一种以鱼鳞生产胶原二肽的方法与流程

1.本发明涉及鱼胶原蛋白肽制备领域，具体是一种以鱼鳞生产胶原二肽的方法。


背景技术：

2.胶原蛋白肽是指以胶原组织为原料，通过深度水解获得的具有特殊功能的低分子量的生物活性肽，分子量小，与胶原蛋白相比，胶原蛋白肽更易被人体吸收，吸收率约95%以上，而胶原蛋白的吸收率只有25%。胶原蛋白肽的亲水基团较多，因此水溶性更好，利用降解手段切断胶原蛋白的肽键，使功能性的片断显露出来，使得胶原蛋白肽中存在大量的生物活性组分，包括具有抗氧化、抑制ace活性、抗溃疡、抑制关节炎、提高免疫力、增强骨密度以及预防骨质疏松等生物活性的肽，因此可被广泛应用于化妆品、保健食品和医药制品等领域中。
3.以往胶原蛋白肽的制备原料主要来源于陆生动物的骨骼和皮，但是由于消费者对疯牛病、口蹄疫、禽流感等流行病的顾虑，水产下脚料逐渐成为制备胶原蛋白肽的重要原料。我国是水产大国，水产资源丰富。目前我国水产品加工仍以粗加工为主，精深加工产品的比例不高。在水产加工业高速发展的同时会产生大量的鱼下脚料，例如鱼皮、鱼鳞、内脏、鱼头等，这些下脚料约占原料鱼的40-50%，除了少量用来生产鱼粉和鱼饲料，大部分都被丢弃，不仅造成了资源极大的浪费，而且还会造成环境污染。因此，如何高效利用鱼下脚料中的营养活性物质已经引起国内外科研工作者的高度重视。
4.目前，提取鱼鳞中胶原蛋白二肽的方法大多存在提取率低，或者工艺较复杂，提取时间较长、腥味较重、脂肪残存严重等问题。


技术实现要素：

5.本发明针对现有技术的不足，提供了一种提取率高、产品纯度高、分子量小且集中的以鱼鳞生产胶原二肽的方法。
6.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种以鱼鳞生产胶原二肽的方法，是由以下步骤制得的：1）预处理：将清洗干净的鱼鳞加至3-7％的氯化钠溶液中，搅拌1h，控干水分；再加至0.05mol/l的naoh溶液中，搅拌1d，控干水分；最后加至复合液中浸泡30-50min，清水洗涤至中性，得预处理鱼鳞；所述的，鱼鳞、氯化钠溶液、naoh溶液和复合液的重量比为1：4：3：4。
7.所述的，复合液是由以下重量份的原料制得：氯化铝5-9份、无水磷酸钠6-8份、柠檬酸钠2份、水100份。
8.本发明所用的鱼鳞为罗非鱼、大黄鱼或真鲷加工下脚料。
9.氯化钠溶液和naoh溶液搅拌处理可以去除鱼鳞上非胶原蛋白物质，还可以松散鱼鳞结构，提高其渗透性。复合液中，氯化钙在溶液中易被吸附，保护鱼鳞组织；无水磷酸钠在保护鱼鳞组织的同时进行脱钙；柠檬酸钠可以螯合鱼鳞结构中的网状钙，显著提高胶原二
肽的溶出率。
10.2）变性处理：将预处理鱼鳞和水按照1：2的重量比混合，0.8-1.0mpa条件下，100℃煮沸5min，降温至室温，再升温至100℃煮沸5min，降温至室温，控干水分，烘干，粉碎后过80-100目筛，得变性鱼鳞粉；高温高压条件下进行反复高温煮沸的方法可以破坏鱼鳞中胶原蛋白分子非共价键平衡，使鱼鳞中的胶原蛋白分子迅速解螺旋并发生断裂，显著提高胶原蛋白的提取率。
11.3）胶原蛋白的提取：将变性鱼鳞粉、中性蛋白酶和去离子水混合均匀，甲酸调解ph值为7，50℃条件下提取2-4h，收集上清液，截留分子量为1500-2500da的超滤膜进行脱盐浓缩后，喷雾干燥，得鱼鳞胶原蛋白；所述的，变性鱼鳞粉、中性蛋白酶和去离子水的重量比为100：1-3：300-500。
12.甲酸调解ph值，可以促进酶解反应，使鱼鳞中的三股螺旋结构被彻底破坏，酶解产物分子量小且集中，显著提高胶原二肽提取率。
13.4）激发处理：将鱼鳞胶原蛋白和去离子水按照1：3-5的重量比混合均匀，采用高压微射流在100-120mpa压力下循环处理3次，得激发胶原蛋白液；高压微射流处理可以激发胶原蛋白酶解潜力，提高酶解效率，所得酶解产物中胶原二肽得率高。
14.5）胶原二肽的提取：将复合蛋白酶和纳米二氧化钛加至激发胶原蛋白液中，在ph值6-7、40-50℃的条件下恒温酶解2-3h，灭酶，离心，收集上清液，减压浓缩，喷雾干燥，得胶原二肽。
15.所述的，激发胶原蛋白液、复合蛋白酶和纳米二氧化钛的重量比为1000：1-2：0.2。
16.所述的，复合蛋白酶是由酸性蛋白酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶按照10：2：3的重量比制得的。
17.所述的，纳米二氧化钛的粒径为35-45nm。
18.纳米二氧化钛可以提高酶解效率，降低酶用量，缩短酶解时间。
19.本发明的有益效果：1.本发明的氯化钠溶液和naoh溶液搅拌处理可以去除鱼鳞上非胶原蛋白物质，提高其渗透性；变性处理可以破坏鱼鳞中胶原蛋白分子非共价键平衡，使鱼鳞中的胶原蛋白分子迅速解螺旋并发生断裂，显著提高胶原蛋白的提取率；甲酸调解ph值，使鱼鳞中的三股螺旋结构被彻底破坏，酶解产物分子量小且集中，显著提高胶原二肽提取率；高压微射流处理可以激发胶原蛋白酶解潜力，提高酶解效率，所得酶解产物中胶原二肽得率高。
20.2.本发明方法酶解效率高，酶用量少，酶解时间短，所制备的胶原二肽的分子量小且集中，胶原二肽的提取率高，成品细腻且纯度高，水溶性好，有利于规模化生产。
21.3.本发明的原料为水产加工废弃物，有效避免环境污染，提高资源利用率。
具体实施方式
22.下面将以实施例的方式对本技术作进一步的详细描述，以使本领域技术人员能够实践本技术。应当理解，可以采用其他实施方式，并且可以做出适当的改变而不偏离本技术的精神或范围。为了避免对于使本领域技术人员能够实践本技术来说不必要的细节，说明书可能省略了对于本领域技术人员来说已知的某些信息。因此，以下详细描述不应以限制
性的意义来理解，且本发明的范围仅由所附权利要求界定。以下的实施例便于更好地理解本技术，但并不用来限制本技术的范围。
23.本发明所用的鱼鳞为罗非鱼、大黄鱼或真鲷加工下脚料。
24.实施例1一种以鱼鳞生产胶原二肽的方法，是由以下步骤制得的：1）预处理：将清洗干净的鱼鳞加至5％的氯化钠溶液中，搅拌1h，控干水分；再加至0.05mol/l的naoh溶液中，搅拌1d，控干水分；最后加至复合液中浸泡40min，清水洗涤至中性，得预处理鱼鳞；所述的，鱼鳞、氯化钠溶液、naoh溶液和复合液的重量比为1：4：3：4。
25.所述的，复合液是由以下重量份的原料制得：氯化铝7份、无水磷酸钠7份、柠檬酸钠2份、水100份。
26.本发明所用的鱼鳞为罗非鱼、大黄鱼或真鲷加工下脚料。
27.2）变性处理：将预处理鱼鳞和水按照1：2的重量比混合，0.9mpa条件下，100℃煮沸5min，降温至室温，再升温至100℃煮沸5min，降温至室温，控干水分，烘干，粉碎后过80-100目筛，得变性鱼鳞粉；3）胶原蛋白的提取：将变性鱼鳞粉、中性蛋白酶和去离子水混合均匀，甲酸调解ph值为7，50℃条件下提取3h，收集上清液，截留分子量为1500-2500da的超滤膜进行脱盐浓缩后，喷雾干燥，得鱼鳞胶原蛋白；所述的，变性鱼鳞粉、中性蛋白酶和去离子水的重量比为100：2：400。
28.4）激发处理：将鱼鳞胶原蛋白和去离子水按照1：4的重量比混合均匀，采用高压微射流在110mpa压力下循环处理3次，得激发胶原蛋白液；5）胶原二肽的提取：将复合蛋白酶和纳米二氧化钛加至激发胶原蛋白液中，在ph值6、45℃的条件下恒温酶解2.5h，灭酶，离心，收集上清液，减压浓缩，喷雾干燥，得胶原二肽。
29.所述的，激发胶原蛋白液、复合蛋白酶和纳米二氧化钛的重量比为1000：1.5：0.2。
30.所述的，复合蛋白酶是由酸性蛋白酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶按照10：2：3的重量比制得的。
31.所述的，纳米二氧化钛的粒径为35-45nm。
32.实施例2一种以鱼鳞生产胶原二肽的方法，是由以下步骤制得的：1）预处理：将清洗干净的鱼鳞加至7％的氯化钠溶液中，搅拌1h，控干水分；再加至0.05mol/l的naoh溶液中，搅拌1d，控干水分；最后加至复合液中浸泡30min，清水洗涤至中性，得预处理鱼鳞；所述的，鱼鳞、氯化钠溶液、naoh溶液和复合液的重量比为1：4：3：4。
33.所述的，复合液是由以下重量份的原料制得：氯化铝5份、无水磷酸钠8份、柠檬酸钠2份、水100份。
34.本发明所用的鱼鳞为罗非鱼、大黄鱼或真鲷加工下脚料。
35.2）变性处理：将预处理鱼鳞和水按照1：2的重量比混合，0.8mpa条件下，100℃煮沸5min，降温至室温，再升温至100℃煮沸5min，降温至室温，控干水分，烘干，粉碎后过80-100
目筛，得变性鱼鳞粉；3）胶原蛋白的提取：将变性鱼鳞粉、中性蛋白酶和去离子水混合均匀，甲酸调解ph值为7，50℃条件下提取4h，收集上清液，截留分子量为1500-2500da的超滤膜进行脱盐浓缩后，喷雾干燥，得鱼鳞胶原蛋白；所述的，变性鱼鳞粉、中性蛋白酶和去离子水的重量比为100：1：300。
36.4）激发处理：将鱼鳞胶原蛋白和去离子水按照1：5的重量比混合均匀，采用高压微射流在100mpa压力下循环处理3次，得激发胶原蛋白液；5）胶原二肽的提取：将复合蛋白酶和纳米二氧化钛加至激发胶原蛋白液中，在ph值7、40℃的条件下恒温酶解3h，灭酶，离心，收集上清液，减压浓缩，喷雾干燥，得胶原二肽。
37.所述的，激发胶原蛋白液、复合蛋白酶和纳米二氧化钛的重量比为1000：1：0.2。
38.所述的，复合蛋白酶是由酸性蛋白酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶按照10：2：3的重量比制得的。
39.所述的，纳米二氧化钛的粒径为35-45nm。
40.实施例3一种以鱼鳞生产胶原二肽的方法，是由以下步骤制得的：1）预处理：将清洗干净的鱼鳞加至3％的氯化钠溶液中，搅拌1h，控干水分；再加至0.05mol/l的naoh溶液中，搅拌1d，控干水分；最后加至复合液中浸泡50min，清水洗涤至中性，得预处理鱼鳞；所述的，鱼鳞、氯化钠溶液、naoh溶液和复合液的重量比为1：4：3：4。
41.所述的，复合液是由以下重量份的原料制得：氯化铝9份、无水磷酸钠6份、柠檬酸钠2份、水100份。
42.本发明所用的鱼鳞为罗非鱼、大黄鱼或真鲷加工下脚料。
43.2）变性处理：将预处理鱼鳞和水按照1：2的重量比混合，1.0mpa条件下，100℃煮沸5min，降温至室温，再升温至100℃煮沸5min，降温至室温，控干水分，烘干，粉碎后过80-100目筛，得变性鱼鳞粉；3）胶原蛋白的提取：将变性鱼鳞粉、中性蛋白酶和去离子水混合均匀，甲酸调解ph值为7，50℃条件下提取2h，收集上清液，截留分子量为1500-2500da的超滤膜进行脱盐浓缩后，喷雾干燥，得鱼鳞胶原蛋白；所述的，变性鱼鳞粉、中性蛋白酶和去离子水的重量比为100：3：500。
44.4）激发处理：将鱼鳞胶原蛋白和去离子水按照1：3的重量比混合均匀，采用高压微射流在120mpa压力下循环处理3次，得激发胶原蛋白液；5）胶原二肽的提取：将复合蛋白酶和纳米二氧化钛加至激发胶原蛋白液中，在ph值7、50℃的条件下恒温酶解2h，灭酶，离心，收集上清液，减压浓缩，喷雾干燥，得胶原二肽。
45.所述的，激发胶原蛋白液、复合蛋白酶和纳米二氧化钛的重量比为1000：2：0.2。
46.所述的，复合蛋白酶是由酸性蛋白酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶按照10：2：3的重量比制得的。
47.所述的，纳米二氧化钛的粒径为35-45nm。
48.对比例1和实施例1不同之处在于，步骤1）中，未使用复合液浸泡。
49.对比例2和实施例1不同之处在于，步骤2）中，将0.9mpa条件修改为常压条件。
50.对比例3和实施例1不同之处在于，步骤2）中，将进行100℃煮沸5min，降温至室温，再升温至100℃煮沸5min，降温至室温修改为100℃煮沸10min，降温至室温.对比例4和实施例1不同之处在于，步骤4）中，未使用高压微射流在110mpa压力下循环处理3次。
51.对比例5和实施例1不同之处在于，步骤5）中，未使用纳米二氧化钛。
52.性能测试将实施例1-3和对比例1-5制备的胶原二肽进行性能测试，分子量分布参照《中华人民共和国国家标准gb/t22729-2008》附录a中的方法进行，羟脯氨酸检测方法参照《中华人民共和国国家标准gb/t9695.23-2008》进行，总氮检测方法参照《中华人民共和国国家标准gb/t5009.5-2016》进行，灰分检测方法参照《中华人民共和国国家标准gb/t5009.4-2016》进行，结果如下表1所示。
53.表1 实施例1-3和对比例1-5制备的胶原二肽性能测试结果由表1可知，实施例1-3制备的胶原二肽的各项性能均优于对比例1-5制备的胶原二肽，说明本发明方法制备的胶原二肽的提取率高，酶解产物分子量小且集中，灰分含量小于0.6g/100g。
54.最后应说明的是：以上具体实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述具体实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述实施方式所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施方式和具体
实施例技术方案的精神和范围。