一种靶向长链非编码RNA的反义寡核苷酸及其应用

一种靶向长链非编码rna的反义寡核苷酸及其应用
技术领域
1.本发明涉及生物医药领域，特别涉及一种靶向长链非编码rna的反义寡核苷酸及其应用。


背景技术：

2.长链非编码rna(longnoncodingrna，lncrna)是一类长度大于200nt且不具备蛋白质编码能力的rna。因为其不编码蛋白质，很长一段时间，人们误以为lncrna是翻译过程中的“噪音”。随着对lncrna的深入研究，发现lncrna是动、植物体内重要的调节子，其可以在转录、翻译、生长发育，参与非生物胁迫等多个水平上调控基因的表达，成为当前研究的热点。
3.皮肤黑色素瘤是黑色素细胞发生突变形成的恶性肿瘤，具有高度侵袭性，进展快，致死率高，为一种最具威胁性的皮肤肿瘤。另外，该病在全球各地的发病率呈逐年递增趋势。近年来，随着诊疗技术的不断进步，针对braf，c-kit等基因突变的靶向治疗以及以pd-1，ctla-4为代表的免疫治疗使皮肤黑素瘤患者的死亡率等到一定程度的缓解，但治疗效果仍不理想。一方面，部分病人仍缺乏临床上可靶向的基因，另外大量患者对靶向，免疫治疗等治疗手段的应答率低或易产生耐药复发，毒副作用大等。因此，研发新的分子标志物，治疗靶点及干预药物和手段仍是仍是黑素瘤领域的研究重点。
4.近年来越来越多的研究表明lncrnas在黑素瘤的发生发展以及药物耐受中发挥重要作用，可参与调节多种细胞生物学活动，包括细胞增殖，凋亡，迁移与侵袭，能量代谢，新血管生成等。抑制或过表达一些lncrna能够起到抗癌的作用。靶向lncrna的表达或功能可为皮肤黑素瘤的治疗提供了一种新的策略。另外，lncrnas具有较高的组织特异性、高效率和高稳定性，有望成为诊断和预后的潜在治疗靶点和生物标志物。


技术实现要素：

5.本发明所要解决的技术问题：提供干预linc00520基因的反义寡聚核苷酸以及靶向linc00520基因的反义寡聚核苷酸在制备治疗皮肤黑色素瘤药物中的应用。
6.为解决上述技术问题，本发明提供以下的技术方案：
7.一种靶向长链非编码rna的反义寡核苷酸，所述反义寡核苷酸序列与linc00520转录物内的核酸片段序列至少85％互补，所述反义寡核苷酸的序列长度为10至30个核苷酸。
8.优选地，所述反义寡核苷酸包含如下序列：5
′‑
gttct tgtga attgc agtcc-3
′
；5
′‑
atagg tctct tgaaa catgg-3
′
；5
′‑
ggttt gctga gctgt agaat-3
′
中的至少一种。
9.一种linc00520抑制剂，包含上述反义寡核苷酸，所述反义寡核苷酸与linc00520转录物特异性结合并抑制linc00520基因表达。
10.一种抗皮肤黑色素瘤药物组合物，包含上述反义寡核苷酸，以及药学上可接受的载体，稀释剂或赋形剂；所述载体包括慢病毒载体，腺病毒载体，或其他非病毒质粒载体。
11.本发明获得的有益效果：
12.本发明通过靶向长链非编码rna linc00520设计并合成aso，其能够降低linc00520的表达水平，并且显著抑制皮肤黑素瘤细胞的增殖，迁移和侵袭能力，对于开发新的抗皮肤黑素瘤基因药物具有重要意义，具有广阔的应用前景和巨大的经济价值。
附图说明
13.图1表示通过rt-qpcr检测发现linc00520在皮肤黑素瘤组织和细胞中表达显著上调。其中，以gapdh作为内参照。左上图显示相对于皮肤痣，linc00520在皮肤黑素瘤中明显表达上调。group 1:皮肤痣；group2:皮肤黑素瘤。***p《0.001。右上图表示linc00520在皮肤黑素瘤细胞中表达升高。mc：人原代皮肤黑素细胞(human primary melanocyte)。左下图，右下图分别为代表性扩增曲线及linc00520引物的熔解曲线。
14.图2显示aso可以抑制人皮肤黑素瘤细胞内linc00520基因的表达。相对于阴性对照转染组，aso-520-1，aso-520-2，aso-520-3可下调人皮肤黑素瘤细胞内linc00520的表达水平。
15.图3显示通过cck8实验检测linc00520-aso转染后对皮肤黑素瘤细胞增殖的影响。相对于空白转染组(blank)及阴性对照转染组(negative control),linc00520-aso(aso-520)可显著抑制皮肤黑素瘤细胞的增殖。**p《0.01。
16.图4显示linc00520-aso转染皮肤黑素瘤细胞48h后，经transwell实验检测发现，相对于空白转染组(blank)及阴性对照组(negative control)，黑素瘤细胞的迁移及侵袭能力均显著下降。**p《0.01。
具体实施方式
17.下面通过对实施例的描述，对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明，以帮助本领域的技术人员对本发明的发明构思、技术方案有更完整、准确和深入的理解。
18.实施例1：实时定量pcr检测linc00520在皮肤黑素瘤组织和细胞中的表达
19.1实验材料
20.本发明所用人皮肤黑素瘤细胞a375、sk-mel-28，mv3购自中科院细胞库，人原代皮肤黑素细胞mc为本实验室保存。高糖dmem液体培养基，胎牛血清和胰酶购自invitrogen公司。20例皮肤黑素痣及30例皮肤黑素瘤组织为中国医学科学院皮肤病医院皮肤生物样本库保存，均经病理组织学确诊，采集样本过程严格遵守人体试验规定，满足伦理委员会标准及签署患者知情同意书。
21.2实验方法
22.1)细胞培养：细胞采用含10％胎牛血清的高糖dmem培养基，细胞放置于37℃、95％湿度、5％co2浓度的恒温培养箱内培养，当细胞生长至融合度为80-90％左右时，胰酶消化并传代或冻存，取生长状态良好的细胞用于实验。
23.2)组织/细胞rna提取：
24.①
取50-100mg组织(新鲜或-80度冰箱保存的组织)置于1.5ml离心中，加入1ml trizol充分匀浆，室温静置5min。对于细胞，则收获1-5
×
107个细胞，加入1ml trizol,混匀，室温静置5min。
25.②
加入200ul氯仿，振荡15s，静置2min。
26.③
4℃离心,12000g，15min,取上清。
27.④
加入0.5ml异丙醇，混匀，室温静置10min。4℃离心，12000g，10min,弃上清。
28.⑤
加入1ml 75％乙醇轻轻洗涤沉淀。4℃，7500g，离心5min，弃上清。可重复洗涤离心一次。
29.⑥
去上清，吸干痕量液滴，风干10min左右。让乙醇挥发干净，但不可过度干
30.燥，影响溶解和rna质量。
31.⑦
用20-50ul depc处理水溶解rna，充分溶解后，吸出1ul测od值。
32.3)rt-qpcr
33.(a)逆转录反应
34.使用takara公司的prime script tmrt reagent试剂盒进行反转录，包括去除基因组dna和反转录两个过程，具体步骤如下所示：
35.a)去除总rna中的基因组dna的反应：配置体系为5
×
gdna eraser buffer 2ul+gdna eraser1.0ul+total rna(xul)+rnase free dh2o(7-x)ul＝10ul的溶液，混匀后42℃孵育2min，然后置于4℃环境中保存。
36.b)逆转录反应：步骤a的反应液+primerscript rt enzyme mix i 1ul+rt primer mix1ul+5xprimescript buffer 2 4ul+rnase free dh2o 4ul＝20ul,混匀后置于37℃孵育15min，再于85℃5s，完成逆转录形成cdna，最后置于4℃环境中保存。
37.(b)real-time pcr反应
38.以上述步骤中反转录所得的cdna为模板，使用takara公司的sybr premix ex taq ii试剂盒进行实时定量pcr反应。real-time pcr 20μl反应体系包括：配制h2o 6μl+2μl cdna+sybr premix ex taq ii 10.4μl+上游引物(10um)0.8μl+下游引物(10um)0.8μl＝20μl的反应体系。其中引物序列为：linc00520正向引物:5
′‑
cttgatgagcctggcatggagt g-3
′
,linc00520反向引物:5
′‑
ggtccaagtcacaagaagtccaagg-3
′
；gapdh正向引物5
′‑
gtcaa cggatttggtctgtatt-3
′
，gapdh反向引物5
′‑
agtcttctgggtggcagtga t-3
′
。
39.real-time pcr反应在96孔板孵育,采用applied biosystems 7300 sequence detection system。第一步95℃30秒，1个循环；第二步95℃5秒,60℃31s，40个循环。每组设置三个重复孔，相对定量计算公式为:目标基因的表达量＝2-(ct目标基因
–
ct gapdh)
。
40.结果如图1所示：linc00520基因在人皮肤黑素瘤组织中的表达水平显著高于皮肤痣；另外相对于人原代黑素细胞,linc00520在皮肤黑素瘤细胞中mv3，a375，sk-mel-28也存在着表达上调。实时定量pcr扩增曲线显示整体平行性好,扩增曲线拐点清楚，极限平而无上扬存在，曲线指数期斜率较大，说明扩增效率较高；样本扩增产物熔解曲线为单峰，表明扩增产物唯一，是特异性扩增。
41.实施例2：aso对黑素瘤细胞内linc00520表达抑制的检测
42.1、靶向linc00520的aso序列的设计和合成：通过ncbi数据库获得linc00520基因序列以及idt公司提供的antisense design设计软件(http://www.idtdna.com/scitools/applications/antisense/antisense.aspx？source＝menu)，设计靶向人linc00520基因的反义寡核苷酸干扰序列并送中国广州锐博生物科技有限公司合成。无义序列对照寡核苷酸由广州锐博生物公司合成。
43.aso-520-1序列为5
′‑
gttcttgtgaattgcagtcc-3
′
；
44.aso-520-2序列为5
′‑
ataggtctcttgaaacatgg-3
′
；
45.aso-520-3序列为5
′‑
ggtttgctgagctgtagaat-3
′
；
46.无义序列对照序列为5
′‑
agaagtccaaccacacttag-3
′
47.2、aso转染
48.将皮肤黑素瘤细胞接种于6孔板中，24h细胞贴壁后可进行转染。按照invitrogen公司lipofectamine 2000说明操作，操作如下：
49.(1)将linc00520-aso以及无义对照序列分别溶于250μl无血清的opti-mem reduced serum medium中，混合均匀。在室温下孵育5分钟。
50.(2)取5μl lipofectamine 2000溶于250ul opti-mem中，轻轻混匀。
51.(3)将上述两者轻轻混合均匀在室温下孵育20分钟(可能出现雾状沉淀)。
52.(4)将上述混合液加入每个细胞培养孔，十字法混合均匀，使aso终浓度为100nmol/l。
53.(5)细胞培养6小时后更换为正常培养液，继续培养进行后续试验。
54.本实施例中的转染操作也可以利用慢病毒载体，腺病毒载体，或其他非病毒质粒载体进行。这些载体均为市售，转染操作均为常规技术。
55.3、rt-qpcr检测寡核苷酸序列对细胞内linc00520表达的影响：
56.细胞转染48h后，按照实施例1中的方法提取细胞rna后对细胞内linc00520的表达通过rt-qpcr进行检测及结果分析。
57.结果如图2所示，与阴性对照组相比，转染aso的细胞中linc00520的表达水平明显下降，其中转染aso-520-1下降最为明显，表达量仅为对照的35％，具体见图2。采用aso-520-1进行后续的实验。
58.实施例3：细胞增殖能力的检测：
59.收集指数生长期状态良好的细胞种到96孔板，调整细胞悬液浓度，使细胞密度在30％左右，每组设置6个复孔转染不同的rna片段，5％c02，37℃培养。转染24h、48h、72h、96h后，每孔加入10％体积的cck-8试剂，于细胞培养箱内孵育3h后用酶标仪测定450nm吸光值(od450 nm)。实际od450为各组od值与空白组od值之差。每组取各复孔平均值，然后绘制增殖曲线，该试验重复3次。实验结果进行统计学分析。
60.cck8细胞增殖实验结果如图3所示，与空白转染及无义序列转染组相比，linc00520-aso转染组细胞的增殖能力明显下降，增殖能力差异具有统计学意义(p《0.01)，具体见图3。
61.实施例4细胞迁移侵袭能力检测(transwell法)
62.细胞迁移实验根据transwell cell culture system的方法进行。消化收集皮肤黑素瘤细胞系，细胞计数，用dmem调整浓度至2
×
105个/ml。在小室的下室加入含有胎牛血清的培养液500μl/室作为趋化因子。上室内滴入上述细胞悬液100μl/室(即2
×
104个细胞/室)，37℃，5％co2条件下培养24h。弃去上室液体，将膜轻轻取出，用湿棉签擦去膜表面未侵袭的细胞，整个transwell在10％的福尔马林中室温固定30分钟，结晶紫染色20分钟[1％的结晶紫，含2％乙醇的100mm硼酸缓冲液(ph值9.0)]，水洗三遍，然后在100
×
的显微镜下计数拍照，每张膜计数10个视野下的穿膜细胞数，取其平均值进行统计学分析，每组设计3个平行实验。对于侵袭实验，transwell小室提前用matrigel进行包被，具体操作为用已预冷
的不含血清的dmem培养基来稀释matrigel基质胶(培养基：matrigel＝5:1)，快速充分混匀后立即包被transwell小室内室，37℃干燥2h。其余实验步骤同迁移实验操作。采用单因素方差分析，p《0.05为差异有统计学意义。transwell体外迁移侵袭实验结果如图4所示，相对于空白转染及无义序列转染组，linc00520 aso转染组细胞的迁移侵袭能力明显下降，linc00520组细胞的迁移和侵袭细胞数分别为无义对照转染组的53％和32％，差异具有统计学意义(p《0.01)。
[0063]
综上所述，上述实验结果表明，本发明提供的特异靶向长链非编码linc00520的aso具有良好的抑制效果，并且敲低linc00520后能够显著抑制皮肤黑素瘤细胞的增殖、迁移和侵袭能力，靶向长链非编码rna linc00520的aso可用于开发新的抗皮肤黑素瘤的基因药物，具有重要意义和广阔的应用前景及巨大的经济价值。
[0064]
以上实施例仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明保护范围之内；本发明未涉及的技术均可通过现有技术加以实现。