p53突变基因在筛选促进伤口修复药物中的应用

1.本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及p53突变基因在筛选促进伤口修复药物中的应用。


背景技术：

2.创伤是整个医学领域最重要的基本问题之一。创伤愈合的研究已愈来愈受到人们的重视，建立符合临床发病过程和建立符合影响创面愈合主要因素的动物模型是研究创伤愈合机理与评价创伤修复药物的基础。结合国内外相关研究与报道，现有的几种用于创面修复的动物模型均建立在野生型小鼠的基础上。伤口愈合是一个复杂、协调有序的组织修复再生过程，涉及多种细胞及细胞因子共同参与。皮肤损伤后通过凝血、肉芽组织再生、上皮组织重塑等一系列反应实现愈合。
3.成纤维细胞、内皮细胞、角质形成细胞、巨噬细胞、血小板等多种细胞共同参与伤口愈合过程。这个过程包括细胞的增殖和迁移，胶原蛋白的产生和血管的形成。皮肤成纤维细胞的激活和增殖是组织修复的中心环节，在伤口愈合过程中发挥重要作用。组织中的成纤维细胞和肌成纤维细胞受到刺激而增殖，然后被炎症细胞和血小板释放的tgf-β和pdgf等因子诱导并迁移到伤口，从而大量增殖并产生基质蛋白透明质酸、纤维连接蛋白、蛋白聚糖以及1型和3型前胶原蛋白。成纤维细胞是细胞外基质生成和重构的重要细胞，有利于创面肉芽组织的形成和愈合。成纤维细胞是细胞外基质生成和重构的重要细胞，有利于创面肉芽组织的形成和愈合。
4.p53抑癌基因是调控细胞周期的转录因子，已有研究报道，p53相关凋亡通路激活致使p53蛋白表达水平增高，这可能是抑制成纤维细胞增殖的主要原因。目前为止，在皮肤创伤修复能力的研究中，现有几种用于创面修复的动物模型均建立在野生型小鼠的基础上，尚未有转基因小鼠作为伤口修复模型的报道。但有研究表明，p53蛋白表达增高可能抑制成纤维细胞的增殖，从而减缓伤口愈合的进程。但突变p53在伤口愈合中的作用尚不明确。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供p53突变基因在筛选促进伤口修复药物中的应用，为皮肤创面治疗及皮肤创面治疗药物的筛选提供了一种新的作用靶点和策略。
6.为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
7.本发明提供了p53
n236s
基因作为分子标志物在筛选促进伤口修复药物中的应用。
8.本发明中p53突变基因是指p53
n236s
(在人类中是p53
n239s
，以下简称为p53s)。
9.优选的是，所述p53s基因的核苷酸序列如seq id no：1所示。
10.本发明还提供了p53s基因表达的蛋白作为分子标志物在筛选或者制备促进伤口修复药物中的应用。
11.优选的是，所述蛋白的氨基酸序列如seq id no：2所示。
12.本发明还提供了一种制备伤口愈合动物模型的方法。
13.优选的是，所述动物模型中敲入所述p53s基因。
14.优选的是，所述p53s基因表达致使p53s蛋白水平增高，p53s蛋白在皮肤创面修复中发挥作用，减缓伤口愈合的进程。
15.本发明还提供了所述制备伤口愈合动物模型的方法在筛选促进伤口修复药物中的应用。
16.本发明公开了以下技术效果：
17.本发明提供p53突变基因在筛选促进伤口修复药物中的应用，并证明p53s突变抑制小鼠皮肤创面修复，提示突变型p53蛋白在皮肤创面修复中发挥作用，以此提供一种新的用于创面修复的动物模型，可以为伤口修复药物的筛选提供新的生物标志物，有很好的科学意义及临床应用价值。
附图说明
18.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
19.图1为p53
s/s
小鼠的基因型鉴定示意图，其中，wt为野生型小鼠基因扩增产物的电泳条带，p53
s/+
为杂合子小鼠基因扩增产物的电泳条带，p53
s/s
为纯合小鼠基因扩增产物的电泳条带，m为maker；
20.图2为p53s突变的小鼠创面修复能力较差；a.经伤口模型建立后第0天和第8天选择野生型小鼠和p53s突变的小鼠创面愈合的代表性图像；b.野生型小鼠(对照组，wt)与p53s突变型小鼠(实验组)在第8天伤口面积大小的量化统计；与对照组相比，p53s突变的小鼠伤口愈合能力明显较弱，p＜0.05，数据以平均值
±
标准差表示(n＝6)，比例尺：1000μm。
具体实施方式
21.现详细说明本发明的多种示例性实施方式，实施例中方法如无特殊说明均采用常规方法，使用试剂如无特殊说明，均为常规市售试剂或采用常规方法配置的试剂。该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
22.应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
23.除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的
文献冲突时，以本说明书的内容为准。
24.在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
25.关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
26.参考“gain of function in the mouse model of a recurrent mutation p53(n236s)promotes the formation of double minute chromosomes and the oncogenic potential of p19(arf)”公开的方法，构建p53
n236s
基因敲入小鼠模型。
27.实施例1p53
s/s
小鼠基因型鉴定
28.一、材料与方法
29.后代出生后21天，按照小鼠的性别进行分笼。同时，对小鼠打耳标进行编号，剪小鼠尾巴约1cm放入写有对应耳标号的doff管，提取小鼠dna，dna提取过程如下：
30.1)在含有小鼠尾巴的doff管中加入500μl tail-lysis buffer，并加入10μl蛋白酶k，混匀后放到55℃恒温箱反应过夜；
31.2)doff管中加入500μl tris-饱和酚用以抽提蛋白；
32.3)13000rpm，4℃离心10min；
33.4)取上清液约400μl到另一干净的doff管中，并加等体积的异丙醇；
34.5)13000rpm，4℃离心10分钟，弃上清；
35.6)在doff管中加入1ml预冷的70％的酒精；
36.7)13000rpm，4℃离心10分钟，弃上清；
37.8)晾干doff管，加100μl灭菌的超纯水溶解dna；
38.9)待dna完全溶解，4℃保存。
39.pcr过程如下：
40.1)pcr引物序列如下：
41.p53s引物序列：
42.neo-f：5
’‑
ctgcaccctacgagaactgactt-3’43.neo-r：5
’‑
gggatgaagtgatgggagctag-3’44.f3：5
’‑
gcataagcttggatccgttcttcggac-3’45.2)pcr反应体系：
46.p53s基因型鉴定pcr反应体系：
47.体系添加量(μl)dna110
×
buffer2dntps(2mm each)1.5neo-r(10μm)0.9neo-f(10μm)0.3f3(10μm)0.3taq0.25
h2o13.75
48.3)pcr反应条件：
49.p53s基因型鉴定pcr反应条件：
[0050][0051][0052]
4)琼脂糖凝胶电泳检测pcr产物
[0053]
pcr反应结束之后，使用2％的琼脂糖凝胶，水平电泳检测pcr产物。
[0054]
电泳的条件：200ma，120v恒压。
[0055]
电泳时间：45min。
[0056]
如图1所示，结果显示，dnaladder条带由上到下依次为750bp、500bp、250bp；p53
s/s
小鼠基因型鉴定pcr产物长度为294bp、634bp；p53
s/+
小鼠基因型鉴定pcr产物长度为294bp、458bp、634bp；野生型(wt)基因型鉴定pcr产物长度为458bp。
[0057]
实施例3伤口愈合实验模型构建
[0058]
(1)2月龄wt小鼠和p53
s/s
小鼠，每组各12只，体重27g-30g之间。
[0059]
(2)麻醉小鼠。80μl～100μl10％戊巴比妥钠或(10％水合氯醛)对小鼠进行腹腔注射。
[0060]
(3)在脊柱两侧对称做直径为4.5mm、深度为皮肤全层的圆形伤口。当天为伤口愈合第0天。
[0061]
(4)伤口愈合第8天，观察伤口愈合情况，拍照并使用imagej软件对伤口面积计算伤口愈合率。愈合率(％)＝(第0天伤口面积-第8天伤口面积)/第0天伤口面积*100。
[0062]
(5)量化统计。使用graphpadprism对伤口面积计算数值计算其均值，标准差，以t检验为标准比较差异性。
[0063]
显示wt小鼠第0天伤口面积为0.133
±
0.003cm2；第8天伤口面积为0.006
±
0.003cm2，伤口愈合率为95.51
±
2.17％。p53
s/s
小鼠第0天伤口面积为0.133
±
0.008cm2；第8天伤口面积为0.046
±
0.014cm2，伤口愈合率为64.31
±
9.40％。p53
s/s
突变的小鼠皮肤伤口愈合情况较差(图2)。
[0064]
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。