一种快速制备T细胞的方法与流程

本发明属于生物领域，具体涉及免疫细胞治疗领域。

背景技术：

1、嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor,car)t细胞是一种细胞治疗产品，利用基因工程改造t细胞，使细胞表面表达识别肿瘤恶性细胞特异性抗原的car分子，引导car-t细胞与恶性细胞结合并启动t细胞杀伤功能。car分子序列结构包含特异性识别抗原的单链抗体序列、影响靶向效率的铰链区、固定car分子于细胞膜上的跨膜区、传递胞内信号的t细胞激活结构域及加强信号传递的胞内共刺激结构域。借由设计靶向不同抗原的单链抗体序列，能够制造出针对表达不同抗原的肿瘤恶性细胞。car基因序列由逆转录病毒载体携带并转导至患者自体或供者异体来源的活化t细胞中，经体外培养扩增后，回输患者体内。在体内，car-t细胞的单链抗体序列与其靶向的肿瘤恶性细胞抗原结合，引起胞内结构域下游信号传递，启动t细胞毒杀功能，达到清除肿瘤恶性细胞的效果。

2、cd19 car-t细胞作为第一个商业化的car-t细胞疗法，在美国已逐渐开始被广泛运用于治疗b-all、lbcl及fl，并有极高的市场收益。然而，高营收的背后是car-t产品的超高定价，在中国两项上市产品定价均约120万人民币，美国产品定价约为40万美元，非常规药物能企及。car-t产品的高定价来自其研发阶段付出的成本远高于一般传统药物，且生产技术复杂，高度要求生产人员及相关设备的准确性及稳定度。如此高昂的价格使产品难以触及有需求的患者。因此，为触及更多患者需思考如何降低定价，也就是从降低car-t细胞生产成本，且不影响car-t细胞质量开始。一般car-t细胞生产过程总时长约在10到25天之间，其中生产人力的调动及各式耗材试剂的使用所形成的成本不可小觑。因此，降低car-t细胞生产成本的根本方式，最直观者为缩短car-t细胞制备时长。缩短car-t细胞制备时长除了可以降低成本，更能避免患者在等待car-t细胞制备完成的期间发生疾病进展的情况。

3、现有技术的car-t细胞制备通常包含以下几个工序：一、患者或供者机采血采集：利用血细胞分离机自患者或供者血液中富集白细胞，低温运输至细胞制备中心；二、自单采血中分离pbmc：手动或自动方式分离富集白细胞中的pbmc，其中含淋巴细胞及单核细胞，去除大部分红细胞、多核细胞、血小板及血浆。三、自pbmc中分离及活化t细胞：利用共价偶联抗-cd3和/或抗-cd28抗体的磁珠或其他固体相界面与pbmc共同孵育后，磁性分离与磁珠结合的t细胞；四、car基因修饰t细胞：利用病毒载体或其他基因转导方式将car基因序列转入t细胞中，使其在细胞表面上表达car分子；五、car-t细胞体外扩增：将car-t细胞于细胞培养板、细胞培养瓶或细胞培养袋中进行扩增培养；六、car-t细胞灌装及冻存：收获car-t细胞并保存于液氮中备用。

4、以上多数工序可在一天内操作完成，但car-t细胞体外扩增工序为速率决定步骤，且根据细胞原材料的个体化差异及不同的所需剂量，扩增时间一般不低于三天，且可能长至十天以上。

技术实现思路

1、为了car-t细胞缩短制备时长，本发明提供了一种制备表达功能分子的t细胞的方法。所述方法包括步骤：

2、1)pbmc复苏缓解1～4小时，优选2-3小时，

3、2)由pbmc分选并活化cd3+t细胞10～36小时，优选15～24小时，

4、3)使用含有功能分子的编码序列的逆转录病毒转导cd3+t细胞得到所述表达功能分子的t细胞，所述转导包括共培养逆转录病毒和cd3+t细胞12-36小时，优选15-24小时。

5、在一个或多个实施方案中，所述功能分子是car。优选为含有抗cd19抗体或其抗原结合片段、铰链区、跨膜区、cd28胞内共刺激结构域、cd3-zeta信号转导结构域的cd19-28z。更优选地，所述抗cd19抗体或其抗原结合片段是抗人cd19抗体单链可变区。

6、在一个或多个实施方案中，所述编码序列构建在逆转录病毒质粒中。

7、在一个或多个实施方案中，步骤1)包括：将pbmc在培养基中以适合pbmc生长的条件培养1～4小时，优选2-3小时。

8、在一个或多个实施方案中，步骤1)中的培养基包括aim-v、x-vivo、dmem、rpmi1640，优选为x-vivo15。所述培养基还添加有乙酰半胱氨酸、glutamax、hepes和人血浆中的一种或多种或全部。

9、在一个或多个实施方案中，适合pbmc生长的条件是约37℃及约5％co2。

10、在一个或多个实施方案中，步骤2)包括：

11、2.1)在dpbs中，使用抗体由pbmc中分选cd3+t细胞，所述抗体包括抗cd3抗体，和

12、2.2)在培养基中以适合cd3+t细胞活化的条件孵育cd3+t细胞12-36小时，优选15-24小时。

13、在一个或多个实施方案中，所述抗体还包括抗cd28抗体。

14、在一个或多个实施方案中，步骤2)中的培养基含il-2。所述培养基包括aim-v、x-vivo、dmem或rpmi1640，优选为x-vivo15。所述培养基还添加有乙酰半胱氨酸、glutamax、hepes和人血浆中的一种或多种或全部。

15、在一个或多个实施方案中，适合cd3+t活化的条件是约37℃及约5％co2。

16、在一个或多个实施方案中，所述抗体是标记的抗体。优选地，所述抗体偶联于固相载体上。更优选地，所述固相载体是磁颗粒。

17、在一个或多个实施方案中，步骤3)包括：在培养基中以适合逆转录病毒转导cd3+t细胞的条件共培养逆转录病毒和cd3+t细胞12-36小时，优选15-24小时。

18、在一个或多个实施方案中，步骤3)中的培养基含il-2。所述培养基包括aim-v、x-vivo、dmem或rpmi1640，优选为x-vivo15。所述培养基还添加有乙酰半胱氨酸、glutamax、hepes和人血浆中的一种或多种或全部。

19、在一个或多个实施方案中，适合逆转录病毒转导cd3+t细胞的条件是约37℃及约5％co2。

20、在一个或多个实施方案中，步骤3)所述转导的转导moi为0.1-2，优选0.5-1.5。

21、在一个或多个实施方案中，步骤3)中，cd3+t细胞的密度为1-5*106cells/ml，优选1*106cells/ml。

22、在一个或多个实施方案中，所述方法还包括去除固相载体的步骤。优选地，去除固相载体的步骤位于步骤3)之后。

23、在一个或多个实施方案中，所述方法还包括步骤：4)将步骤3)获得所述表达功能分子的t细胞冻存；具体包括：以氯化钠注射液洗涤t细胞，以冻存液重悬t细胞，程序降温，和液氮冻存。

24、本发明还提供由本发明方法制备获得的car-t细胞。

25、在一个或多个实施方案中，所述car为含有抗cd19、cd28胞内共刺激结构域、cd3-zeta胞内共刺激结构域的cd19-28z。

26、本发明优点：

27、-将pbmc复苏缓解时长缩短为2小时，不影响复苏后部分死细胞团块成絮，便于使用细胞滤网去除的特性；

28、-将cd3+t细胞的分选活化培养时长缩短为22-24小时，细胞可以得到适当的活化且不影响后续的病毒转导；

29、-细胞悬液不去除磁性颗粒，保留部分活化功能，直接进行病毒转导；

30、-去除car-t细胞体外扩大培养工序，在完成病毒转导时，去除磁珠后冻存car-t细胞，大幅缩短car-t细胞总制备时长。