一种番茄叶片原生质体单细胞悬液的制备方法及应用

1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一种番茄叶片原生质体单细胞悬液的制备方法及其在单细胞转录组测序文库构建中的应用。


背景技术：

2.多细胞生物个体由多种形态功能不同的细胞组成，细胞的异质性这个普遍存在的生物学现象亟待我们展开深入研究。近十年来，单细胞测序技术发展迅猛，具备高通量、低价格和单分子分辨率和高稳定性等多重技术光环的10
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genomics单细胞技术的涌现，使万级别的单细胞研究成为成本可接受的事情。单细胞测序技术已在肿瘤、免疫、发育等方向获得了良好的应用，由于植物细胞中细胞壁的存在，目前单细胞测序技术在植物领域的研究进展缓慢，迄今为止在番茄中仍未见相关研究报道，截至目前单细胞测序在植物领域的报道还十分有限。植物细胞壁的主要成分是纤维素和果胶，只有有效去除细胞壁中的纤维素和果胶，我们才可能获得高质量的植物单细胞悬液，从而突破植物单细胞测序技术障碍。在常规的酶解过程中，通常选用果胶酶y-23，但是果胶酶y-23并不适用与番茄叶片组织的的裂解，会导致大规模的细胞破裂。
3.叶片可以得到大量比较均一的原生质体，许多资料报道双子叶植物分离原生质体的最佳材料是叶片。此外，子叶、胚轴、茎尖及愈伤组织、悬浮培养物和体细胞胚等均可作为分离原生质体的材料。目前还没有番茄叶片单细胞分离并用于单细胞测序应用的相关报道，原因在于目前番茄叶片组织单细胞分离体系还不能在保证较好裂解效果的同时兼顾成活率，而且植物细胞壁一旦被去除导致植物细胞稳定性减弱，容易破碎，尤其是当植物细胞通过10
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genomics平台进行分选时，这常常导致细胞捕获率低。因此急需建立一种能兼顾高裂解效率，细胞成活率和高细胞捕获率的番茄叶片原生质体单细胞分离的方法，这对于单细胞测序技术在番茄中的发展有着重要作用，能够为番茄其他器官组织的单细胞分离提供参考，推动单细胞测序技术在番茄中的应用。


技术实现要素：

4.针对现有技术的空缺，本发明创造性的提供了一种番茄叶片原生质体单细胞悬液的制备方法。采用本发明所述方法制成的番茄叶片原生质体单细胞悬液，细胞活性高达90％以上，使用10
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genomics平台进行单细胞分选，细胞捕获率可提高了一倍，可用于单细胞转录组测序文库的构建，应用价值高。
5.为了达到上述目的，本发明采用的技术方案为：一种番茄叶片原生质体单细胞悬液的制备方法，包括如下步骤：s1、使用超纯水配制原生质体制备所用的溶液，包括甘露醇溶液、酶解液、洗涤液，其中酶解液和洗涤液冰浴；s2、选择生长条件适宜的番茄幼苗，选取幼嫩真叶，浸泡在甘露醇溶液中；s3、使用锋利刀片将叶片切成细条状，并将叶片细条转移至冰浴的酶解液中；
s4、将含有叶片细条的酶解液在冰浴状态下抽真空；s5、将步骤s4制得的酶解液与叶片细条的混合物放入恒温箱避光孵育；s6、将步骤s5制得的酶解产物用1ml的宽口枪头转移，通过细胞筛过滤，过滤完成后，向滤网加入适量洗涤液洗涤残渣，经离心处理，去掉上清液，用宽口枪头加入1ml洗涤液重悬原生质体并离心，去掉上清液，制得原生质体单细胞悬液；s7、将步骤s6制得的单细胞悬液在显微镜下使用细胞计数板和台盼蓝染色检测细胞浓度、活性，即可。
6.优选地，步骤s1中所述的甘露醇溶液由如下组分组成：7%（w/v）的甘露醇。
7.优选地，步骤s1所述的酶解液由如下组分组成：7%（w/v）甘露醇、20mm kcl、20mm mes、20mm cacl2、20mm mgcl2、0.1%（w/v）的bsa（牛血清蛋白）、1%-1.5%（w/v）的纤维素酶r-10（产自绿色木酶）、0.2%-0.8%（w/v）的离析酶r-10（产自根霉菌）、2-4u/ml（w/v）果胶酶p2611（sigma-p2611，产自棘孢曲霉）且酶解液需通过0.45
µ
m无菌滤膜过滤除菌。
8.优选地，步骤s1所述的洗涤液由如下组分组成：20mm kcl、0.1%（w/v） bsa，0.7%（w/v）甘露醇，0.5-10
µ
m的褪黑素，10-100
µ
m的维生素c，且需通过0.45um无菌滤膜过滤除菌。
9.优选地，步骤s2中番茄幼苗的生长时期为2-3周，选取长度在3-5cm的幼嫩真叶。
10.优选地，步骤s3所述的幼嫩真叶需去除叶柄，切成细条状，叶片细条宽度约为0.2-0.5mm。
11.优选地，步骤s4所述的真空度为-0.05mpa，抽真空时间为10-30min。
12.优选地，步骤s5所述恒温箱温度设置为23-26℃，孵育时间为2-3h，孵育过程中每隔半小时，取出恒温箱避光条件下放入26℃摇床30转/min摇动5min，然后再放回恒温箱箱继续静置裂解。
13.优选地， 步骤s6所述的细胞筛孔径大小为40μm，所述的离心处理过程为于4℃，80-120 g转速下离心2-5min。
14.优选地，步骤s7所述的台盼蓝溶液浓度为0.4%，染色时台盼蓝溶液与细胞悬液比值为1:9-1:5，染色时间为1-3min.本发明还提供了一种利用所述的制备方法在构建单细胞转录组测序文库中的应用。
15.优选地，单细胞分选使用10
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genomics平台完成。
16.优选地，将利用所述制备方法制备的单细胞悬液置于冰上，于30min内完成分选和建库。
17.本发明中，将番茄叶片原生质体经清洗、酶解消化、洗涤等过程，最终制成了单细胞悬液。在制备过程中，采用含有纤维素酶r-10（产自绿色木酶）、离析酶r-10（产自根霉菌）、果胶酶p2611（产自棘孢曲霉）的混合酶处理番茄叶片组织，另外在酶解液中加入了20mm的mgcl2；在裂解过程中并没有使用常用的摇床摇动处理，而是使用恒温箱静置培养，每隔30min取出放入26℃摇床30转/min摇动5min。
18.本发明的有益效果为：1.在酶解液中加入产自棘孢曲霉的p2611果胶酶和mgcl2提高了酶解效率，这样有利于叶片组织快速完全酶解，去掉植物细胞壁的同时，不破坏细胞的完整性；在酶解中使用
了间歇式摇动的策略，减少了细胞在持续摇动时要承受的外力；通过这些改进将最终的细胞活性提高到90%以上。
19.2.在洗涤液中加入一定量的的褪黑素和维生素c，褪黑素和维生素c具有较强的抗氧化能力，褪黑素的加入使得细胞膜更加稳定，在使用10
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genomics平台进行细胞分选时提高了细胞捕获率。
20.此外，需要注意的是，本发明中，甘露醇溶液、酶消化液、洗涤液中各成分按照本技术说明书所述量添加均可；在单细胞标记建库时，最终根据细胞数量的多少，原生质体悬液的添加体积也会存在区别，洗涤液洗涤时的加入量一般在100μl～2ml之间。
附图说明
21.图1：实施例1制备的细胞悬液的显微照片。
22.图2：实施例2制备的细胞悬液的显微照片。
23.图3：对照例1制备的细胞悬液的显微照片。
24.图4：对照例2制备的细胞悬液的显微照片。
25.图5：对照例3制备的细胞悬液的显微照片。
具体实施方式
26.下面结合具体实施例对本发明作进一步解释，但是应当注意的是，以下实施例仅用以解释本发明，而不能用来限制本发明，所有与本发明相同或相近的技术方案均在本发明的保护范围之内。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料为市售商品。
27.一、单细胞悬液的制备一种番茄叶片原生质体单细胞悬液的制备方法，包括如下步骤：s1、使用超纯水配制分离用的溶液，所述溶液包括甘露醇溶液、酶解液、洗涤液，按表1配方配制。
28.表1
s2、选择生长条件适宜的2周苗龄的番茄幼苗，选取长度为3cm的幼嫩真叶，浸泡在甘露醇溶液中，实施例1-2及对照例1-3，各使用1g叶片。
29.s3、使用锋利刀片将叶片切成0.1-0.5mm的细条状，并将叶片细条转移至冰浴的酶解液中。
30.s4、将含有叶片细丝的酶解液在冰浴状态下抽真空，真空度-0.05mpa，真空时间10min。
31.s5、将步骤s4制得的酶解液与叶片细丝的混合物放入恒温箱避光孵育，每隔半小时，取出裂解容器避光条件下放入26℃的恒温摇床，30r/min摇动5min，然后再放回恒温箱继续静置裂解，酶解时间共2.5h。
32.s6、将步骤s5制得的酶解产物用1ml的宽口枪头转移，通过40
µ
m细胞筛过滤，细胞筛放置在无菌50 ml离心管上，过滤完成后，使用对应浓度的原生质体洗涤液冲洗残渣数次。使用离心机离心，离心机温度设置为4℃，调节转速为100
×ꢀ
g，离心2 min，去掉上清液，用宽口枪头加入1ml洗涤液重悬原生质体并离心，连续通过离心-洗涤处理2-3次，去掉上清液，制得细胞悬液；制备完成后用显微镜细胞计数板进行计数，并计算细胞总数。
33.s7、吸取15 μl原生质体悬液，用细胞计数板在显微镜下观察，统计四角及中间小格原生质体数量，计算浓度和细胞数量。
34.对照例1-3，与实施例1-2在原生质体分离步骤上一致，但是酶解液成分存在差异。对比例1的酶解液成分相比实施例1-2缺少mgcl2；对比例2的酶解液成分相比实施例1-2来说包含常规的果胶酶y-23，但缺少果胶酶p2611同时不含mgcl2；对比例3的酶解液成分中同
时含有果胶酶p2611、果胶酶y-23和mgcl2。
35.实施例1与实施例2，在酶解液成分上一致，但是洗涤液成分有所差异，具体来说实施例1的洗涤液成分中添加了10
µ
m的褪黑素和10
µ
m维生素c。
36.二、细胞数量检测1.试验样品：实施例1-2及对照例1-3制成的单细胞悬液。
37.2.取上述细胞悬液18μl，加入一次性细胞计数板中，显微镜下拍照并统计四角及中间小格原生质体数量计算平均值。各例的照片如附图1-5。
38.细胞数量=单个格子细胞数量平均值
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vv代表悬液体积，可以1ml移液器测量，单位μl。
39.试验结果见表2：表2由表2及附图可知，实施例1-2在2.5h内裂解相对于对照例1-3都可以获得较大的细胞数量。
40.三、细胞活性检测取上述细胞悬液各180μl，加入试管中，然后向试管中加入20μl，0.4％的台盼蓝染液，染色2-3min，并吸取少许悬液涂于载玻片上，加上盖玻片，于显微镜下任取几个视野计数细胞总数和活细胞数，计算细胞活性。
41.细胞活性＝活细胞数/细胞总数
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100%。
42.实验结果见表3：表3表3的结果显示，除对照例3外，其他例子的细胞活性都达到90%左右。
43.四、分选、建库和测序1.试验样品：实施例1-2制成的单细胞悬液。
44.2.根据实施例1-2细胞浓度，各取16000个细胞，通过10
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genomics单细胞分选平台分选，建库，并使用illumina平台进行高通量测序，通过生信分析，实施例1和实施例2捕获到的细胞数和捕获率（细胞捕获率=细胞捕获数/分选细胞数）见表4。
45.表4样品名实施例1实施例2捕获细胞数9986个4911个细胞捕获率62.4%30.7%由表4可见，通过在洗涤液中添加褪黑素和维生素c，显著增加了在使用10
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genomics平台进行单细胞分选测序中的细胞捕获率。褪黑素是一种由脑松果体分泌的动物激素，同时其具有较强的抗氧化能力可以清除细胞中的自由基进而提高细胞膜的稳定性，同样维生素c也是一种具有较强抗氧化能力的物质，这两种物质使得失去细胞壁的番茄叶片细胞更加稳定，进而在使用10
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genomics平台进行分选时，获得了更高的细胞捕获率。