水溶液稳定性碱性蛋白酶2709突变体及其制备方法和应用

1.本发明属于蛋白质工程改造技术领域，具体涉及一种水溶液稳定性碱性蛋白酶2709突变体及其制备方法和应用。


背景技术：

2.碱性蛋白酶2709是由细菌原生质体诱变选育出的地衣芽孢杆菌2709经深层发酵、提取及精制而成的一种蛋白水解酶，最适温度为40℃，最适ph值为10.5。它是一种丝氨酸型的内切蛋白酶，在一定温度、ph值下能将大分子的蛋白质水解成多肽及氨基酸等产物，具有较强的分解蛋白质的能力。广泛应用于皮革加工、纺织和洗涤剂中。在皮革加工中，碱性蛋白酶2709可分解毛、表皮同真皮层连接处的蛋白质，使毛同皮的联结松开而脱毛；在纺织加工中，主要用来解决羊毛仿羊绒物质的生硬、粗糙等问题，并能改善和提高丝绸与棉、麻、毛等纤维混纺产品的手感和风格；在洗涤方面，能与洗涤剂配方成分有更好的配伍性，大幅度提高洗涤去污能力，对血渍、汗渍、奶渍、油渍等蛋白类污垢，有很好的洗涤效果。
3.但是，碱性蛋白酶常常会因保存不当而造成酶活力下降影响其使用效果。碱性蛋白酶产品开启后要尽量使用完毕，因为空气的进入以及周围环境温度的变化，容易滋生细菌，其次接触碱性蛋白酶的器皿要保持干净无污染。固体形态的酶制剂相较其液体形态要稳定，如葡萄糖氧化酶干粉0℃下可保存2年，-15℃下可保存8年。液态酶制剂因含水量大，导致其水溶液稳定性差，保质期短，酶活相比固态更容易损失。因此，提高蛋白酶在水溶液中的稳定性非常重要。


技术实现要素：

4.针对上述问题本发明提供了一种水溶液稳定性碱性蛋白酶2709突变体及其制备方法和应用。
5.为了达到上述目的，本发明采用了下列技术方案：
6.本发明提供了一种水溶液稳定性碱性蛋白酶2709突变体，所述碱性蛋白酶2709突变体依据氨基酸侧链的疏水性参数
△g′
值，即乙醇和水之间自由能变化比原地衣芽孢杆菌蛋白酶2709亲本序列氨基酸增加1kj/mol及以上，所述碱性蛋白酶2709突变体至少包含有以下位置的疏水性氨基酸修饰中的一个：25、43、57、61、76、96、116、122、127、140、154、160、162、182、184、211、217、239、247、268，其中所述位置对应于氨基酸序列seq id no：1的位置。
7.进一步，所述碱性蛋白酶2709突变体包含以下氨基酸修饰置换中的一种或三种或六种：第61位氨基酸残基突变为丝氨酸、第96位氨基酸残基突变为丙氨酸、第116位氨基酸残基突变为丙氨酸、第122位氨基酸残基突变为酪氨酸、第140位氨基酸残基突变为色氨酸、第160位氨基酸残基突变为丝氨酸、第162位氨基酸残基突变为丝氨酸、第182位氨基酸残基突变为丝氨酸、第211位氨基酸残基突变为丝氨酸、第217位氨基酸残基突变为丙氨酸、第217位氨基酸残基突变为丝氨酸、第247位氨基酸残基突变为丙氨酸，其中所述位置对应于
氨基酸序列seq id no：1的位置。
8.进一步，所述碱性蛋白酶2709突变体为将第116位氨基酸残基突变为丙氨酸、第140位氨基酸残基突变为丙氨酸、第247位氨基酸残基突变为丙氨酸，其中所述位置对应于氨基酸序列seq id no：1的位置。
9.进一步，所述碱性蛋白酶2709突变体为将第96位氨基酸残基突变为丙氨酸、第122位氨基酸残基突变为丙氨酸、第217位氨基酸残基突变为丙氨酸，其中所述位置对应于氨基酸序列seq id no：1的位置。
10.进一步，所述碱性蛋白酶2709突变体为将第96位氨基酸残基突变为丙氨酸、第116位氨基酸残基突变为丙氨酸、第122位氨基酸残基突变为丙氨酸、第140位氨基酸残基突变为丙氨酸、第217位氨基酸残基突变为丙氨酸、第247位氨基酸残基突变为丙氨酸，其中所述位置对应于氨基酸序列seq id no：1的位置。
11.进一步，所述碱性蛋白酶2709突变体的亲本蛋白为地衣芽孢杆菌的2709碱性蛋白酶。
12.本发明还提供一种上述水溶液稳定性碱性蛋白酶2709突变体的制备方法，对来源于地衣芽孢杆菌的2709碱性蛋白酶结构进行计算机模拟，通过分子动力学计算，以减少蛋白酶发生脱酰胺反应的几率为基准，寻找2709碱性蛋白酶分子中对水溶液稳定性贡献最大的氨基酸残基位点进行蛋白质工程改造，获得比原地衣芽孢杆菌2709碱性蛋白酶亲本序列氨基酸的疏水性参数
△g′
值，即乙醇和水之间自由能变化增加大于等于1kj/mol的突变体，再通过分子动力学方法研究和评估碱性蛋白酶2709突变体在水溶液中稳定性的影响，最终得到具有较高水溶液稳定性能的碱性蛋白酶2709突变体。
13.本发明还提供一种上述水溶液稳定性碱性蛋白酶2709突变体的应用，用于洗涤剂或清洁剂中。
14.本发明还提供一种洗涤剂组合物，所述组合物含有上述水溶液稳定性碱性蛋白酶2709突变体。
15.本发明还提供一种重组宿主细胞，所述宿主细胞为含有上述水溶液稳定性碱性蛋白酶2709突变体的地衣芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌。
16.与现有技术相比本发明具有以下优点：
17.本发明基于亲疏水性能理论设计，用分子动力学计算方法测试改变碱性蛋白酶2709氨基酸分子的亲疏水性能对其在水溶液中稳定性的影响。以减少蛋白酶发生脱酰胺反应的几率为基准，选择2709碱性蛋白酶分子中对水溶液稳定性贡献最大的氨基酸残基位点进行蛋白质工程改造，获得了具有较高水溶液稳定性能的碱性蛋白酶2709突变体。
18.本发明的碱性蛋白酶2709突变体在水溶液中的稳定性与原碱性蛋白酶2709相比均有不同程度的提高。其中六点突变相对三点突变的稳定性提高明显，三点突变比一点突变的稳定性提高显著。而且螺旋和无规则卷曲上的突变相比折叠上的突变，对蛋白酶2709在水溶液中稳定性的影响更大。
19.在不加任何保护剂和稳定剂的前提下，添加本发明碱性蛋白酶2709突变体的标准液体洗涤剂的剩余酶活力更高，稳定性更好，可以用于洗涤剂或清洁剂中。
mncl2·
4h2o，1.415g硼酸，0.68g feso4·
7h2o，13.45mg cucl2·
2h2o，23.5mg znso4·
7h2o，20.2mg cocl2·
6h2o，12.6mg高钼酸钠，0.855g酒石酸钠，溶于500ml水中；溶液g配制方法：36.5g山梨醇，溶于100ml水中。)。将培养的菌液加到98ml gmⅰ中，37℃，200rpm培养约4h；取10ml菌液加入90ml gmⅱ(gmⅱ配制方法：98ml gmⅰ，1ml溶液e，1ml溶液f，混匀。其中，溶液e配制方法：2.16g mgcl2·
6h2o，溶于20ml水中；溶液f配制方法：147mg cacl2溶于20ml水中)中，37℃，200rpm培养约90min；菌体冰水浴30min，4000rpm，4℃离心30min，去上清；加10ml gmⅲ(gmⅲ配制方法：9mlgmⅱ，1ml甘油)，混匀。
30.在500μl感受态细胞中加入5μl重组质粒，置于37℃，200rpm的摇床条件下培养2h，低速离心3min，弃部分上清，均匀涂布于含40μg/ml卡那霉素的脱脂奶粉培养基平板上，37℃恒温培养箱培养12h。次日平板上带有透明圈的单菌落即为含有碱性蛋白酶突变体的重组菌株。
31.重组的含2709碱性蛋白酶突变体的工程菌接种于5ml lb液体培养基(蛋白胨1％，nacl 1％，酵母粉0.5％)中，37℃，200rpm振荡培养12h，将菌液按2％的接菌量分别转接于发酵产酶培养基(糊精1％，可溶性淀粉2％，酵母粉1％，nacl 0.5％，ph值为7.0)中，37℃，200rpm振荡培养84h。发酵完成后，发酵液13000r/min离心15min，然后上清液用0.22μm膜在正压滤器上过滤去除菌体。上清液分别缓慢加硫酸铵固体到碱性蛋白酶突变体的粗酶液中，使硫酸铵浓度至70％，待硫酸铵固体完全溶解，再以13000rpm离心30min，收集沉淀，将沉淀于50mm tris-hcl，100mm nacl，ph＝8的缓冲液透析并用超滤杯超滤浓缩。上样至用相同缓冲液(50mm tris-hcl，100mm nacl，ph＝8)平衡好的superdex75凝胶层析柱(购自ge公司)，收集2709碱性蛋白酶突变体n96a。通过sds-page电泳分析，结果显示为单一条带的蛋白样品。
32.将纯化的野生型碱性蛋白酶2709和碱性蛋白酶2709突变体n96a分别进行酶活测定，碱性蛋白酶及其突变体的蛋白浓度0.2mg/ml，蛋白缓冲液为50mm tris-hcl，100mm nacl，ph＝8.0。酶活测定方法参照gb/t 23527-2009附录b福林法进行。结果如表1所示。
33.实施例3
34.2709碱性蛋白酶突变体n116a的构建和在水溶液中稳定性的分析：
35.用与实施例1相同的方法在野生型碱性蛋白酶2709氨基酸序列第116位引入单点突变n116a，构建2709碱性蛋白酶突变体n116a并分析其在水溶液中的稳定性。
36.对碱性蛋白酶2709在水溶液中的空间构象以及相关热力学数据进行模拟计算显示：碱性蛋白酶2709突变体n116a比野生型碱性蛋白酶2709在水溶液中的稳定性好。
37.构建的2709碱性蛋白酶突变体n116a通过sds-page电泳分析，结果显示为单一条带的蛋白样品，其氨基酸序列如seq id no.3所示，酶活测定结果见表1。
38.实施例4
39.2709碱性蛋白酶突变体n122y的构建和在水溶液中稳定性的分析：
40.用与实施例1相同的方法在野生型碱性蛋白酶2709氨基酸序列第122位引入单点突变n122y，构建2709碱性蛋白酶突变体n122y并分析其在水溶液中的稳定性。
41.对碱性蛋白酶2709在水溶液中的空间构象以及相关热力学数据进行模拟计算显示：碱性蛋白酶2709突变体n122y比野生型碱性蛋白酶2709在水溶液中的稳定性好。
42.构建的2709碱性蛋白酶突变体n122y通过sds-page电泳分析，结果显示为单一条
带的蛋白样品，其氨基酸序列如seq id no.4所示，酶活测定结果见表1。
43.实施例5
44.2709碱性蛋白酶突变体n140w的构建和在水溶液中稳定性的分析：
45.用与实施例1相同的方法在野生型碱性蛋白酶2709氨基酸序列第140位引入单点突变n140w，构建2709碱性蛋白酶突变体n140w并分析其在水溶液中的稳定性。
46.对碱性蛋白酶2709在水溶液中的空间构象以及相关热力学数据进行模拟计算显示：碱性蛋白酶2709突变体n140w比野生型碱性蛋白酶2709在水溶液中的稳定性好。
47.构建的2709碱性蛋白酶突变体n140w通过sds-page电泳分析，结果显示为单一条带的蛋白样品，其氨基酸序列如seq id no.5所示，酶活测定结果见表1。
48.实施例6
49.2709碱性蛋白酶突变体n217a的构建和在水溶液中稳定性的分析：
50.用与实施例1相同的方法在野生型碱性蛋白酶2709氨基酸序列第217位引入单点突变n217a，构建2709碱性蛋白酶突变体n217a并分析其在水溶液中的稳定性。
51.对碱性蛋白酶2709在水溶液中的空间构象以及相关热力学数据进行模拟计算显示：碱性蛋白酶2709突变体n217a比野生型碱性蛋白酶2709在水溶液中的稳定性好。
52.构建的2709碱性蛋白酶突变体n217a通过sds-page电泳分析，结果显示为单一条带的蛋白样品，其氨基酸序列如seq id no.6所示，酶活测定结果见表1。
53.实施例7
54.2709碱性蛋白酶突变体n247a的构建和在水溶液中稳定性的分析：
55.用与实施例1相同的方法在野生型碱性蛋白酶2709氨基酸序列第247位引入单点突变n247a，构建2709碱性蛋白酶突变体n247a并分析其在水溶液中的稳定性。
56.对碱性蛋白酶2709在水溶液中的空间构象以及相关热力学数据进行模拟计算显示：碱性蛋白酶2709突变体n247a比野生型碱性蛋白酶2709在水溶液中的稳定性好。
57.构建的2709碱性蛋白酶突变体n247a通过sds-page电泳分析，结果显示为单一条带的蛋白样品，其氨基酸序列如seq id no.7所示，酶活测定结果见表1。
58.实施例8
59.2709碱性蛋白酶突变体n116a+n140a+n247a的构建和在水溶液中稳定性的分析：
60.用与实施例1相同的方法在野生型碱性蛋白酶2709氨基酸序列第116位、第140位和第247位引入三点突变n116a+n140a+n247a，构建2709碱性蛋白酶突变体n116a+n140a+n247a并分析其在水溶液中的稳定性。
61.对碱性蛋白酶2709在水溶液中的空间构象以及相关热力学数据进行模拟计算显示：碱性蛋白酶2709突变体n116a+n140a+n247a比野生型碱性蛋白酶2709在水溶液中的稳定性好。
62.构建的2709碱性蛋白酶突变体n116a+n140a+n247a通过sds-page电泳分析，结果显示为单一条带的蛋白样品，其氨基酸序列如seq id no.8所示，酶活测定结果见表1。
63.实施例9
64.2709碱性蛋白酶突变体n96a+n122a+n217a的构建和在水溶液中稳定性的分析：
65.用与实施例1相同的方法在野生型碱性蛋白酶2709氨基酸序列第96位、第122位和第217位引入三点突变n96a+n122a+n217a，构建2709碱性蛋白酶突变体n96a+n122a+n217a
并分析其在水溶液中的稳定性。
66.对碱性蛋白酶2709在水溶液中的空间构象以及相关热力学数据进行模拟计算显示：碱性蛋白酶2709突变体n96a+n122a+n217a比野生型碱性蛋白酶2709在水溶液中的稳定性好。
67.构建的2709碱性蛋白酶突变体n96a+n122a+n217a通过sds-page电泳分析，结果显示为单一条带的蛋白样品，其氨基酸序列如seq id no.9所示，酶活测定结果见表1。
68.实施例10
69.2709碱性蛋白酶突变体n96a+n116a+n122a+n140a+n217a+n247a的构建和在水溶液中稳定性的分析：
70.用与实施例1相同的方法在野生型碱性蛋白酶2709氨基酸序列第96位、第116位、第122位、第140位、第217位和第247位引入六点突变n96a+n116a+n122a+n140a+n217a+n247a，构建2709碱性蛋白酶突变体n96a+n116a+n122a+n140a+n217a+n247a并分析其在水溶液中的稳定性。
71.对碱性蛋白酶2709在水溶液中的空间构象以及相关热力学数据进行模拟计算显示：碱性蛋白酶2709突变体n96a+n116a+n122a+n140a+n217a+n247a比野生型碱性蛋白酶2709在水溶液中的稳定性好。
72.构建的2709碱性蛋白酶变体n96a+n116a+n122a+n140a+n217a+n247a通过sds-page电泳分析，结果显示为单一条带的蛋白样品，其氨基酸序列如seq id no.10所示，酶活测定结果见表1。
73.实施例11
74.2709碱性蛋白酶突变体n61s的构建和在水溶液中稳定性的分析：
75.用与实施例1相同的方法在野生型碱性蛋白酶2709氨基酸序列第61位引入单点突变n61s，构建2709碱性蛋白酶突变体n61s并分析其在水溶液中的稳定性。
76.对碱性蛋白酶2709在水溶液中的空间构象以及相关热力学数据进行模拟计算显示：碱性蛋白酶2709突变体n61s比野生型碱性蛋白酶2709在水溶液中的稳定性好。
77.构建的2709碱性蛋白酶突变体n61s通过sds-page电泳分析，结果显示为单一条带的蛋白样品，其氨基酸序列如seq id no.11所示，酶活测定结果见表1。
78.实施例12
79.2709碱性蛋白酶突变体n160s的构建和在水溶液中稳定性的分析：
80.用与实施例1相同的方法在野生型碱性蛋白酶2709氨基酸序列第160位引入单点突变n160s，构建2709碱性蛋白酶突变体n160s并分析其在水溶液中的稳定性。
81.对碱性蛋白酶2709在水溶液中的空间构象以及相关热力学数据进行模拟计算显示：碱性蛋白酶2709突变体n160s比野生型碱性蛋白酶2709在水溶液中的稳定性好。
82.构建的2709碱性蛋白酶突变体n160s通过sds-page电泳分析，结果显示为单一条带的蛋白样品，其氨基酸序列如seq id no.12所示，酶活测定结果见表1。
83.实施例13
84.2709碱性蛋白酶突变体n162s的构建和在水溶液中稳定性的分析：
85.用与实施例1相同的方法在野生型碱性蛋白酶2709氨基酸序列第162位引入单点突变n162s，构建2709碱性蛋白酶突变体n162s并分析其在水溶液中的稳定性。
86.对碱性蛋白酶2709在水溶液中的空间构象以及相关热力学数据进行模拟计算显示：碱性蛋白酶2709突变体n162s比野生型碱性蛋白酶2709在水溶液中的稳定性好。
87.构建的2709碱性蛋白酶突变体n162s通过sds-page电泳分析，结果显示为单一条带的蛋白样品，其氨基酸序列如seq id no.13所示，酶活测定结果见表1。
88.实施例14
89.2709碱性蛋白酶突变体n182s的构建和在水溶液中稳定性的分析：
90.用与实施例1相同的方法在野生型碱性蛋白酶2709氨基酸序列第182位引入单点突变n182s，构建2709碱性蛋白酶突变体n182s并分析其在水溶液中的稳定性。
91.对碱性蛋白酶2709在水溶液中的空间构象以及相关热力学数据进行模拟计算显示：碱性蛋白酶2709突变体n182s比野生型碱性蛋白酶2709在水溶液中的稳定性好。
92.构建的2709碱性蛋白酶突变体n182s通过sds-page电泳分析，结果显示为单一条带的蛋白样品，其氨基酸序列如seq id no.14所示，酶活测定结果见表1。
93.实施例15
94.2709碱性蛋白酶突变体n211s的构建和在水溶液中稳定性的分析：
95.用与实施例1相同的方法在野生型碱性蛋白酶2709氨基酸序列第211位引入单点突变n211s，构建2709碱性蛋白酶突变体n211s并分析其在水溶液中的稳定性。
96.对碱性蛋白酶2709在水溶液中的空间构象以及相关热力学数据进行模拟计算显示：碱性蛋白酶2709突变体n211s比野生型碱性蛋白酶2709在水溶液中的稳定性好。
97.构建的2709碱性蛋白酶突变体n211s通过sds-page电泳分析，结果显示为单一条带的蛋白样品，其氨基酸序列如seq id no.15所示，酶活测定结果见表1。
98.实施例16
99.2709碱性蛋白酶突变体n217s的构建和在水溶液中稳定性的分析：
100.用与实施例1相同的方法在野生型碱性蛋白酶2709氨基酸序列第217位引入单点突变n217s，构建2709碱性蛋白酶突变体n217s并分析其在水溶液中的稳定性。
101.对碱性蛋白酶2709在水溶液中的空间构象以及相关热力学数据进行模拟计算显示：碱性蛋白酶2709突变体n217s比野生型碱性蛋白酶2709在水溶液中的稳定性好。
102.构建的2709碱性蛋白酶突变体n217s通过sds-page电泳分析，结果显示为单一条带的蛋白样品，其氨基酸序列如seq id no.16所示，酶活测定结果见表1。
103.表1野生碱性蛋白酶2709与各实施例中碱性蛋白酶2709突变体的酶活力稳定性比较
[0104][0105][0106]
从表1可以看出：本发明实施例子中突变后的碱性蛋白酶2709在水溶液中的稳定性均有不同程度的提高。其中六点突变相对三点突变的稳定性提高明显，三点突变比一点突变的稳定性提高显著。
[0107]
进一步分析发现：突变位点对应于野生蛋白酶2709的二级结构：第116位、第140位、第247位氨基酸分布于蛋白酶2709二级结构的螺旋上，第96位、第122位、第217位氨基酸分布于蛋白酶2709二级结构的折叠上，第61位，第160位。第162位，第182位，第211位分布于无规则卷曲上。结合表1的稳定性数据可以明显看出，螺旋和无规则卷曲上的突变相比折叠上的突变，对蛋白酶2709在水溶液中稳定性的影响更大。
[0108]
实施例17
[0109]
在不加任何保护剂和稳定剂的前提下，分别添加相同量的野生2709碱性蛋白酶和实施例2～16制备的碱性蛋白酶2709突变体于标准液体洗涤剂(国标配方qb/t1224-2007)中，测其酶活力，酶活测定方法参照gb/t 23527-2009附录b福林法进行。
[0110]
结果如图1所示，从图1中可以明显看出本发明的碱性蛋白酶2709突变体相比野生2709碱性蛋白酶在上述洗涤剂体系中均有更好的稳定性。表明本发明2709碱性蛋白酶突变体可用于洗涤剂或清洗剂。