一种7-（N，N-二乙基氨磺酰）-苯并[c][1,2,5]恶二唑荧光载体及其制备方法与应用

一种7-（n，n-二乙基氨磺酰）-苯并[c][1,2,5]恶二唑荧光载体及其制备方法与应用
技术领域
[0001]
本发明涉及医药化工领域，涉及一种苯并[c][1,2,5]恶二唑类荧光载体及其制备方法与应用，特别涉及一种7-（n，n-二乙基氨磺酰）-苯并[c][1,2,5]恶二唑荧光载体及其制备方法与应用。


背景技术：

[0002]
苯并[c][1,2,5]恶二唑类结构是一类重要的荧光分子骨架。该骨架与吗啉基团共价连接，利用吗啉n原子质子化阻断pet效应可用于开发检测溶酶体的开关-比率型ph敏感探针；此外，将其与二甲胺基萘等大共轭基团连接还可实现细胞粘度检测。在重金属离子检测、生物大分子成像等领域，苯并[c][1,2,5]恶二唑骨架同样具有广泛的应用潜力。
[0003]
然而上述荧光骨架自身不能作为高效的标记载体，需要与其它功能基团共价连接后实现检测目的。一方面，结构设计与合成具有一定难度，从设计到应用耗时较长，效率相对低下。另一方，因无法高效、便捷地实现对特定目标如药物分子或蛋白等生物大分子的特异性荧光标记，检测时容易带来假阳性的问题。


技术实现要素：

[0004]
本发明的目的在于克服现有技术的不足，从而提供一种可高效、便捷地实现特异性标记的7-（n，n-二乙基氨磺酰）-苯并[c][1,2,5]恶二唑荧光载体及其制备方法。
[0005]
为了解决上述技术问题，本发明是通过如下技术方案得以实现的。
[0006]
本发明第一方面提供了一种7-（n，n-二乙基氨磺酰）-苯并[c][1,2,5]恶二唑荧光载体，其具有如下式i所示结构式：式i；其中，x选自ch2、co中的一种或多种，n选自1-9中的任意正整数。
[0007]
作为优选地，所述n选自1或2。
[0008]
作为优选地，所述7-（n，n-二乙基氨磺酰）-苯并[c][1,2,5]恶二唑荧光载体，其结
构式选自下式ii、iii中的一种或多种：式ii
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
式iii。
[0009]
本发明第二方面提供了一种7-（n，n-二乙基氨磺酰）-苯并[c][1,2,5]恶二唑荧光载体的制备方法，包括如下步骤：（1）将4-氯-7-（n，n-二乙基氨磺酰）-苯并[c][1,2,5]恶二唑与含氮化合物在有机溶剂中反应生成中间体；所述含氮化合物选自烷基二胺、氨气中的一种或多种；（2）将步骤（1）得到的中间体与马来酸衍生物、缩合剂中的一种或多种于溶剂中进行反应；所述马来酸衍生物选自马来酸酐、马来酰亚胺烷酸中的一种或多种，所述缩合剂选自n,n-二异丙基碳二亚胺、n,n-二环己基碳二亚胺、1h-苯并三唑-1-基氧三吡咯烷基六氟磷酸盐、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐中的一种或多种；（3）反应完成后，减压蒸发溶剂，纯化后即得。
[0010]
作为优选地，步骤（1）中所述烷基二胺选自乙二胺、丙二胺、丁二胺、戊二胺、己二胺、庚二胺、辛二胺、壬二胺和癸二胺中的一种或多种；最优选地，所述烷基二胺选自乙二胺。
[0011]
作为优选地，步骤（1）中所述有机溶剂选自乙腈、四氢呋喃、二氯甲烷和氯仿中的一种或多种；最优选地，所述有机溶剂选自乙腈、四氢呋喃中的一种或多种。
[0012]
作为优选地，步骤（1）中反应温度为45-80℃，反应时间为0.5-2.5h；最优选地，反应温度为60℃，反应时间为1.5h。
[0013]
作为优选地，步骤（1）中所述4-氯-7-（n，n-二乙基氨磺酰）-苯并[c][1,2,5]恶二唑的合成方法具体如下：将4-氯-7-氯磺酰-苯并[c][1,2,5]恶二唑（cas:142246-48-8）溶于无水四氢呋喃，冰浴搅拌；将三乙胺、二乙胺与无水四氢呋喃混合均匀，缓慢滴加至反应体系，反应结束后抽滤，乙酸乙酯洗涤，旋干滤液，石油醚和乙酸乙酯作为流动相柱层析纯化即得。
[0014]
作为优选地，步骤（2）中所述马来酰亚胺烷酸选自3-马来酰亚胺丙酸。
[0015]
作为优选地，步骤（2）中所述溶剂选自n,n-二甲基甲酰胺、甲苯、邻二氯苯、乙腈、二氯甲烷和氯仿中的一种或多种。
[0016]
作为优选地，在步骤（2）中任选地可加入催化剂以促进反应，所述催化剂选自三乙胺。
[0017]
作为优选地，步骤（3）中所述纯化为色谱分离纯化。
[0018]
进一步地，所述7-（n，n-二乙基氨磺酰）-苯并[c][1,2,5]恶二唑荧光载体的制备
方法具体包括如下步骤：（1）将4-氯-7-（n，n-二乙基氨磺酰）-苯并[c][1,2,5]恶二唑与乙二胺在乙腈中反应生成中间体，反应温度为45-80℃，反应时间为0.5-2.5h；（2）将步骤（1）中得到的中间体与马来酸酐置于由n,n-二甲基甲酰胺和甲苯组成的混合溶剂中，同时加入三乙胺作为催化剂进行反应；反应温度为110-150℃，反应时间为6-24h；（3）反应完成后，减压蒸发溶剂，通过柱层析纯化后即得。
[0019]
作为优选地，步骤（2）所述混合溶剂中n,n-二甲基甲酰胺与甲苯的体积比为1:20。
[0020]
作为优选地，所述中间体与马来酸酐的摩尔比为1:1.5-3.0；最优选地，所述中间体与马来酸酐的摩尔比为1:2。
[0021]
进一步地，所述7-（n，n-二乙基氨磺酰）-苯并[c][1,2,5]恶二唑荧光载体的制备方法具体包括如下步骤：（1）将4-氯-7-（n，n-二乙基氨磺酰）-苯并[c][1,2,5]恶二唑与氨气在四氢呋喃中反应生成中间体，反应温度为45-75℃，反应时间为1.0-2.5h；（2）将3-马来酰亚胺丙酸和n,n-二异丙基碳二亚胺溶于乙腈，室温搅拌均匀后，加入溶于乙腈的中间体溶液进行反应；反应温度为25-60℃，反应时间为1-3h；（3）反应完成后，减压蒸发溶剂，通过柱层析纯化后即得。
[0022]
作为优选地，步骤（2）中中间体、3-马来酰亚胺丙酸、n,n-二异丙基碳二亚胺的摩尔比为1:（1.0-3.0）:（1.2-3.0）；最优选地，中间体、3-马来酰亚胺丙酸、n,n-二异丙基碳二亚胺的摩尔比为1:1.2:1.5。
[0023]
本发明第三方面提供了7-（n，n-二乙基氨磺酰）-苯并[c][1,2,5]恶二唑荧光载体在荧光标记或显影示踪中的应用。
[0024]
本发明第四方面提供了一种缀合物，包含7-（n，n-二乙基氨磺酰）-苯并[c][1,2,5]恶二唑荧光载体，以及含亲核基团的有机小分子、多肽、蛋白质中的一种或多种。
[0025]
应理解的是，本发明所述7-（n，n-二乙基氨磺酰）-苯并[c][1,2,5]恶二唑荧光载体其结构中7-（n，n-二乙基氨磺酰）-苯并[c][1,2,5]恶二唑为主要起到发色作用的荧光骨架，与骨架4位n原子相连的次甲基或羰基以及代表烷基链长度的n值大小对骨架荧光性能并没有本质的影响。本领域技术人员有能力使用根据本发明制备得到的7-（n，n-二乙基氨磺酰）-苯并[c][1,2,5]恶二唑荧光载体通过常规方法与含亲核基团的有机小分子、多肽或蛋白质等物质进行共价结合以获得具有荧光标记或显影示踪功能的缀合物；本发明中所列举的共价结合方式或合成工艺步骤仅用于展示所提供缀合物的一种示例，而并非用于限定本发明的保护范围。
[0026]
本发明相对于现有技术具有如下技术效果：（1）本发明在7-（n，n-二乙基氨磺酰）-苯并[c][1,2,5]恶二唑荧光染料的基础上创造性地引入马来酰亚胺结构得到所述荧光载体，该载体可以有效地与含有巯基、胺基等亲核基团的有机小分子、多肽、蛋白质等物质发生迈克尔加成反应，将相应分子共价结合到所述载体上，实现对相应分子进行荧光标记，从而实现对有机小分子、多肽或蛋白质的体外检测与体内显影示踪，具有快速、高效标记的优点。
[0027]
（2）本发明通过荧光分子载体共价结合目标分子的模式可以保障示踪显影的准度
与精度，避免采用包合等手段进行药物显影示踪时，荧光物质渗漏导致的假阳性结果。
附图说明
[0028]
图1为式ii化合物的核磁共振氢谱图。
[0029]
图2为式vi化合物的核磁共振氢谱图。
[0030]
图3为含巯基药物bsh与式ii化合物形成的共价缀合物的制备工艺流程图。
[0031]
图4为含巯基药物bsh与式ii化合物形成的共价缀合物的hplc纯度图。
[0032]
图5为含巯基药物bsh与式ii化合物形成的共价缀合物的核磁共振氢谱图。
[0033]
图6为含巯基药物bsh与式ii化合物形成的共价缀合物的分子量质谱图。
具体实施方式
[0034]
为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下参照实施例对本发明作进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。在无特别说明的情况下，本发明上下文中所使用的试剂中，均通过市售获得。
[0035]
实施例1一种7-（n，n-二乙基氨磺酰）-苯并[c][1,2,5]恶二唑荧光载体，其制备方法包括如下步骤：（1）将4-氯-7-氯磺酰-苯并[c][1,2,5]恶二唑（11.21g,44.3mmol）溶于125ml的无水四氢呋喃中，冰浴搅拌，三乙胺（8.96g,88.5mmol）和二乙胺（3.24g,44.3mmol）与50ml的无水四氢呋喃混合均匀，缓慢滴入反应体系，tlc监测。反应结束后抽滤，乙酸乙酯洗涤，减压蒸发滤液，石油醚：乙酸乙酯10：1柱层析纯化,得4-氯-7-（n，n-二乙基氨磺酰）-苯并[c][1,2,5]恶二唑（中间体1，其结构如式iv所示）6.95g，产率54.20%；式iv。
[0036]
（2）将1g（3,45mmol）4-氯-7-（n，n-二乙基氨磺酰）-苯并[c][1,2,5]恶二唑用60ml乙腈溶解，缓慢滴入含有3.45ml乙二胺（3.11g，51.77mmol）的单颈瓶中，60℃反应1.5h；反应完毕后，减压蒸发乙腈，加入少量水后用乙酸乙酯萃取（100ml
×
3），合并有机相，减压蒸发溶剂，真空干燥得到橙红色固体（结构式见式v）0.95g，产率为87.96%，直接用于下一步反应；
式v。
[0037]
（3）将步骤（2）中得到的橙红色固体（500mg，1.6mmol）和马来酸酐（312.91mg，3.19mmol）用30ml混合溶剂（dmf：甲苯=1:20）溶解，加入200μl催化量的三乙胺，135℃回流分水12h。
[0038]
反应完毕后减压蒸发溶剂，石油醚和乙酸乙酯作为流动相柱层析纯化，得到131.6mg结构式为式ii所示化合物，即为7-（（2-（2,5-二氧基-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基）乙基）氨基）-n，n-二乙基苯并[c][1,2,5]恶二唑-4-磺酰胺，产率为20.97%。
[0039]
其核磁共振氢谱鉴定结果为：1h nmr (400 mhz, chloroform-d) δ 7.91 (d, j = 7.9 hz, 1h), 6.77 (s, 2h), 6.14 (d, j = 7.9 hz, 1h), 6.06 (t, j = 5.0 hz, 1h), 3.95 (t, j = 5.9 hz, 2h), 3.60 (q, j = 5.7 hz, 2h), 3.39 (q, j = 7.1 hz, 4h), 1.13 (t, j = 7.1 hz, 6h)（参见图1）。
[0040]
实施例2一种7-（n，n-二乙基氨磺酰）-苯并[c][1,2,5]恶二唑荧光载体，其制备方法包括如下步骤：（1）将500mg（1.73mmol）4-氯-7-（n，n-二乙基氨磺酰）-苯并[c][1,2,5]恶二唑（式iv）用20ml无水四氢呋喃溶解，持续通入新鲜制备的干燥氨气，45℃的反应2.0h；反应完毕后，减压蒸发溶剂，加入少量水后用乙酸乙酯萃取（80ml
×
3）,合并有机相，减压蒸发溶剂，真空干燥得387.6mg中间体（其结构见式vi，核磁共振氢谱图如图2所示），产率83.09%，直接用于下一步反应；其核磁鉴定结果为：1h nmr (400 mhz, dmso-d6) δ 7.83 (d, j = 8.0 hz, 1h), 7.70 (s, 2h), 6.35 (d, j = 8.0 hz, 1h), 3.24 (q, j = 7.1 hz, 4h), 1.02 (t, j = 7.1 hz, 6h) （参见图2）。
[0041]
式vi。
[0042]
（2）将3-马来酰亚胺丙酸（337.89mg，2.00mmol）和n,n-二异丙基碳二亚胺
（315.15mg，2.50mmol）用15ml乙腈溶解，室温搅拌30分钟，步骤（1）得到的中间体（450mg，1.66mmol）用10ml乙腈溶解缓缓加入反应体系，室温搅拌2.0h，薄层色谱监测反应进程；（3）反应完毕后，减压蒸发溶剂，柱层析纯化，得571.4mg结构式如式iii所示化合物，即为n-（7-（n，n-二乙基氨磺酰）苯并[c][1,2,5]恶二唑-4-基）-3-（2,5-二氧基-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基）丙酰胺，产率为81.44%。
[0043]
实施例3由于本发明所述7-（n，n-二乙基氨磺酰）-苯并[c][1,2,5]恶二唑荧光载体中的烷基链长度对载体共价化学连接性能没有本质的影响，本实例主要以式ii结构所示化合物（7-（（2-（2,5-二氧基-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基）乙基）氨基）-n，n-二乙基苯并[c][1,2,5]恶二唑-4-磺酰胺，经实施例1制备得到）作为典型代表进行缀合物的合成。
[0044]
本实施例选取含有巯基的经典放射性硼中子捕获治疗药物巯基十二硼烷二钠盐（bsh）作为亲核分子，共价结合到所述荧光载体上，形成缀合物（代号bs-non），合成工艺流程如图3所示，合成步骤具体如下：（1）取巯基十二硼烷二钠盐(31.5mg，0.15mm）置于10ml单颈瓶中，加入0.5ml双蒸水溶解后用移液器加n，n-二异丙基乙胺（25ul，0.15mmol）；（2）室温搅拌5分钟后，取式ii固体（118.03mg，0.30mm）用2ml乙腈溶解，加入到上述反应体系，常温搅拌2h，全程注意使用氮气保护；（3）反应完毕后减压蒸发溶剂，二氯甲烷和甲醇作为流动相柱层析纯化得29.61mg黄色bs-non固体，纯度96.5%（参见图4），纯化产率32.73%。
[0045]
其核磁鉴定结果为：1h nmr (400 mhz, methanol-d4) δ 7.91 (d, j = 8.1 hz, 1h), 6.40 (d, j = 8.1 hz, 1h), 4.57 (s, 1h), 3.87 (t, j = 6.1 hz, 1h), 3.85
ꢀ–ꢀ
3.70 (m, 2h), 3.72
ꢀ–ꢀ
3.58 (m, 2h), 3.36 (q, j = 7.2 hz, 4h), 3.12 (d, j = 5.8 hz, 2h), 1.82
ꢀ–ꢀ
0.69 (m, 6h,11h)（参见图5）。
[0046]
质谱鉴定结果如图6所示，质谱测定数值以倍半峰为主，与理论计算值相符。
[0047]
本实施例证明了所述7-（n，n-二乙基氨磺酰）-苯并[c][1,2,5]恶二唑荧光载体可与含亲核基团的分子进行有效地共价连接，实现对相应分子进行荧光标记，从而实现对有机小分子、多肽或蛋白质的体外检测与体内显影示踪，具有快速、高效标记的优点。同时，通过荧光分子载体共价结合目标分子的模式可以保障示踪显影的准度与精度，避免采用包合等手段进行药物显影示踪时，荧光物质渗漏导致的假阳性结果。
[0048]
以上具体实施方式部分对本发明所涉及的分析方法进行了具体的介绍。应当注意的是，上述介绍仅是为了帮助本领域技术人员更好地理解本发明的方法及思路，而不是对相关内容的限制。在不脱离本发明原理的情况下，本领域技术人员还可以对本发明进行适当的调整或修改，上述调整和修改也应当属于本发明的保护范围。