有很强的杀伤功能。