环状RNAcircCLTH在促进骨骼肌细胞增殖或分化中的应用

环状rna circclth在促进骨骼肌细胞增殖或分化中的应用
技术领域
1.本发明属于家畜分子育种技术领域。更具体地，涉及一种环状rna circclth在促进骨骼肌细胞增殖或分化中的应用。


背景技术：

2.牛肉是全球消费的主要肉产品之一，其富含高蛋白，对人体健康有益。随着国人消费水平的提高，高品质牛肉供不应求，巨大的市场缺口为我国牛肉产业发展提供了契机。我国水牛存栏量仅次于印度，是第二大养殖国家。水牛性格温顺耐粗饲，可以为人类提供肉、蛋、奶资源。但是，我国本地水牛(沼泽型)生长速度慢，育种情况不容乐观。因此，如何提高我国本地水牛生长速度，提高我国优质牛肉的自给能力，是目前畜牧业亟待解决的难题。
3.肌肉发育是影响家畜生长与经济效益的重要因素，直接影响肉质、风味和营养价值。然而，肌肉发育的分子机理研究基础还很薄弱，限制了肉牛分子育种的发展。另随着动物遗传育种由传统向分子育种时代的转变，重要经济性状的生物学规律及其分子调控机制已成为指导分子育种的关键问题。因此，阐明肌肉发育调控机制，对家畜肉质改良、精准分子育种以及提高畜牧业的竞争力等具有重要意义。在肌肉组织中，骨骼肌占胴体重量的50％～60％，是供人类食用的主要部分，骨骼肌的特性也直接影响着肉类品质。骨骼肌细胞是一种处于增殖状态的肌肉前体细胞，能够增殖和分化并成熟为肌纤维形成骨骼肌组织，提高骨骼肌细胞的增殖和骨骼肌分化能力，将有助于提高牛肉产量和品质。
4.环状rna(circrnas)是一种内源性非编码rna，没有5’端帽子和3’端poly(a)尾巴，由共价键形成封闭环状。与线性rna相比，circrna的结构更稳定，且不易被核酸外切酶降解。现有技术中虽有关于羊骨骼肌发育相关的circrna的报道，但尚未见与水牛骨骼肌细胞增殖与骨骼肌分化相关的circrna的报道。


技术实现要素：

5.本发明要解决的技术问题是克服现有上述技术的缺陷和不足，提供环状rna circclth在促进骨骼肌细胞增殖或分化中的应用。
6.本发明的第一个目的是提供环状rna circclth在促进骨骼肌细胞增殖或分化中的应用。
7.本发明的第二个目的是提供含有环状rna circclth的质粒在促进骨骼肌细胞增殖或分化中的应用。
8.本发明的第三个目的是提供所述环状rna circclth在促进牛肌肉发育中的应用。
9.本发明的第四个目的是提供所述含有环状rna circclth的质粒在促进牛肌肉发育中的应用。
10.本发明的第五个目的是提供所述环状rna circclth在肉牛分子育种中的应用。
11.本发明的第六个目的是提供一种促进骨骼肌细胞增殖或分化的方法。
12.本发明上述目的通过以下技术方案实现：
13.本发明所述circclth来源于沼泽型牛(水牛)的clth基因，由三个外显子组成，长度为347nt，其核苷酸序列如seq id no.1所示。rnase r耐受性分析表明，所述circclth具备环形分子的一般特征，不易被rnase r降解；另与oligo d(t)18引物相比，随机引物对circclth具有较高的反转录效率，说明circclth是一个不含poly(a)的环状结构分子，也进一步证明本发明所述circclth确为环状rna。
14.本发明通过在水牛骨骼肌细胞中转染circclth过表达载体发现，在水牛骨骼肌细胞中过表达circclth可以使骨骼肌细胞的增殖标志基因和分化标志基因发生显著上调，表明过表达环状rna circclth可以促进骨骼肌细胞的增殖或分化。另结合rna pull down和质谱检测等，证实了circclth是一个细胞质内主要表达的circrna，且circclth可能通过结合plec蛋白调控水牛骨骼肌细胞的增殖或分化。
15.因此，本发明申请保护所述环状rna circclth在促进骨骼肌细胞增殖或分化中的应用，所述circclth的核苷酸序列如seq id no.1所示。
16.本发明还申请保护含有seq id no.1所示环状rna circclth的质粒在促进骨骼肌细胞增殖或分化中的应用。
17.具体地，在处于增殖状态的骨骼肌原代细胞中过表达circclth可以促进骨骼肌细胞的增殖；若在细胞贴壁密度为80％～90％的时候对其进行体外诱导分化，使骨骼肌细胞处于分化状态，则过表达circclth可以促进骨骼肌细胞的分化。
18.具体地，所述骨骼肌细胞为牛骨骼肌细胞。
19.更具体地，所述骨骼肌细胞为水牛骨骼肌细胞。
20.鉴于本发明所述环状rna circclth可以促进骨骼肌细胞的增殖或分化，而骨骼肌细胞是肌肉的重要组成部分。因此，本发明还申请保护所述环状rna circclth在促进牛肌肉发育中的应用。
21.本发明还申请保护含有所述环状rna circclth的质粒在促进牛肌肉发育中的应用。
22.本发明还申请保护所述环状rna circclth在肉牛分子育种中的应用，可利用所述环状rna circclth提高肉牛的牛肉产量。
23.本发明还提供了一种促进骨骼肌细胞增殖或分化的方法，所述方法为提高circclth在骨骼肌细胞中的表达水平；所述circclth的核苷酸序列如seq id no.1所示。
24.具体地，所述提高circclth在骨骼肌细胞中的表达水平是通过构建含circclth的超表达载体，再转入骨骼肌细胞中实现的。
25.具体地，所述骨骼肌细胞为牛骨骼肌细胞。
26.更具体地，所述骨骼肌细胞为水牛骨骼肌细胞。
27.具体地，所述超表达载体为pcd2.1-cir。
28.具体地，所述方法包括牛骨骼肌细胞的分离培养、体外骨骼肌诱导分化模型的建立以及骨骼肌分化前后circclth表达的检测。
29.作为一种可选择的实施方式，本发明采用胰酶和胶原酶联合消化的方法分离牛骨骼肌细胞，建立牛骨骼肌细胞体外骨骼肌诱导分化模型；采用qpcr方法检测牛骨骼肌细胞分化前后circclth的表达量。
30.利用环状rna circclth在体外促进牛骨骼肌细胞增殖或分化时，所用骨骼肌细胞
优选为牛原代骨骼肌细胞。
31.本发明具有以下有益效果：
32.本发明从水牛中发现并克隆了一种与其肌肉发育有关的环状rna circclth，利用所述circclth，通过在水牛骨骼肌细胞中提高circclth的表达量，即可促进水牛骨骼肌细胞的增殖或分化。本发明不仅提供了环状rna circclth在促进水牛骨骼肌细胞增殖或分化中的应用，同时提供了一种促进水牛骨骼肌细胞增殖或分化的方法，不仅有助于水牛骨骼肌细胞的增殖和分化培养，也有助于水牛骨骼肌发育相关基因的体外研究及水牛的分子育种。
附图说明
33.图1为本发明实施例1中分离培养的水牛骨骼肌细胞在不同时期的显微照片。
34.图2为circclth对rnaes r的耐受性分析结果及rna-fish定位分析结果；其中，图a为circclth对rnaes r的耐受性分析结果；图b为pcr检测水牛的cdna和基因组dna结果；图c为circclth的rna-fish定位分析结果。
35.图3为circclth重组质粒的示意图及circclth在水牛不同发育阶段的组织中的表达量检测结果；其中，图a为pcd2.1-cir质粒和pcd2.1-circclth重组质粒的示意图；图b为牛骨骼肌细胞分化0、2、4、6、8天时circclth的表达量检测结果；图c为水牛成年期组织中circclth的表达量检测结果；图d为水牛胚胎期组织中circclth的表达量检测结果。
36.图4为过表达circclth对水牛骨骼肌细胞增殖的作用结果；其中，图a为增殖阶段水牛骨骼肌细胞中过表达circclth的效率检测结果；图b为增殖标志蛋白cyclind1、pcna的免疫印记检测结果；图c为分化标志基因cyclind1、pcna和cdk2的qpcr检测结果；图d和图e为edu检测细胞增殖结果；图f和图g为细胞周期检测细胞增殖结果。
37.图5为过表达circclth对水牛骨骼肌细胞分化的作用结果；其中，图a为分化阶段水牛骨骼肌细胞中过表达circclth的效率检测结果；图b为分化标志蛋白myhc的免疫荧光检测结果；图c为分化标志基因myod和myhc的qpcr检测结果；图d为myhc蛋白表达的免疫印迹检测结果。
38.图6为分离培养的水牛骨骼肌细胞在转染了pcd2.1-cir和pcd2.1-circclth后诱导4天的显微照片。
具体实施方式
39.以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
40.除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
41.主要试剂：2
×
taq pcr starmix with loading dye(北京康润诚业生物科技有限公司，genstar)；凝胶dna回收试剂盒、去内毒质粒小提试剂盒(omega)；bamh i、kpn i限制性内切酶(takara)；t4 dna连接酶(thermo)；turbofect transfection reagent(thermo)；cck-8cell counting kit、hiscript iii rt supermix for qpcr(+gdna wiper)、2
×
cham qtm universalqpcr master mix(诺唯赞)；cell cycle staining kit(联科生
物)；一抗pcna、cyclind1(万类生物公司)；myhc(genetex)；二抗anti-mouse、anti-rabbit(proteintech)；fitc goat anti-mouse igg(h+l)(abclonal)；goat anti-rabbit igg(h+l)secondary antibody,alexa fluor 488-5nm colloidal gold(thermo)；10
×
转膜缓冲液、water-depc treated water(生工)；1m dna提取酚试剂、tris-hcl(ph＝8.0)、ripa裂解液、pmsf蛋白酶抑制剂、4
×
蛋白上样缓冲液(含dtt)(索莱宝)；ecl超敏发光液a、ecl超敏发光液b(索莱宝)；抗荧光淬灭封片剂(servicebio)；杂交缓冲液(servicebio)；4％多聚甲醛(servicebio)；20
×
ssc洗脱液(servicebio)；bsa(servicebio)；蛋白酶k(servicebio)；dapi(servicebio)；pierce rna 3’desthiobiotinylation kit、pierce
tm magnetic rna-protein pull-down kit(美国，thermo scientific)。
42.实施例1牛骨骼肌细胞的分离培养以及体外骨骼肌诱导分化模型的建立
43.1、牛骨骼肌细胞的分离培养
44.1)用75％的医用酒精棉将胎牛背最长肌表面皮肤擦拭消毒，再用高压灭菌过的眼科剪剪开皮肤，剪开背部筋膜组织，用弯镊子取出背最长肌组织，pbs冲洗两次，再用75％酒精漂洗约10s，然后再用灭菌过的超纯水冲洗两次，置于无菌平皿中；
45.2)用镊子夹取样品，在灭菌超纯水中清洗3次，然后用75％的酒精漂洗约10s，再用灭菌过的超纯水漂洗2次，在含2％青链霉素的pbs中洗3次；
46.3)用灭菌过的眼科剪尽可能剪碎组织，加入适量1％青链霉素的pbs重悬组织，恒温静置3min，弃去上清；将剪碎的组织转移至50ml离心管中，加入2倍体积的0.2％roche i型胶原酶，吹打混匀，封口，置于水平摇床，37℃，200rpm/min条件下震荡消化1h，然后1500rpm/min离心5min，弃上清，加入2倍体积的0.25％胰蛋白酶，置于恒温摇床，37℃条件下消化20min，最后加入细胞两倍体积的完全培养基终止消化；
47.4)将消化好的细胞悬液取出，在超净台中用70μm细胞筛过滤两次，40μm细胞筛过滤一次，转移至新的50ml离心管中，1500rpm/min离心5min；弃上清液，加入原代培养基以重悬细胞，将细胞接种到60mm培养皿中，置于37℃，5％的co2培养箱中培养。
48.2、体外骨骼肌诱导分化模型的建立
49.1)将分离到的骨骼肌细胞在培养箱中培养2h后，将细胞悬液转入新的60mm培养皿中继续培养，必要时可重复此步骤2～3次，24h后更换液体，去除血细胞及未贴壁的死细胞，并观察细胞生长情况；
50.2)待牛肌细胞增殖密度达80～90％，弃去完全培养基，然后用pbs清洗2次后，更换含有2％血清的诱导培养基，进行诱导分化培养，并通过显微镜观察，记录细胞状态。
51.本实施例分离培养的水牛骨骼肌细胞在不同时期的显微照片如图1所示，由图1可知，分离得到的水牛骨骼肌细胞经诱导后可以分化并融合形成肌管，表明分离得到的原代细胞为骨骼肌细胞，可以定向分化，用于建立体外骨骼肌诱导分化模型，用于体外研究。
52.实施例2 circclth的真实性验证及rna-fish定位
53.本发明所述circclth来源于沼泽牛(水牛)clth基因，由三个外显子组成，长度为347nt，其核苷酸序列如下(seq id no.1)所示：gcccccagtagtcttcttgatgctttggaacaacatttagcttccttggaaggaaagaaaatcaaagattctacagctgcaagcagggcaacaacactttccaacgcagtctcttccctggcaagcactggcctgtctcttaccaaagtggatgaaagggaaaagcaggcagcattagaggaagaacaggctcgtttaaaagctttaaaggagcagcgcctaaaagaacttgcaaagaaacctcatacctctttaacaactgcagcc
tctcctgtgtccacctcagcagggagtgtaatgactgcaccagccattgacatattttctacccctagttcttctaacag
54.本实施例分别通过rnase r消化法和rt-pcr验证了本发明所述circclth的真实性。
55.1、rnase r消化法验证
56.rnase r可以消化几乎所有的线性rna分子，但不易消化环状rna、套索结构和3’突出末端少于7个核苷酸的双链rna分子。因此，可通过电泳和qpcr检测目的rna对rnase r的耐受性，以验证circrna的真实性，排除反式剪接和基因组重排的可能性。
57.本发明所述circclth经rnase r消化后的电泳和qpcr检测结果如图2a所示。由图2a可知，rnase r不能降解本技术所述circclth；qpcr检测结果表明，虽circclth的丰度有一定降低，但线性的β-actin的丰度降低幅度更为明显，差异极显著，证明了本发明所述circclth的真实性。
58.2、rt-pcr验证
59.将水牛增殖期和分化期的成肌细胞混合后，分别提取其基因组dna(gdna)和cdna；circrnas是由外显子和(或)内含子的5’端和3’端环化而来，根据该特点，本发明以所述circclth的全长序列为模板，设计合成了circclth的跨越接头序列的背向引物和序列的正向引物；所述引物的序列分别如下所示：
60.circclth(正向引物)
61.f：cctgtctcttaccaaagtggatg
62.r：ctggtgcagtcattacactcc
63.circclth(背向引物)
64.f：aaggagcagcgcctaaaaga
65.r：actactgggggcctgttaga
66.分别以提取的gdna和cdna为模板，用设计的引物扩增circclth的接头序列及部分clth基因的外显子序列，结果如图2b所示。由图2b可知，用cdna做模板时，设计的两对引物均有产物，用gdna做模板时，只有正向引物具有产物，结果表明检测的rna不是由基因重组产生的，从而验证了本发明所述circrna的真实性。结合图2a和2b所示结果可知，本发明所述circclth是反向成环，并且是真实存在的。
67.3、rna-fish
68.本发明通过rna-fish试验检测了circclth在水牛成肌细胞中的定位。具体步骤为：
69.1)根据circclth接头处序列设计cy3标记的荧光探针，设计的探针序列为：circclth probe：5
’‑
cy3-tactctgctaatttcttcttcttatccctc-cy3-3’70.2)准备试验细胞；将载玻片用酒精消毒，再用pbs清洗3次，置于大小合适的细胞平皿，然后接种细胞，待细胞密度达50～60％，用4％多聚甲醛将细胞爬片样品固定30min，再用pbs清洗；
71.3)用基因笔画圈，根据成肌细胞的特性，滴加蛋白酶k(20μg/ml)消化5min；
72.4)再用pbs清洗后，加入预杂交液于细胞培养箱孵育1h，然后弃去预杂交液，滴加探针circclth probe浓度为8ng/μl的杂交液于细胞培养箱杂交过夜；
73.5)洗去杂交液，用2
×
ssc 37℃震荡清洗10min，1
×
ssc 37℃清洗2次，0.5
×
ssc 37℃震荡清洗10min；
74.6)最后加入dapi染液，避光孵育8min，清洗后加入抗荧光淬灭封片剂进行封片，并在荧光显微镜下观察拍照。
75.circclth的rna-fish定位分析结果如图2c所示，rna-fish结果显示circclth的定位主要位于细胞质中。
76.实施例3 circclth的表达特性检测
77.1、采集样品用于构建circclth组织表达谱
78.本实施例所用胎牛及成年牛各组织均采集于广西壮族自治区南宁市西乡塘区鲁班路屠宰场，分别采集胎牛3月龄和成年牛3年的心、肝、脾、肺、肾、腿肌和背最长肌样品，立即置于液氮中速冻保存备用；
79.2、水牛不同时期骨骼肌细胞中circclth的表达
80.参照实施例1所述牛骨骼肌细胞的分离培养方法对分离得到的水牛骨骼肌细胞进行培养，待细胞密度达到70％～80％，将生长培养基(含10％fbs的dmem)更换为诱导培养基(含2％hs的dmem)，分别在诱导0、2、4、6和8天后收取骨骼肌细胞，用于检测水牛不同时期骨骼肌细胞中circclth的表达情况，结果如图3b所示。由图3b可知，水牛不同时期骨骼肌细胞中circclth的表达量无显著差异。
81.3、水牛各组织及细胞总rna的提取
82.1)取液氮中保存的组织样品(或细胞)放于液氮预冷的研体中同液氮一起研磨至粉末状，向样品(约100mg)中加入1ml于4℃下预冷的trizol并剧烈震荡摇匀，置于冰上裂解5min；
83.2)加入200μl氯仿，剧烈震荡15s，冰上静置5min，4℃下12000rpm/min离心15min；
84.3)准备新的1.5ml ep管，取上清，按照1:1的比例加入预冷的异丙醇，轻柔混匀，冰浴5min，4℃下12000rpm/min，离心10min；
85.4)弃上清，加入75％的乙醇，颠倒混匀，4℃下12000rpm/min离心8min；
86.5)弃上清，于超净台风干1min，加入20μl的depc水冰上溶解5min。
87.4、反转录cdna合成
88.1)除去基因组dna；取新鲜rnase-free的1.5ml离心管中配置混合液如下：模板rna(总rna：1pg～1μg)、4
×
gdna wiper mix 4μl、rnase-free ddh2o(to 16μl)，涡旋混匀，反转录pcr仪42℃，2min；
89.2)配制逆转录反应体系；在第一步的反应管中直接加5
×
hisscriptⅲqrt super mix 4μl、第一步反应液16μl，涡旋混匀；
90.3)进行逆转录反应；程序：37℃，15min；85℃，5s；产物可立即用于qpcr反应或在置于-20℃低温冰箱保存备用。
91.5、实时荧光定量pcr
92.针对所述circclth的碱基序列，在环化接头序列处设计特异性引物，通过qrt-pcr分析circclth的时空表达特性和组织特异性，引物交由上海生物工程科技有限公司公司合成。本发明所用qpcr引物如下所示：
93.上游(primer1)：aaggagcagcgcctaaaaga
mix 4μl，涡旋混匀；
125.3)进行逆转录反应；程序：37℃，15min；85℃，5s；产物可立即用于qpcr反应或在置于-20℃低温冰箱保存备用。
126.4、qpcr检测
127.1)对实施例1中分离得到的骨骼肌细胞进行诱导分化的形态学观察及分子定量检测，收集增殖期(诱导分化0day)及分化期(诱导分化6day)的牛骨骼肌细胞，利用qpcr检测牛骨骼肌细胞及骨骼肌分化后的细胞在的circclth表达情况；根据引物设计的基本原理，为相关基因设计必要的引物；环状rna circclth的引物根据其结构特点设计跨接头的背向引物，并由上海生物工程科技有限公司公司合成。引物序列具体如表1所示：
128.表1引物序列
[0129][0130][0131]
2)实时荧光定量pcr
[0132]
在qpcr管中配制如下混合液：
[0133][0134]
按下列条件进行qpcr反应：
[0135]
反应程序如下表所示：
[0136][0137]
该试验所用内参用基因为β-actin基因，基因的相对表达量通过进行计算，每个基因分别设置3个生物学重复和技术重复。
[0138]
5、western blot检测过表达circclth后分化相关标志蛋白的表达
[0139]
收集细胞，用pbs清洗六孔板内细胞2次，加入100μl含有1％pmsf的ripa裂解液，然后冰上裂解30min，转移至1.5ml无酶离心管；4℃12000
×
g离心10min，转移上清至新的1.5ml无酶离心管，蛋白样品于-20℃保存；测量时用bca试剂盒检测蛋白浓度，并加入4
×
蛋白上样缓冲液于沸水中加热变性约15min；根据检测蛋白大小配制配置合适浓度蛋白电泳胶，根据试验分组和蛋白浓度计算，加入蛋白量一致的变性蛋白样品，先60v电压电泳约40min，再用80v电压继续电泳直至结束；用成像系统检测对照组和实验组蛋白量是否一致。
[0140]
分割目的蛋白处电泳胶和略大些的pvdf膜，再用转膜缓冲液平衡电泳胶和pvdf膜10min，按照滤纸-pvdf膜-胶的顺序采用湿转法进行转膜，计算转膜面积以确定电流恒流转膜；配置5％脱脂奶粉室温下震荡摇床封闭约2h；用抗体稀释液配置一抗4℃冰箱孵育过夜，然后tbst清洗3次，每次10min，再用tbs清洗1次，10min；tbst配置二抗稀释液孵育2h后，tbst清洗3次，每次10min，再用tbs清洗1次，10min；
[0141]
将膜置于显色板上，滴上混合的ecl显色液a和b，在chemidoc xrs+system成像系统下成像。
[0142]
过表达circclth对水牛骨骼肌细胞增殖的影响结果图4所示。其中，图4a为增殖阶
段水牛骨骼肌细胞中过表达circclth的效率检测结果，由图4a所示结果可知，在增殖的水牛骨骼肌细胞中，circclth的表达量与对照组差异极显著，证明过表达效果较好。图4b为cyclind1、pcna蛋白表达的免疫印记检测结果，由图4b所示结果可知，过表达circclth能够促进牛骨骼肌细胞的增殖标志蛋白pcna和cyclind1的表达。图4c为分化标志基因cyclind1、pcna和cdk2的qpcr检测结果，由图4c所示结果可知，过表达circclth能够促进牛骨骼肌细胞的增殖标志基因pcna、cdk2和cyclind1的表达；图4d和图4e为edu检测细胞增殖结果；图4f和图4g为细胞周期检测细胞增殖结果，由图4d～4g的edu和细胞周期检测细胞增殖结果可知，过表达circclth能够促进牛骨骼肌细胞的增殖。
[0143]
过表达circclth对水牛骨骼肌细胞分化的作用结果如图5所示；其中，图5a为分化阶段水牛骨骼肌细胞中过表达circclth的效率检测结果，由图5a可知，在分化的水牛骨骼肌细胞中，circclth的表达量与对照组差异极显著，证明过表达效果较好。图5b为myhc蛋白表达的免疫荧光检测结果，图5d为myhc蛋白表达的免疫印迹检测结果，由图5b和5d所示结果可知，过表达circclth能够促进牛骨骼肌细胞的分化标志蛋白myhc的表达。图5c为分化标志基因myod和myhc的qpcr检测结果；由图5c可知，过表达circclth能够促进牛骨骼肌细胞的分化标志基因myod和myhc的表达。
[0144]
上述结果表明，过表达circclth能够促进牛骨骼肌细胞的增殖或分化。
[0145]
分离培养的水牛骨骼肌细胞在转染了pcd2.1-cir和pcd2.1-circclth后诱导4天的显微照片如图6所示，由图6可知，过表达circclth促进了骨骼肌细胞中肌管的形成，从表型结果层面表明过表达circclth能够促进牛骨骼肌细胞的分化。
[0146]
实施例6 rna pull down和质谱检测
[0147]
本发明共采集了1
×
107个水牛骨骼肌细胞进行rna拉下(rna pull down)分析。circlth探针由生工生物技术有限公司合成，探针序列如表2所示：
[0148]
表2 rna pull down探针序列
[0149][0150]
具体步骤如下：
[0151]
1)生物素标记探针制备：合成生物素标记的探针，由广州锐博生物公司合成；
[0152]
2)亲和素磁珠制备：轻摇混匀，取适量至新的无rna酶离心管中，置于磁力架上，收集磁珠，加入适量binding buffer，洗涤后弃上清，收集磁珠，重复洗涤2次，加入适量binding buffer重悬磁珠，待用；
[0153]
3)探针与磁珠连接：取适量生物素标记探针加入到binding buffer重悬的磁珠中，室温旋转孵育15～30分钟；
[0154]
4)细胞裂解液样品制备：取生长状态良好的对数生长期细胞接种于10cm细胞培养皿中，细胞汇合度达到90％时收集细胞，加入适量lysis buffer裂解细胞；14000
×
g，离心
10min，取上清，在上清中加入reaction solution；
[0155]
5)带有探针的磁珠捕获目标rna复合物：取适量连接探针的磁珠加入到含有reaction solution的样品中，4℃旋转反应30～60min；
[0156]
6)洗涤：收集含有复合物的磁珠，洗涤液洗涤2次，收集磁珠复合物；
[0157]
7)收集并提取捕获的rna复合物并用于质谱检测：rna复合物用pierce
tm
磁性rna-protein pull-down试剂盒提取；在磁珠复合物中加入buffer rl，用移液器吹打数次；离心，收集上清；将上清加入gdna filter mini column滤柱，14000
×
g，离心2min，收集滤液；在滤液中加入等体积的70％乙醇，移液器吹打3～5次；将混有70％乙醇的滤液加入hipure rna mini column滤柱；12000
×
g，离心30～60s，弃滤液；在hipure rna mini column滤柱上加入600μl rw1；12000
×
g，离心30～60s，弃滤液；在hipure rna mini column滤柱上加入600μl rw2；12000
×
g，离心30～60s，弃滤液；在hipure rna mini column滤柱上加入600μl rw3；12000
×
g，离心30～60s，弃滤液；空柱12000
×
g，离心2min，弃滤液将滤柱转移至新的无rna 酶离心管中，加入30～100μl rnase free water至柱膜中央；室温静置2min；12000
×
g，离心1min。
[0158]
质谱检测由生工生物工程有限公司完成。质谱分析采用sciex公司的tripletof 5600lc/ms系统进行，tripletof 5600产生的质谱数据使用proteinpilot(版本号:v4.5)进行检索，数据库检索算法为paragon，检索所用数据库为uniprot中的水牛和目标序列蛋白质组参考数据库。
[0159]
为了便于统计分析，减少低丰度蛋白鉴定引起的假阳性结果，将谱数为0的数据人工填充为1，计算不同样品中每个蛋白质的光谱数与平均光谱数之比，设x＝log
2 ratio，y＝log
2 mean p。根据不同样品中各蛋白的数量差异和丰度，设定差异蛋白筛选边界y＝c/(x-x0)。根据筛选标准，光谱差异大于1.5倍(接近+∞)至3倍(接近1)的蛋白将被标记为差异蛋白，而谱数的差异大于2倍(接近1，趋近于+∞的蛋白)到4倍(趋近于1)的蛋白将被标记为显著不同的蛋白，结果如表3所示。
[0160]
由表3所示rna pull down结果可知，circclth可以捕获蛋白npm1、tuba1b和plec；其中，plectin(plec)是一种细胞链接蛋白，在各种组织中均有表达，如皮肤、肌肉、质膜和大多数类型的细胞。有研究表明，plec促进c2c12成肌细胞的分化和增殖，但抑制其凋亡，还可以调节萎缩相关基因(atrogin-1和murf-1)的表达以挽救肌肉萎缩，这与circclth促进水牛成肌细胞的增殖和分化，抑制其凋亡，具有一致性，表明circclth可能通过结合plec蛋白发挥其生物学功能。
[0161]
表3 rna pull down得到的circclth的差异结合蛋白
[0162][0163]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。