高粱亚糊粉层厚度相关基因的分子标记及应用

1.本发明涉及一种高粱亚糊粉层厚度相关基因的分子标记及应用，属于高粱营养品质改良和作物分子生物学设计育种领域。


背景技术：

2.谷物籽粒的胚乳由最外层的糊粉细胞和最内层的淀粉质胚乳细胞组成，糊粉层主要积累蛋白质、脂质和酚类物质，而淀粉质胚乳主要积累淀粉；在谷物籽粒的成熟阶段，胚乳淀粉的积累速率是不同步的；根据营养积累量，淀粉质胚乳中形成的不同细胞可分为三大类：亚糊粉层细胞、棱柱细胞和中心细胞(laser microdissection-based gene expression analysis in the aleurone layer and starchy endosperm of developing rice caryopses in the early storage phase.rice.8:57；ishimaru t,et al.(2015)spatial distribution of functional components in the starchy endosperm of wheat grains.j.cereal sci.91:102869；shewry pr,et al.(2019)protein accumulation in aleurone cells,sub-aleurone cells and the center starch endosperm of cereals.plant cell rep.33:1607-1615；zheng y,et al.(2014))。在谷类种子中，糊粉层和亚糊粉层是蛋白质的主要储存部位。形态学分析发现，与淀粉胚乳的其他类型的细胞相比，亚糊粉层细胞含有更高的蛋白质含量和更低的淀粉含量，显微观察也显示只有一小部分的淀粉颗粒分布在富含蛋白质的亚糊粉层细胞中；这些结果表明，亚糊粉层细胞可能与淀粉质胚乳中的其他细胞类型起源不同；此外，半薄切片染色可以更直观地显示亚糊粉层中具有丰富的蛋白，如图1所示，事实上，先前的研究已经表明，小麦面粉的亚糊粉蛋白含量平均为54％；因此，亚糊粉层含量与面粉的营养价值直接相关(variation in protein composition within the endosperm of hard wheat.cereal chem.46:293-300；kent n,et al.(1969)subaleuron endosperm cells of high protein content.cereal chem.43:585-601；kent n.(1966)starch synthesis in the cereal endosperm.curr.opin.plant biol.6:215-222；james mg,et al.(2003)spatial distribution of functional components in the starchy endosperm of wheat grains.j.cereal sci.91:102869；shewry pr,et al.(2019))。
3.随着测序技术的发展和成本的降低，越来越多的植物基因组被解析，且精度越来越高，以全基因组基因型为基础，与特定表型进行的关联分析成为了快速获取候选位点的方法。关联分析具有节约时间成本、广度大和精度高等显著优点，逐渐成为研究植物数量性状的有力工具(genetic association mapping and genome organization of maize.current opinion in biotechnology,17:155-160；yu j,et al.(2006))。


技术实现要素：

4.本发明的目的之一是提供一种与高粱亚糊粉层厚度相关基因的分子标记，可用于种质资源的筛选或鉴定，为筛选营养品质高富集的高粱品种提供新的技术手段。
5.本发明的另一个目的是提供与高粱亚糊粉层厚度相关基因分子标记的应用。
6.一种与高粱亚糊粉层厚度相关基因的分子标记，所述的分子标记是使用引物对，以高粱v3.1基因组为模板通过pcr扩增后得到的snp位点，所述的引物对序列如下：
7.seq id no.1：5’ccatgcatgtgtgtaaatattcga-3’，
8.seq id no.2：5’actgactgacgagtatactgca-3’。
9.所述标记在亚糊粉层薄的材料中扩增产物1296位碱基为c，亚糊粉层厚的材料中扩增产物1296位碱基为t。
10.所述相关基因位于高粱第6号染色体上。
11.扩增与高粱亚糊粉层厚度相关基因的分子标记的引物对，其中正向引物序列为seq id no.1，反向引物序列为seq id no.2。
12.与高粱亚糊粉层厚度相关基因的分子标记在种质资源的筛选或鉴定中的应用。
13.所述的应用为使用引物对，以高粱基因组为模板通过pcr扩增后得到的snp位点，亚糊粉层厚的材料基因型在第1296位为t，亚糊粉层厚度薄的材料基因型在第1296位为c，所述的引物对序列如下：
14.seq id no.1：5’ccatgcatgtgtgtaaatattcga-3’，
15.seq id no.2：5’actgactgacgagtatactgca-3’。
16.本发明通过在关联分析和连锁分析相结合的方法挖掘到与亚糊粉层厚度显著相关的snp位点，进而开发出了分子标记。该标记能够显著关联高粱亚糊粉层厚度，但对籽粒大小没有显著影响。因此，本发明的提出为筛选营养品质高富集的高粱品种提供了新的技术手段。
附图说明
17.图1为成熟高粱种子的半薄切片显示营养物质在淀粉质胚乳中的分布。a：考马斯亮蓝染色观察蛋白的分布情况；b：通过schiff试剂染色观察淀粉的分布；
18.图2为全基因组关联分析定位到显著位点6:47313665及候选区段关联分析，
19.图3为sbstp10多态性位点的单倍型分析，
20.其中hap 1、2是2种单倍型，利用最小显著差法进行多重比较，如果在p《0.05水平两组之间具有显著差异，则用不同的小写字母标注。如果有相同的字母标注，则说明两组之间无显著差异。
具体实施方式
21.本发明是通过以下技术方案获得的：
22.一种与高粱亚糊粉层厚度相关基因(序列号：sobic.006g102800)的分子标记，所述相关基因位于高粱第6号染色体上，在收集自世界各地的253份高粱自交系品种中，其对亚糊粉层厚度的表型贡献率为16.2％。本发明通过全基因组关联分析的优点，利用广泛变异种质资源通过关联分析确定候选基因及功能位点，进而开发出了分子标记。
23.与所述基因连锁的分子标记为sa1，扩增与高粱亚糊粉层厚度相关基因的分子标记的引物对，其中sa1正向引物序列为seq id no.1，反向引物序列为seq id no.2。在亚糊粉层厚的材料中分子标记扩增产物为t，表明该材料具有亚糊粉层厚的等位基因的存在，表
现出亚糊粉层厚表型；在亚糊粉层薄的材料中扩增产物为c，表明该材料具有亚糊粉层薄等位基因，表现出亚糊粉层薄表型。
24.下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随具体实施方式的描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
25.实施例1分子标记的获得
26.全基因组关联分析：在253份高粱种质的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms,snp)分析中，其中有99份种质信息来源于我们先前的研究(zhang et al.,2018b)，另外根据之前的重测序和snp检测流程对其余的67份高粱品种进行了分析。简而言之，测序是在illumina hiseq x 10平台上进行的双端测序，平均深度约为～5.67
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。首先对低质量读长(reads)进行严格过滤，将过滤后的reads比对到btx623(v3.1)参考基因组上，再过滤掉重复的reads。随后利用gatk(genome analysis toolkit,version 3.2-2)进行snp位点和插入与缺失位点(insertion and deletion,indels)的变异检测。此外，用于全基因组关联分析(genome-wide association study,gwas)的snp标记的进一步过滤标准如下：1、删除拼接阶段产生的重叠群组装成的长序列片段(scaffolds)；2、去除缺失率(missing rate)大于20％的snp位点；3、保留最小等位基因频率(minor allele frequency,maf)小于5％的snp位点。结果在253份不同的高粱种质资源中共鉴定出4478843个高质量的snp位点。仅snp_6:47313665(6:47313665)与叶片数显著关联(p＝4.4e-08)，能解析16.2％的表型变异(图2中a)。根据高粱自交系btx623参考基因组注释，该snp位于sobic.006g102800基因启动子区。该基因功能注释为mfs超家族-stp糖转运蛋白，因此我们称之为sbstp10。候选区段关联分析以该位点上下游50kb区域内的snp位点和indel位点进行候选区段关联分析，结果出现显著的关联位点“6:47313665”，阈值达到6.89e-09
(图2中b)。
27.连锁不平衡分析：关联分析显著位点的连锁不平衡(linkage disequilibrium,ld)分析所用软件为haploview 4.2(barrett et al.,2005)。随后通过sanger测序对ld分析找到的候选基因sbstp10进行了序列变异分析。所用引物以btx623参考基因组进行设计。以snp_6:47313665为中心进行sal分析，分析显示该范围内存在5个基因，均高度连锁(图2中c)。
28.单倍型分析：重测序数据发现sbstp10上下游3kb范围内共有305个多态性位点(217个snp和88个indel)，候选区段关联分析以该位点上下游50kb区域内的snp位点和indel位点进行候选区段关联分析，结果出现显著的关联位点“6:47313665”，阈值达到6.89e-09
。该多态性位点可以组成2种单倍型，其中单倍型2(hap2)亚糊粉层厚度最厚，为最优单倍型(图3)。
29.实施例2高粱亚糊粉层厚的种质资源的筛选
30.分子标记开发：以高粱自交系btx623为参考序列获得，利用primer 3对多效性6:47313665设计引物对，扩增片段长度3200bp，具体引物对序列如下：
31.上游引物：5’ccatgcatgtgtgtaaatattcga-3’，
32.下游引物：5’actgactgacgagtatactgca-3’。
33.利用本发明的分子标记sa1对收集的253份高粱种质进行亚糊粉层厚度种质筛选：将253份种质种植于北京大田中，苗期收集叶片提取dna，利用sa1引物对进行扩展测序，发现6:47313665为t基因型材料92份，c基因型材料161份。待植株成熟后收取籽粒统计亚糊粉层厚度。通过统计发现，基因型为t的92份材料亚糊粉层厚度平均为0.34，而基因型为c的材料亚糊粉层厚度平均为0.21，由此可见基因型为t的材料均表现出亚糊粉层较厚的表型，而基因型为c的材料表现出亚糊粉层薄的表型(图3)。本标记可以用于亚糊粉层高粱种质的筛选。