基于磁性纳米粒子催化的胃癌相关GSTP1甲基化PCR快速检测方法及应用与流程

基于磁性纳米粒子催化的胃癌相关gstp1甲基化pcr快速检测方法及应用
技术领域
1.本发明属于纳米生物技术领域，涉及一种gstp1甲基化pcr快速检测方法，具体的，涉及一种基于磁性纳米粒子催化的胃癌相关gstp1甲基化pcr快速检测方法及应用。


背景技术：

2.胃癌是一种常见的恶性肿瘤。如何实现胃癌的精准诊疗具有巨大的临床需求。研究发现20%左右的胃癌组织中存在gstp1甲基化，gstp1甲基化与胃癌的进展及预后密切相关。及时确诊胃癌组织中的gstp1甲基化状态，对胃癌的治疗具有指导意义。目前，基于聚合酶链反应 (pcr) dna-扩增是鉴定胃癌组织中gstp1甲基化主要方法，传统的pcr扩增程序复杂，耗时较长，用于扩增的酶成本高，不易储存，限制了pcr在胃癌组织中gstp1甲基化诊断中的应用。
3.随着纳米技术的快速发展，纳米材料特别是磁性纳米颗粒在生物医学领域引起了 人们极大的研究兴趣。磁性纳米颗粒是一类智能型的纳米材料，具有粒径小、比表面积大、偶联容量高地特点。近年研究发现磁纳米颗粒具有酶的催化功能，同时还发现磁性纳米颗粒的催化活性随着颗粒粒径的减小而增强，颗粒的粒径越小，其催化活性越高。磁性颗粒的粒径达微米量级后，催化活性降低至接近零值。磁性纳米颗粒作为纳米酶应用被广泛报道。
4.与传统的蛋白酶相比，磁性颗粒纳米酶具有更多的优势：(1)蛋白酶在极端ph和温度下容易 变性，同时也容易被蛋白酶降解，而磁性纳米颗粒在极端条件下很稳定；(2)蛋白酶的生产成本很高，而磁性纳米颗粒制备简单、廉价；(3)由于磁性纳米颗粒具有超顺磁性，用磁铁可以回收反复利用；同时基于磁性纳米颗粒的磁可控性，拓展了其作为模拟酶的应用领域。
5.研究发现，磁性纳米粒子fe3o4具有纳米酶的活性，具有催化功能，与taq酶混合在一起，具有增加taq酶活性的功能，提高pcr扩增效率。同时，磁性纳米粒子是球状结构，能够通过非共价键吸附pcr引物，dna核酸、taq酶等到表面，提高了接触效率，因此，提高了pcr反应效率。
6.虽然，关于基于磁性纳米粒子催化的胃癌相关gstp1甲基化pcr快速检测方法的报道非常少，也有很多技术难题有待攻克，但是相关的技术研究具有非常重要的意义。


技术实现要素：

7.针对上述研究背景，本发明的目的在于提供一种磁性纳米粒子催化的胃癌相关gstp1甲基化pcr快速检测方法，提高gstp1甲基化检测的效率和稳定性。
8.本发明的再一目的在于：提供上述磁性纳米粒子催化的胃癌相关gstp1甲基化pcr快速检测方法的应用。
9.一方面，本发明提供了一种胃癌相关gstp1甲基化pcr快速检测方法，该检测方法基于磁性纳米粒子催化，包括以下步骤：
s1, 核酸提取：提取样本中的基因组dna，s2, 亚硫酸氢钠修饰基因组dna：上述基因组dna经碱变性后采用亚硫酸氢钠溶液处理，将未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，而甲基化的不变，s3, pcr扩增：使用针对gstp1甲基化设计的引物扩增样本中的基因组dna，，所述的pcr扩增反应液中含有磁性纳米粒子，s4，检测pcr产物。
10.优选的，步骤s1中，核酸提取是采用磁珠法提取样本中的基因组dna并定量，提取后核酸浓度为1 ng/ml～1000 ng/ml，优选的浓度为10-100 ng/ml。
11.优选的，步骤s2中，用于修饰基因组dna的亚硫酸氢钠浓度为0.2-5 mol/l，优选的浓度为1-3 mol/l。
12.优选的，步骤s3的pcr扩增的反应程序为：95℃预变性30 s后再进行5-50次循环，每一次循环包括95℃变性5s和60℃退火延伸5～120s。优选的，退火延伸时间10～60s，循环次数为10-40次。
13.优选的，步骤s3中的引物包括上游引物和下游引物，均是长度为10～50个碱基片段的寡核苷酸；优选的引物长度为15-35个碱基片段的寡核苷酸序列。在本发明的一个优选例中，所述的特异性引物含有以下序列：ttcggggtgtagcggtcgtc（seq id no 1）和/或gccccaatactaaatcacgacg（seq id no 2)。
14.优选的，所述的胃癌相关gstp1甲基化pcr快速检测方法包括设计引物、配置pcr反应液或者 pcr扩增产物鉴定的步骤。
15.优选的，引物设计是针对gstp1甲基化设计特异性引物。
16.优选的，pcr高效反应液包括：10
×
pcr buffer 10l, taq dna聚合酶，上游引物1l，下游引物1l，dna 样品2l，dntp混合液15l，磁性纳米粒子，19l去离子水。
17.优选的，pcr扩增产物鉴定的步骤是指，利用琼脂糖电泳凝胶对扩增产物进行分析。
18.优选的，把pcr产物加入电泳样品孔，电压110v 电泳后，紫外分析仪下观察结果，有目标pcr产物条带，表明结果是阳性，无目标pcr产物条带，表明结果是阴性。
19.优选的，所述的taq dna聚合酶酶活为0.5-5u，优选的taq dna聚合酶酶活为0.5-1u。
20.优选的，所述的琼脂糖凝胶的浓度为0.5%～5%，电泳时间为2～20 min，优选的琼脂糖凝胶的浓度为1%～3%，电泳时间为5～10 min。
21.优选的，所述的上述用于催化的磁性纳米粒子为四氧化三铁纳米颗粒，浓度为0.001 mg/ml～10 mg/ml，水动力粒径分布为1 nm～1000 nm。优选的，四氧化三铁纳米颗粒为球形，浓度为0.1 mg/ml～1 mg/ml，水动力粒径分布为1 nm～50 nm。
22.另一方面，本发明提供了一种引物，所述的引物含有以下序列：ttcggggtgtagcggtcgtc和/或gccccaatactaaatcacgacg。
23.本发明还提供了一种试剂盒，所述的试剂盒中含有针对gstp1甲基化的pcr引物或者磁性纳米粒子。
24.优选的，所述的gstp1甲基化的pcr引物含有以下序列：ttcggggtgtagcggtcgtc和/或gccccaatactaaatcacgacg。
25.优选的，试剂盒中的磁性纳米粒子为四氧化三铁纳米颗粒。
26.再一方面，本发明提供了所述的胃癌相关gstp1甲基化pcr快速检测方法的应用，例如可以用于选择胃癌的靶向药物，或者为药物选择作指导。
27.优选的，用于胃癌相关gstp1甲基化阳性推荐靶向用药包括但不限于５－氮杂胞嘧啶核苷。相应的，所述的应用包括：使用胃癌相关gstp1甲基化阳性推荐靶向用药处理胃癌相关gstp1甲基化阳性的细胞，以减少gstp1甲基化的含量或者比例。
28.具体而言，本发明基于磁性纳米粒子催化的胃癌相关gstp1甲基化pcr快速检测方法，包括以下步骤：（1）引物设计：根据胃癌相关gstp1甲基化特点，设计了具有100%特异性的引物。
29.（2）核酸提取：采用磁珠法核酸提取试剂盒对临床样本核酸快速提取，采用紫外分光光度计进行定量，稀释至一定浓度后 4℃保存备用。
30.（3）亚硫酸氢钠修饰基因组dna：上述基因组dna经碱变性后采用亚硫酸氢钠溶液处理修饰基因组dna，将未甲基化的胞嘧啶（c）转化为尿嘧啶（u），而甲基化的不变，后经回收备用。
31.（4）pcr高效反应液的配置：包括10
×
pcr buffer 10μl, taq dna聚合酶，上游引物1μl，下游引物1μl，dna 样品2μl，dntp混合液15μl，磁性纳米粒子，19μl去离子水，混匀后，放入pcr仪进行后续扩增。
32.（5）pcr扩增：根据本发明中高效扩增的特点设计pcr反应程序，实现核酸快速扩增。95℃预变性30 s后；95℃变性5s，60℃退火延伸一段时间，进行若干次循环。
33.（6）pcr扩增产物检测和结果鉴定：利用琼脂糖电泳凝胶对扩增产物进行分析。把pcr产物加入电泳样品孔，电压110v 电泳一段时间后，紫外分析仪下观察结果，有pcr产物条带，表明结果是阳性，无pcr产物条带，表明结果是阴性。
34.上述的特异性的引物探针片段分为上游引物和下游引物，长度为10～50个碱基片段的寡核苷酸序列，优选的引物长度为15-35个碱基片段的寡核苷酸序列。
35.上述的提取后核酸浓度为1 ng/ml～1000 ng/ml，优选的浓度为10-100 ng/ml。
36.上述的用于核酸提取的临床样本可以是胃癌患者手术切除的组织样本或者活检取出的组织，优选的样本为胃癌患者手术切除的组织样本。
37.上述的用于修饰基因组dna的亚硫酸氢钠浓度为0.2-5 mol/l，优选的浓度为1-3 mol/l。
38.上述的pcr高效反应液taq dna聚合酶酶活为0.5-5u，优选的taq dna聚合酶酶活为0.5-1u。
39.上述用于催化的磁性纳米粒子为四氧化三铁纳米颗粒，四氧化三铁纳米颗粒可以是球形、棒形和三角形中的一种，但不限于以上类型，浓度为0.001 mg/ml～10 mg/ml，水动力粒径分布为1 nm～1000 nm。优选的四氧化三铁纳米颗粒为球形，浓度为0.1 mg/ml～1 mg/ml，水动力粒径分布为1 nm～50 nm。
40.上述的pcr反应程序中，60℃退火延伸时间为5～120s，循环次数为5-50次。优选的退火延伸时间10～60s，循环次数为10-40次。
41.上述的琼脂糖凝胶的浓度为0.5%～5%，电泳时间为2～20 min，优选的琼脂糖凝胶的浓度为1%～3%，电泳时间为5～10 min。
42.本发明的的有益效果如下：本发明设计制备了gstp1甲基化检测的pcr引物，利用磁性纳米粒子的纳米酶催化活性，研发了基于磁性纳米粒子催化的胃癌相关gstp1甲基化pcr快速检测方法，提高了pcr反应效率和稳定性，将pcr反应时间缩短到20 min，同时确保100%特异性。满足了胃癌相关的gstp1甲基化快速检测的需求。
43.磁性纳米粒子具有酶的催化特性，从而能够加快pcr反应的速度，缩短pcr反应的时间，该技术应用于胃癌组织中gstp1甲基化检测能够达到快速检测的目的，对胃癌的治疗具有指导意义。
附图说明
44.为了更清楚地说明本技术的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的每一幅附图针对本技术的部分实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
45.图1为实施例1中所述四氧化三铁纳米颗粒透射电镜照片。
46.图2为实施例1中所述胃癌样本gstp1甲基化阳性和阴性凝胶电泳图像。
具体实施方式
47.本发明涉及一种基于磁性纳米粒子催化的胃癌相关gstp1甲基化pcr快速检测方法及应用，具体包括：引物设计、核酸提取、亚硫酸氢钠修饰基因组dna、pcr反应液的配置、pcr扩增、pcr扩增产物检测和结果鉴定的步骤，以及基于pcr扩增结果对胃癌gstp1甲基化阳性患者进行用药指导。本发明提高了pcr反应效率和稳定性，将pcr反应时间缩短到20 min，同时确保100%特异性，满足了胃癌相关的gstp1甲基化快速检测的需求。
48.具体的，本发明提供了一种基于磁性纳米粒子催化的胃癌相关gstp1甲基化pcr快速检测方法，包括如下步骤：（1）引物设计：根据胃癌相关gstp1甲基化特点，设计了具有特异性的引物；（2）核酸提取：采用磁珠法核酸提取试剂盒对临床样本核酸快速提取，采用紫外分光光度计进行定量，稀释至一定浓度后 4℃保存备用；（3）亚硫酸氢钠修饰基因组dna：上述基因组dna经碱变性后采用亚硫酸氢钠溶液处理修饰基因组dna，将未甲基化的胞嘧啶（c）转化为尿嘧啶（u），而甲基化的不变，后经回收备用；（4）pcr高效反应液的配置：包括10
×
pcr buffer 10μl, taq dna聚合酶，上游引物1μl，下游引物1μl，dna 样品2μl，dntp混合液15μl，磁性纳米粒子，19μl去离子水，混匀后，放入pcr仪进行后续扩增；（5）pcr扩增：根据本发明中高效扩增的特点设计pcr反应程序，实现核酸快速扩增；95℃预变性30 s后；95℃变性5s，60℃退火延伸一段时间，进行若干次循环；（6）pcr扩增产物检测和结果鉴定：利用琼脂糖电泳凝胶对扩增产物进行分析；把pcr产物加入电泳样品孔，电压110v 电泳一段时间后，紫外分析仪下观察结果，有pcr产物条带，表明结果是阳性，无pcr产物条带，表明结果是阴性。
49.优选的，特异性的引物片段分为上游引物和下游引物，长度为10～50个碱基片段
的寡核苷酸序列。
50.优选的，上述核酸的浓度为1 ng/ml～1000 ng/ml。
51.优选的，亚硫酸钠浓度为0.2-5 mol/l。
52.优选的，用于核酸提取的临床样本可以是胃癌患者手术切除的组织样本或者活检取出的组织。
53.优选的，pcr高效反应液taq dna聚合酶酶活为0.1-5u。
54.优选的，用于催化的磁性纳米粒子为四氧化三铁纳米颗粒，浓度为0.001 mg/ml～10 mg/ml。
55.优选的，四氧化三铁纳米颗粒可以是球形、棒形和三角形中的一种，但不限于以上类型，水动力粒径分布为1nm～1000nm。
56.优选的，pcr反应程序中，60℃退火延伸为5～120s，循环次数为5-50次。
57.优选的，琼脂糖凝胶的浓度为1%～5%，电泳时间为2～20min。
58.本发明还提供了上述磁性纳米粒子催化的胃癌相关gstp1甲基化pcr快速检测方法在指导胃癌的靶向药物治疗中的应用。
59.优选的，用于胃癌相关gstp1甲基化阳性推荐靶向用药包括但不限于５－氮杂胞嘧啶核苷。
60.下面将通过本技术的实施例对技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本技术一部分优选实施例，而不是全部的实施例。基于本技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动所获得的所有其他实施例，都属于本技术的保护范围。
61.实施例1本实施例提供一种新型双功能人工纳米酶的制备工艺，包括如下步骤：设计合成的pcr引物如下：5
’‑
5ttcggggtgtagcggtcgtc-3
’ꢀ
(forward)（参见seq id no 1） 5
’‑
gccccaatactaaatcacgacg-3’(reverse)（seq id no 2）利用双蒸水进行稀释，确保上下游引物浓度为：10 μg/ml。
62.样本dna提取：医院提供的胃癌患者手术切除的组织样本1块，利用磁性纳米粒子基础上的核酸提取试剂盒进行dna提取，按照说明书进行操作，提取的dna用去离子双蒸水稀释，利用紫外分光光度计进行定量，稀释浓度为100 ng/ml，4℃保存备用。
63.亚硫酸氢钠修饰基因组dna：上述基因组dna经碱变性后采用3m亚硫酸氢钠溶液处理修饰基因组dna，将未甲基化的胞嘧啶（c）转化为尿嘧啶（u），而甲基化的不变，经回收后dna样本稀释至100 ng/ml备用。
64.配置50 μl pcr反应液：10
×
pcr buffer 10 μl, taq dna聚合酶5 μl，上游引物1 μl，下游引物1 μl，dna 样品2 μl，dntp混合液15 μl，10 nm fe3o
4 纳米粒子1 μl，终浓度1 ng/ml，17 μl去离子水，混匀后，放入pcr仪进行扩增。
65.pcr扩增反应条件：95℃反应 30 s； 然后95℃反应 5 s, 60℃反应45 s, 20个循环。
66.pcr产物琼脂糖电泳分析：配置1.2%琼脂糖电泳凝胶， 把pcr产物加入电泳样品孔，电压110 v 电泳5分钟，紫外分析仪下观察结果，有显示为红色的pcr产物条带，表明结
果是阳性。
67.把gstp1甲基化阳性检测结果报告给临床医生，给予患者靶向药物５－氮杂胞嘧啶核苷治疗，2个疗程后，患者恢复到正常的健康状态，检测各项指标正常。
68.实施例2pcr引物设计，样本的提取和亚硫酸钠处理步骤同实施例1配置50 μl pcr反应液：10
×
pcr buffer 10 μl, taq dna聚合酶1μl，上游引物1 μl，下游引物1 μl，dna 样品2 μl，dntp混合液15 μl，10 nm fe3o
4 纳米粒子2 μl，终浓度1 ng/ml，17μl去离子水，混匀后，放入pcr仪进行扩增。
69.pcr扩增反应条件：95℃反应 30 s； 然后95℃反应 5 s, 60℃反应30 s, 20个循环。
70.pcr产物琼脂糖电泳分析：配置1.2%琼脂糖电泳凝胶， 把pcr产物加入电泳样品孔，电压110 v 电泳5分钟，紫外分析仪下观察结果，有显示为红色的pcr产物条带，表明结果是阳性。
71.由上述检测结果表明，本发明基于磁性纳米粒子催化的胃癌相关gstp1甲基化pcr快速检测方法，提高了pcr反应效率和稳定性，将pcr反应时间缩短到20 min，同时确保100%特异性。满足了胃癌相关的gstp1甲基化快速检测的需求，具有非常大的临床应用价值。
72.以上所述的实施例仅为本技术的具体实施方式，但本技术的保护范围并不局限于此，任何熟悉本领域技术的技术人员在本技术公开的技术范围内，可以不通过创造性劳动即能够联想到的变化或替换，都应涵盖在本技术的保护范围之内。因此，本技术的保护范围应以本技术中权利要求的保护范围为准。