辣椒细胞质雄性不育育性恢复基因InDel标记、特异性引物及其应用的制作方法

辣椒细胞质雄性不育育性恢复基因indel标记、特异性引物及其应用
技术领域
1.本发明属于辣椒育种领域，尤其涉及一种辣椒细胞质雄性不育（cytoplasmic male sterility，cms）育性恢复基因indel标记、特异性引物及其应用。


背景技术：

2.中国是全球最大的辣椒生产国，其中90%以上辣椒品种是杂交种。由cms系、保持系和恢复系组成的“三系”杂交制种体系是辣椒杂交种制种的重要方法之一。该方法可以显著降低生产成本，提高杂交种纯度。“三系”杂交种的育性稳定是其大面积推广的重要保证，恢复系中的基因对其起着关键作用。
3.在辣椒“三系”杂交育种中，恢复系和不育系是杂交种选育的基础。新的恢复系和不育系的筛选通常通过与已有cms系测交，观察后代f1的育性进行确定。这至少需要2个生长季节的时间，且f1的育性可能会存在环境条件的影响，通过此种方法的选育效率较低，准确性需要在不同的生长环境中验证。近年来，分子标记辅助选择逐渐在育种实践中得到有效应用。在精细定位恢复基因的基础上，获得与育性恢复基因共分离的分子标记，可在种质资源中筛选新的保持系和恢复系，利用新筛选出的保持系作为父本，对原cms系连续回交4代以上，即可获得新的不育系。通过分子标记辅助选择可以节省育种时间，加快辣椒杂交种选育进程。


技术实现要素：

4.发明目的：为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种辣椒细胞质雄性不育育性恢复基因indel标记、特异性引物及其应用，该indel标记可用于辣椒分子标记辅助育种，筛选新的保持系和恢复系。
5.技术方案：本发明的目的可通过如下技术方案实现：一种辣椒细胞质雄性不育育性恢复基因indel标记，所述indel标记包括p06gindel-79和p06gindel-81，位于辣椒参考基因组zunla-1 v2.0的6号染色体上，对应物理位置分别为chr06: 215,419,754..215,420,003和chr06: 215,498,219..215,498,426。
6.所述的辣椒细胞质雄性不育育性恢复基因indel标记的特异性引物，所述特异性引物的序列如下所示：indel标记p06gindel-79：上游引物p06gindel-79-f：5
′‑
gagggtcttcctatgtttgtcc-3
′
，seq id no.1；下游引物p06gindel-79-r：5
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tgcacgaatgaacagtaaacca-3
′
，seq id no.2；indel标记p06gindel-81：上游引物p06gindel-81-f：5
′‑
tcattccctttttccagctctg-3
′
，seq id no.3；下游引物p06gindel-81-r：5
′‑
acaggggtgttatgggtgatt-3
′
，seq id no.4。
7.一种试剂盒，包含所述的特异性引物。
8.所述的indel标记、所述的特异性引物或所述的试剂盒在辣椒分子标记辅助育种中的应用。
9.所述的indel标记、所述的特异性引物或所述的试剂盒在筛选辣椒保持系和恢复系中的应用。
10.一种筛选辣椒保持系和恢复系的方法，所述方法包含应用所述的indel标记、所述特异性引物或所述的试剂盒的步骤。
11.进一步的，所述的筛选辣椒保持系和恢复系的方法，包括以下步骤：（1）提取待测辣椒自交系的基因组dna；（2）以步骤（1）提取的基因组dna作为模板，利用所述的特异性引物或所述的试剂盒进行pcr扩增；（3）将扩增产物进行电泳检测；（4）如果两个indel标记扩增产物的带型同时与不育系hz1a的带型相同，则待测辣椒自交系为保持系；如果两个indel标记扩增产物的带型同时与恢复系hz1c的带型相同，则待测辣椒自交系为恢复系。
12.具体的，步骤（4）中，p06gindel-79在不育系hz1a中的扩增产物电泳后出现2条条带，而在恢复系hz1c中多出1条200bp左右的条带；p06gindel-81在不育系hz1a中的扩增产物电泳后只有1条条带，而在恢复系hz1c中多出1条120bp左右的条带。
13.有益效果：在传统育种过程中，新的保持系和恢复系的筛选通常通过与已有不育系测交，观察f1后代的育性进行确定，但这需要较长的时间，且此种方法的选育效率较低。利用本发明中的indel标记和筛选方法，可在种质资源中快速筛选新的保持系（连续对已有不育系回交4代以上即为新的不育系）和恢复系，从而加快辣椒杂交种选育进程。
附图说明
14.图1为indel标记p06gindel-79和p06gindel-81在不育系hz1a、恢复系hz1c和13个自交系中扩增后的电泳图，其中：a为indel标记p06gindel-79在不育系hz1a、恢复系hz1c和13个自交系中的检测结果；b为indel标记p06gindel-81在不育系hz1a、恢复系hz1c和13个自交系中的检测结果；m：50bp marker；1：hz1a；2：hz1c；3：p21204；4：p21238；5：p21239；6：p21241；7：p21243；8：p21244；9：p21246；10：p21270；11：p21273；12：p21215；13：p21240；14：p21247；15：p21274。
具体实施方式
15.下面结合具体实施例，进一步阐明本发明，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本技术所附权利要求限定的范围。
16.实施例1以辣椒细胞质雄性不育系hz1a作为母本，恢复系hz1c作为父本构建（hz1a
×
hz1c）f2群体，采用混合分组分析法将不育系hz1a的育性恢复基因定位于6号染色体上的indel标记p06gindel-66和p06gindel-89之间，物理位置为chr06:215,097,259..215,631,069（参考基因组：zunla-1 v2.0），区间大小为533.81kb。
17.在该定位区间内，有2个新开发的indel标记p06gindel-79和p06gindel-81与恢复基因共分离。上述2个标记可作为鉴定辣椒恢复基因的特异性分子标记。p06gindel-79在hz1a中的扩增产物电泳后出现2条条带，而在hz1c中多出1条200bp左右的条带。p06gindel-81在hz1a中的扩增产物电泳后只有1条条带，而在hz1c中多出1条120bp左右的条带。
18.实施例2育性恢复基因特异性分子标记筛选新的辣椒保持系和恢复系生物材料：辣椒自交系共13份。3：p21204；4：p21238；5：p21239；6：p21241；7：p21243；8：p21244；9：p21246；10：p21270；11：p21273；12：p21215；13：p21240；14：p21247；15：p21274。
19.使用dna提取试剂盒（dp321，天根生化科技(北京)有限公司）从幼叶中提取基因组dna。
20.应用indel标记p06gindel-79和p06gindel-81，在上述13份辣椒自交系中进行pcr扩增。采用的特异性引物，如下所示：indel标记p06gindel-79：上游引物p06gindel-79-f：5
′‑
gagggtcttcctatgtttgtcc-3
′
，seq id no.1；下游引物p06gindel-79-r：5
′‑
tgcacgaatgaacagtaaacca-3
′
，seq id no.2；indel标记p06gindel-81：上游引物p06gindel-81-f：5
′‑
tcattccctttttccagctctg-3
′
，seq id no.3；下游引物p06gindel-81-r：5
′‑
acaggggtgttatgggtgatt-3
′
，seq id no.4。
21.pcr反应体积如下：5
µ
l 2
×
hieff
®
pcr master mix（10102es03，翌圣生物科技(上海)股份有限公司），1
ꢀµ
l 10
ꢀµ
m pcr上游引物，1
ꢀµ
l 10
ꢀµ
m 下游引物和20 ng模板dna，最后加ddh2o至10μl。
22.pcr反应程序为：94 ℃预变性2 min；94 ℃ 30 s，引物退火温度30 s，72 ℃ 30 s，共32个循环；最后在72 ℃延伸5分钟；冷却至12℃。
23.扩增产物在4%琼脂糖凝胶上电泳检测，120v恒压50min，使用紫外凝胶成像仪拍照。
24.根据indel标记p06gindel-79和p06gindel-81在上述13份辣椒自交系中的pcr扩增结果，编号3-11，15的自交系带型与hz1a相同，判定为hz1a的保持系（连续回交多代即为新的不育系），编号12-14的自交系带型与hz1c相同，判定为hz1a的恢复系。
25.将编号3-15辣椒自交系为父本，hz1a为母本配制杂交组合，观察f1的育性表现判定，3-11的自交系为hz1a的保持系，编号12-15的自交系为hz1a的恢复系。2个indel标记p06gindel-79和p06gindel-81鉴定辣椒保持系和恢复系的准确率为92.31%。