对植物内生微生物组的宏基因组进行原位改造的方法与流程

1.本发明属于微生物技术领域，尤其涉及对植物内生微生物组的宏基因组进行原位改造的方法。


背景技术：

2.植物微生物组在植物生长和抗病过程中发挥着重要作用，通过操纵微生物组调控植物性状，促进植物健康生长，被认为是下一次绿色革命的关键。如何科学合理地调控微生物组，形成可操纵的、系统性的微生物组工程，已成为紧迫的前沿科学问题。
3.通过移植实验室内构建的菌株和微生物群落，在原生环境下直接操纵植物微生物组，是目前微生物组工程的主要策略。已广泛应用于拟南芥（arabidopsis thaliana）和番茄（lycopersicon esculentum）等植物土壤和叶际微生物组的研究中，并在改善植物性状等方面展示出巨大的应用潜力。然而自然环境中的很多微生物难以培养，实验室内难以真实模拟开放环境中复杂动态的互作网络，实验室内获得的功能菌株、工程菌和合成群落，不一定真实反应开放环境下的互作关系，移植的菌株在复杂环境内的定殖和扩散能力难以控制和预测。因此，对于更多复杂环境下的植物微生态环境，微生物互作机制尚不清晰，通过菌群移植难以实现预期功能。如何精确可控地调控开放环境下的植物微生物组，是目前植物微生物组工程的最大挑战。
4.为克服上述问题，近些年提出了原位宏基因组工程。宏基因组（metagenome）是微生物群体成员的基因组和基因，指导了群落的潜在功能，虽然不同微生物的基因组差异很大，但是群落宏基因组较为稳定。该策略直接编辑开放环境中已经稳定定殖的微生物群落的遗传信息，相比外源微生物的移植，获得新功能的微生物群落稳定性更高，维持群落功能的成本更低。此外，由于对微生物群落成员没有直接的改变，对微生物组中其他种群的影响较小，尽量减小对微生态平衡的破坏。尽管在原生环境下操纵微生物的遗传信息存在巨大难度，但是随着基因水平转移机制研究的深入，为原位宏基因组工程提供了更多可能的途径，与现有的基因编辑技术相结合，将实现对微生物组基因表达和代谢网络的精确操纵。
5.松材线虫（bursaphelenchus xylophilus），在松属植物体内寄生危害，由其引起的松材线虫病会导致松林大面积死亡。松树内生微生物组在线虫致病过程中发挥着复杂的功能，通过传统方法将生防菌移植到松树体内，往往因为难以定殖和扩散而无法有效改变内生微生物群落，进而难以控制病害的发生。原位宏基因组工程为操纵松树内生微生物组提供了新的思路。然而，如何操纵植物微生物宏基因组，尚没有可靠的方法和策略，首先需要建立适用于植物内生微生物组的原位宏基因组改造的工程质粒和工程菌株。


技术实现要素：

6.本发明提供对植物内生微生物组的宏基因组进行原位改造的方法，旨在解决现有技术存在的问题。
7.本发明是这样实现的，对植物内生微生物组的宏基因组进行原位改造的方法，包
括以下步骤：s1、构建植物内生微生物原位宏基因组改造的工程质粒；s2、构建植物内生微生物原位宏基因组改造的供体菌；s3、在植物体外对内生微生物进行宏基因组改造及受体菌分离培养；s4、在植物体内对内生微生物组进行原位宏基因组改造。
8.优选的，所述构建植物内生微生物原位宏基因组改造的工程质粒，具体包括：质粒元件共包括复制子、启动子、抗性标记基因、转移起始位点和载荷基因；复制子包括pbbr1、rsf1010和p15a三种广宿主复制子；pbbr1复制子（序列1）含有两个重要的元件，rep基因编码复制蛋白，参与质粒的复制，mob基因编码移动基因，负责质粒的接合转移；rsf1010复制子（序列2）含有七个重要元件，其中rep基因编码rep a、b、c三个复制蛋白，参与质粒的复制，mob基因编码mob a、b、c三个移动蛋白，负责质粒的接合转移；p15a复制子（序列3）不含有转移起始位点，需要连接incp转移起始位点（序列4）；启动子包括广宿主范围的启动子cp25（序列5）、pa1（序列6）、pa2（序列7）、pa3（序列8），这四个启动子需要连接核糖体结合位点（rbs）（序列9）；以氨苄抗性基因作为抗性标记基因（序列10）；以绿色荧光蛋白（sfgfp）（序列11）为载荷基因，通过细菌间的接合转移机制，质粒被传递给受体菌后，通过启动子表达gfp蛋白，使得受体菌带有绿色荧光标记；最后，通过基因工程手段，将上述质粒元件组合，共获得十二个不同的接合质粒。
9.优选的，所述构建植物内生微生物原位宏基因组改造的供体菌，具体包括：以革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌中普遍存在的incpα家族的rp4质粒接合转移机制为基础，选择escherichia coli s17-1 λpir为供体菌改造的出发菌株，该菌株的染色体中整合了rp4-2质粒，可以携带染色体的部分dna在接合菌之间转移；通过red同源重组技术，将mcherry蛋白插入大肠杆菌基因组，获得红色荧光标记的大肠杆菌供体菌ecbct；将大肠杆菌供体菌ecbct制备成感受态细胞，通过热激方式，将上述构建好的接合质粒转入供体菌中；经单斑挑取后送测，获得转化成功的供体菌。
10.与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明的对植物内生微生物组的宏基因组进行原位改造的方法，通过构建植物内生微生物原位宏基因组改造的工程质粒；构建植物内生微生物原位宏基因组改造的供体菌；在植物体外对内生微生物进行宏基因组改造及受体菌分离培养；在植物体内对内生微生物组进行原位宏基因组改造，为操纵植物微生物宏基因组研究提供了有效路径。
附图说明
11.图1为本发明的对植物内生微生物组的宏基因组进行原位改造的方法的流程示意图。
12.图2为本发明的携带工程质粒pbct-bp1的供体菌荧光显微成像的示意图。
13.图3为本发明的stenotrophomonas和klebsiella属受体菌荧光显微成像的示意图。
14.图4为本发明的不同接种手段载荷基因在马尾松不同组织内的pcr检测。
15.图5为本发明的喷洒接种30天针叶组织内部和表面受体菌荧光显微成像的示意
图。
16.图6为本发明的喷洒接种30天茎干组织内部和表面受体菌荧光显微成像的示意图。
17.图7为本发明的注射接种30天距离接种点15cm侧枝组织内部受体菌荧光显微成像的示意图。
18.图8为本发明的注射接种30天茎干组织内部受体菌荧光显微成像的示意图。
19.具体实施方式
20.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
21.请参阅图1，本实施例提供一种技术方案：马尾松内生微生物组的宏基因组进行原位改造的方法，包括以下步骤：s1、构建植物内生微生物原位宏基因组改造的工程质粒。
22.基于细菌间的接合转移机制，以革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌中普遍存在的incpα家族的rp4质粒接合转移机制为基础，构建一套广宿主的游离型接合质粒，用于原位宏基因组改造。质粒元件共包括复制子、启动子、抗性标记基因、转移起始位点和载荷基因。复制子包括pbbr1、rsf1010和p15a三种广宿主复制子。pbbr1复制子（序列1）含有两个重要的元件，rep基因编码复制蛋白，参与质粒的复制，mob基因编码移动基因，负责质粒的接合转移。rsf1010复制子（序列2）含有七个重要元件，其中rep基因编码rep a、b、c三个复制蛋白，参与质粒的复制，mob基因编码mob a、b、c三个移动蛋白，负责质粒的接合转移。p15a复制子（序列3）不含有转移起始位点，需要连接incp转移起始位点（序列4）。启动子包括广宿主范围的启动子cp25（序列5）、pa1（序列6）、pa2（序列7）、pa3（序列8），这四个启动子需要连接核糖体结合位点（rbs）（序列9）。以氨苄抗性基因作为抗性标记基因（序列10）。以绿色荧光蛋白（sfgfp）（序列11）为载荷基因，通过细菌间的接合转移机制，质粒被传递给受体菌后，通过启动子表达gfp蛋白，使得受体菌带有绿色荧光标记。通过基因工程手段，将上述质粒元件组合，共获得十二个不同的接合质粒（表1）表1 组装含有不同功能元件的质粒
s2、构建植物内生微生物原位宏基因组改造的供体菌；以革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌中普遍存在的incpα家族的rp4质粒接合转移机制为基础，选择escherichia coli s17-1 λpir（菌种编号为：atcc baa-2428）为供体菌改造的出发菌株，该菌株的染色体中整合了rp4-2质粒，可以携带染色体的部分dna在接合菌之间转移。为了后续实验中便于区分供体菌和受体菌，通过red同源重组技术，将mcherry蛋白插入大肠杆菌基因组，获得红色荧光标记的大肠杆菌供体菌ecbct 。将大肠杆菌供体菌ecbct制备成感受态细胞，通过热激方式，将上述构建好的接合质粒转入供体菌中。经单斑挑取后送测，获得转化成功的供体菌。当质粒转入后，供体菌同时携带有绿色荧光标记和红色荧光标记（图2）。
23.表2 受体菌分离鉴定 s3、在植物体外对内生微生物进行宏基因组改造及受体菌分离培养。
24.3.1 马尾松共生微生物获取分别对温室3年生马尾松根、茎、侧枝和叶进行取样，用研磨仪简单磨碎组织，放入
50ml离心管中，加入30ml无菌的pbs溶液，振荡器上剧烈震荡3-5min；用无菌纱布过滤较大的组织和颗粒，取悬浮液低速离心（1000g，5min），取上清加入30ml无菌的pbs溶液重复冲洗3次，进一步去除杂质；将得到的菌群在室温下4000rpm离心10min，弃去上清，使用1ml pbs重悬，计数细菌浓度备用。所有操作菌在超净工作台中进行。
25.3.2 接合转移实验将携带质粒文库的大肠杆菌在lb中过夜培养。接合前，将供体菌使用pbs冲洗3次，计数细菌浓度备用；按照107：109的比例将供体菌受体菌混合，4000rpm离心后，用25-100 μl pbs重悬。重悬后的混合物滴加到lb培养基0.45μm微孔滤膜上，28℃培养18h。接合转移反应完成后，从平板上刮取细菌至1ml的pbs中，一部分样品在抗生素平板和普通平板上筛选供体菌，另一部分样品加入甘油后-80℃保存备用。
26.3.3 受体菌分离鉴定荧光显微观察表明，在未进行宏基因组改造前，所提取的内生微生物没有明显的绿色荧光。当在质粒进入受体菌株后，当质粒上的功能元件适用于该宿主时，则可以启动载荷基因gfp的表达，从而使受体菌带有绿色荧光标记。共筛选到11株受体菌株，分别来自马尾松不同组织内（表2）。根据文献报道，鉴定到的寡氧单胞菌和克雷伯氏菌属的细菌（图3），广泛分布于我国不同地区的松树体内。
27.s4、在植物体内对内生微生物组进行原位宏基因组改造。
28.4.1供体菌接种马尾松将含有不同质粒的供体菌在lb培养基中培养至od600值约0.5-0.7，混合不同的供体菌，离心后用pbs溶液冲洗三遍，重悬至菌体浓度为1
×
108cfu/ml。选取生长基本一致，平均株高60cm，直径（茎中段）1 cm左右的马尾松实生苗（遗传背景一致）。喷洒处理：将浓度为1
×
107cfu/ml的菌液以25ml/棵的剂量喷洒至3年生马尾松表面，一周后再次喷洒一次，共喷洒两次；最后一次喷洒后，每隔5天对马尾松茎干、侧枝和针叶进行取样。注射处理：在马尾松主干中部钻孔注射接种40μl浓度为1
×
108cfu/ml的菌液，并用封口膜将接种点密封保湿，一周后在相同位置再次注射一次，共注射两次；最后一次喷洒后，定期对接种点、距离接种点不同距离的茎干进行取样。所取样品用于提取内生微生物进行平板培养，以及制作新鲜切片用于显微荧光观察。
29.4.2 检测马尾松组织内的受体菌通过对gfp基因的pcr检测，检测载荷基因在马尾松组织内的传播情况和遗传稳定性（图4）。通过喷洒接种，gfp基因可在马尾松针叶和茎表面存在60天以上；同时，载荷基因可以从茎的表面传播扩散至茎的内部。通过注射接种，接种点附近载荷基因可以稳定存在60天以上，同时载荷基因可以在侧枝和茎内进行传播，截至接种60天，在侧枝可以传播至距离接种点15cm以上，茎可以传播至10cm以上。
30.通过马尾松不同组织新鲜切片的显微荧光观察，喷洒接种后30天，针叶表面和针叶内部仍可以检测到绿色荧光菌株，该菌株不具有红色荧光，表明该荧光菌株为受体菌（图5）；喷洒接种后30天，在茎干表面和内部仍可以观察到较多的受体菌（图6）。注射接种后30天，马尾松侧枝内距离接种点至少15cm，可以观察到较多的受体菌（图7），茎干内注射后30天，马尾松茎干内距离接种点至少15cm，可以观察到较多的受体菌（图8）。上述实验结果表明，通过喷洒和注射，载荷基因可以成功转移给马尾松内生微生物，并可以进行传播，从植
物表面传播至植物组织内部，从接种点向远距离传播，并具有较好的遗传稳定性。
31.本实施例中的各序列如下：序列1：》 pbbr1cccgcgttcctgctggcgctgggcctgtttctggcgctggacttcccgctgttccgtcagcagcttttcgcccacggccttgatgatcgcggcggccttggcctgcatatcccgattcaacggccccagggcgtccagaacgggcttcaggcgctcccgaaggtctcgggccgtctcttgggcttgatcggccttcttgcgcatctcacgcgctcctgcggcggcctgtagggcaggctcatacccctgccgaaccgcttttgtcagccggtcggccacggcttccggcgtctcaacgcgctttgagattcccagcttttcggccaatccctgcggtgcataggcgcgtggctcgaccgcttgcgggctgatggtgacgtggcccactggtggccgctccagggcctcgtagaacgcctgaatgcgcgtgtgacgtgccttgctgccctcgatgccccgttgcagccctagatcggccacagcggccgcaaacgtggtctggtcgcgggtcatctgcgctttgttgccgatgaactccttggccgacagcctgccgtcctgcgtcagcggcaccacgaacgcggtcatgtgcgggctggtttcgtcacggtggatgctggccgtcacgatgcgatccgccccgtacttgtccgccagccacttgtgcgccttctcgaagaacgccgcctgctgttcttggctggccgacttccaccattccgggctggccgtcatgacgtactcgaccgccaacacagcgtccttgcgccgcttctctggcagcaactcgcgcagtcggcccatcgcttcatcggtgctgctggccgcccagtgctcgttctctggcgtcctgctggcgtcagcgttgggcgtctcgcgctcgcggtaggcgtgcttgagactggccgccacgttgcccattttcgccagcttcttgcatcgcatgatcgcgtatgccgccatgcctgcccctcccttttggtgtccaaccggctcgacgggggcagcgcaaggcggtgcctccggcgggccactcaatgcttgagtatactcactagactttgcttcgcaaagtcgtgaccgcctacggcggctgcggcgccctacgggcttgctctccgggcttcgccctgcgcggtcgctgcgctcccttgccagcccgtggatatgtggacgatggccgcgagcggccaccggctggctcgcttcgctcggcccgtggacaaccctgctggacaagctgatggacaggctgcgcctgcccacgagcttgaccacagggattgcccaccggctacccagccttcgaccacatacccaccggctccaactgcgcggcctgcggccttgccccatcaatttttttaattttctctggggaaaagcctccggcctgcggcctgcgcgcttcgcttgccggttggacaccaagtggaaggcgggtcaaggctcgcgcagcgaccgcgcagcggcttggccttgacgcgcctggaacgacccaagcctatgcgagtgggggcagtcgaagggcgaagcccgcccgcctgccccccgagcctcacggcggcgagtgcgggggttccaagggggcagcgccaccttgggcaaggccgaaggccgcgcagtcgatcaacaagccccggaggggccactttttgccggagggggagccgcgccgaaggcgtgggggaaccccgcaggggtgcccttctttgggcaccaaagaactagatatagggcgaaatgcgaaagacttaaaaatcaacaacttaaaaaaggggggtacgcaacagctcattgcggcaccccccgcaatagctcattgcgtaggttaaagaaaatctgtaattgactgccacttttacgcaacgcataattgttgtcgcgctgccgaaaagttgcagctgattgcgcatggtgccgcaaccgtgcggcacccctaccgcatggagataagcatggccacgcagtccagagaaatcggcattcaagccaagaacaagcccggtcactgggtgcaaacggaacgcaaagcgcatgaggcgtgggccgggcttattgcgaggaaacccacggcggcaatgctgctgcatcacctcgtggcgcagatgggccaccagaacgccgtggtggtcagccagaagacactttccaagctcatcggacgttctttgcggacggtccaatacgcagtcaaggacttggtggccgagcgctggatctccgtcgtgaagctcaacggccccggcaccgtgtcggcctacgtggtcaatgaccgcgtggcgtggggccagccccgcgaccagttgcgcctgtcggtgttcagtgccgccgtggtggttgatcacgacgaccaggacgaatcgctgttggggcatggcgacctgcgccgcatcccgaccctgtatccgggcgagcagcaactaccgaccggccccggcgaggagccgcccagccagcccggcattccgggcatggaaccagacctgccagccttgaccgaaacggaggaatgggaacggcgcgggcagcagcgcctgccgatgcccgatgagccgtgttttctggacgatggcgagccgttggagccgccgacacgggtcacgctgccgcgccggtagcacttgggttgcgcagcaacccgtaagtgcg
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32.以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。