BRD9在慢性淋巴细胞白血病诊治中的应用

brd9在慢性淋巴细胞白血病诊治中的应用
技术领域
1.本发明属于生物医药和分子生物学技术领域，具体涉及brd9在慢性淋巴细胞白血病诊治中的应用。


背景技术：

2.公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
3.慢性淋巴细胞白血病(chronic lymphocytic leukemia,cll)，是西方国家成人最常见的白血病类型(每10万人中有4.7例新发病例)，是一种以外周血、次级淋巴组织和骨髓中成熟的cd5
+
cd23
+
b细胞增殖为特征的慢性淋巴增生性疾病。cll的发病机制目前尚不完全清楚。多项研究表明，cll有高度的异质性，其发生发展与多因素有关，如多个因子异常表达、多个信号通路异常激活等。特定的遗传改变为临床过程的预后以及预测对化学疗法和靶向疗法的反应提供了生物标记；而反复发生的遗传改变可确定具有潜在治疗靶点的细胞途径。因此，为提高患者治疗疗效，降低耐药性，延长患者生存期，改善患者生存质量，深入探明cll的发生发展的机制，具有重要的研究和临床意义。
4.溴域结构蛋白9(bromodomain proteins 9,brd9)属于含溴结构域蛋白家族iv，属于高度保守的蛋白结构域。所有brds(大约含110个氨基酸残基)共有一个保守的折叠，由α-螺旋束(αz、αa、αb、αc)组成，通过za loop和bc loop连接在一起，形成了乙酰化赖氨酸残基结合位点的深层疏水口袋。目前已知的人类溴结构域大约有60个，根据结构相似性分为8个亚科。含溴结构域的蛋白家族iv除brd9外还包括6个成员：brpf1、brpf2、brpf3、brd7、atad2和atad2b。
5.尽管含溴结构域蛋白家族iv具有很重要的生理作用，但新近发现的新成员brd9的相关研究数量有限。brd9基因定位于人类染色体5p15.33，是swi/snf染色质重塑复合物的调节亚基之一。brd9在多种肿瘤中高表达，包括aml、肺癌、乳腺癌、滑膜肉瘤等。综合对诸多溴域蛋白家族成员的研究结果都提示我们brd9可能在调控肿瘤的生成和发展中发挥重要作用。但到目前为止，发明人发现，brd9在cll中的作用机制尚无文献报道。


技术实现要素：

6.针对上述现有技术的不足，发明人经长期的技术与实践探索，提供brd9在慢性淋巴细胞白血病诊治中的应用。本发明应用大样本量，应用多种实验方法、从不同水平检测brd9表达情况，并对患者进行随访，完善临床资料，研究两者的异常表达与cll患者的临床特征及预后等的相关性；同时开展细胞株体外试验，探讨brd9表达下调对cll细胞增殖、凋亡的影响，并深入研究brd9与潜在下游分子的调控关系，以期为cll的发病机制研究提供新的思路，并探讨brd9作为cll的新的分子标志物、预后因素和治疗靶点的可行性。基于上述研究成果，从而完成本发明。
7.为实现上述技术目的，本发明采用如下技术方案：
8.本发明的第一个方面，提供检测brd9编码基因及其表达产物水平的物质在制备用于诊断、检测、监测或预测慢性淋巴细胞白血病的进展的产品中的应用。
9.本发明通过研究发现，cll患者的brd9转录及翻译水平均明显高于正常供者，同时，利用brd9表达水平的中位值将患者分为低表达和高表达组，对现有临床数据进行kaplan-meier生存曲线分析显示brd9高表达的患者os降低；采用fisher确切概率法对cll患者临床样本进行统计学分析，可看出brd9高表达与cll患者ighv未突变、血清乳酸脱氢酶及β2微球蛋白具有统计学相关性；随后进行进一步cox分析发现brd9表达水平是影响cll患者预后的独立因素。因此，所述brd9可作为诊断、检测、监测或预测慢性淋巴细胞白血病的进展的生物标志物。
10.本发明的第二个方面，提供一种用于诊断、检测、监测或预测慢性淋巴细胞白血病的进展的产品，其包含基于高通量测序方法和/或基于定量pcr方法和/或基于探针杂交方法检测样品中brd9的转录；或基于免疫检测方法检测样品中brd9表达情况的物质。
11.本发明的第三个方面，提供一种用于诊断、检测、监测或预测慢性淋巴细胞白血病的进展的系统，所述系统包括：
12.i)分析模块，所述分析模块包含：用于确定受试者的待测样品中选自上述brd9编码基因及其表达产物表达水平的检测物质，以及；
13.ii)评估单元，所述评估单元包含：根据i)中确定的所述brd9编码基因及其表达产物的表达水平判断所述受试者患病情况；
14.本发明的第四个方面，提供抑制brd9编码基因及其表达产物和/或活性降低的物质在如下a1)-a4)至少一种中的应用：
15.a1)抑制慢性淋巴细胞白血病细胞增殖或制备抑制慢性淋巴细胞白血病细胞增殖的产品；
16.a2)促进慢性淋巴细胞白血病细胞凋亡或制备促进慢性淋巴细胞白血病细胞凋亡的产品；
17.a3)提高bcl-2抑制剂药物敏感性或制备提高bcl-2抑制剂药物敏感性的产品；
18.a4)治疗慢性淋巴细胞白血病或制备治疗慢性淋巴细胞白血病的产品。
19.本发明的第五个方面，提供一种组合物，所述组合物其活性成分至少包括抑制brd9编码基因及其表达产物和/或活性降低的物质和其他化疗药物。
20.优选的，所述组合物由i-brd9和维奈托克(venetoclax)组成。本发明通过探究药物联合对cll原代细胞增殖及凋亡功能的影响，药物联用组细胞生存率降低，凋亡比例明显增加，证明二者联用具有较强协同效应。
21.上述组合物至少具有如下任意一种或多种应用：
22.a1)抑制慢性淋巴细胞白血病细胞增殖或制备抑制慢性淋巴细胞白血病细胞增殖的产品；
23.a2)促进慢性淋巴细胞白血病细胞凋亡或制备促进慢性淋巴细胞白血病细胞凋亡的产品；
24.a3)提高bcl-2抑制剂药物敏感性或制备提高bcl-2抑制剂药物敏感性的产品；
25.a4)治疗慢性淋巴细胞白血病或制备治疗慢性淋巴细胞白血病的产品。
26.本发明的第六个方面，提供一种治疗慢性淋巴细胞白血病的方法，所述方法包括向患者施用上述抑制brd9编码基因及其表达产物和/或活性降低的物质或上述组合物。
27.与现有技术方案相比，上述一个或多个技术方案具有如下有益效果：
28.上述技术方案首次公开报道了brd9在慢性淋巴细胞白血病诊治中的应用，具体的，上述技术方案通过研究发现，brd9在慢性淋巴细胞白血病患者中异常高表达，进一步分析发现brd9表达水平是影响cll患者预后的独立因素，同时通过抑制brd9表达，可以显著抑制cll细胞增殖，促进cll细胞凋亡，同时研究了cll中brd9对维奈托克药物敏感性的作用，以及brd9靶向抑制剂i-brd9在cll中的治疗潜力。
29.上述技术方案为cll的诊断、预后评估分析提供了更为有利的手段，同时也为开发高效的治疗cll相关药物奠定实验基础并提供新的视野，因此具有良好的实际应用之价值。
附图说明
30.构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
31.图1为本发明实施例中相比于健康供者，brd9在cll患者中mrna表达水平升高图；
32.图2为本发明实施例中相比于健康供者，brd9在cll患者中蛋白表达水平升高图；
33.图3为本发明实施例中表明brd9高表达患者os更短，预后更差；
34.图4为本发明实施例中brd9抑制剂i-brd9抑制cll细胞系mec-1及eheb增殖图；
35.图5为本发明实施例中brd9敲减慢病毒在mec-1细胞中mrna及蛋白水平的表达图；
36.图6为本发明实施例中brd9敲减慢病毒在eheb细胞中mrna及蛋白水平的表达图；
37.图7为本发明实施例中brd9敲减慢病毒转染后，mec-1及eheb细胞增殖减慢图；
38.图8为本发明实施例中brd9敲减后，mec-1及eheb细胞凋亡比例增多图；
39.图9为本发明实施例中brd9敲减后，mec-1及eheb细胞凋亡标志物表达显著差异图；
40.图10为本发明实施例中brd9敲减后的mec-1及eheb细胞对维奈托克治疗更敏感图。
具体实施方式
41.应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本技术提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本技术所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
42.需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本技术的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
43.如前所述，尽管brd9具有很重要的生理作用，但新近发现的新成员brd9的相关研究数量有限。到目前为止，brd9在cll中的尚无文献报道。因此，深入探讨brd9参与cll的发生发展的机制，进一步探讨cll的特异性分子标志物和信号传导通路、寻找并发现更有效的靶向治疗手段成为亟待解决的问题，并具有重要的研究和临床意义。
44.有鉴于此，本发明的一种典型具体实施方式中，提供检测brd9编码基因及其表达产物水平的物质在制备用于诊断、检测、监测或预测慢性淋巴细胞白血病的进展的产品中的应用。
45.本发明通过研究发现，cll患者的brd9转录及翻译水平均明显高于正常供者(图1)，同时，利用brd9表达水平的中位值将患者分为低表达和高表达组，对现有临床数据进行kaplan-meier生存曲线分析显示brd9高表达的患者os降低；采用fisher确切概率法对cll患者临床样本进行统计学分析，可看出brd9高表达与cll患者ighv未突变、血清乳酸脱氢酶及β2微球蛋白具有统计学相关性；随后进行进一步cox分析发现brd9表达水平是影响cll患者预后的独立因素。因此，所述brd9可作为诊断、检测、监测或预测慢性淋巴细胞白血病的进展的生物标志物。
46.其中，所述brd9编码基因及其表达产物均可为人源，所述brd9编码基因的表达产物可以包括其转录产物和翻译产物，如brd9 mrna和brd9蛋白。
47.本发明的又一具体实施方式中，提供一种用于诊断、检测、监测或预测慢性淋巴细胞白血病的进展的产品，其包含基于高通量测序方法和/或基于定量pcr方法和/或基于探针杂交方法检测样品中brd9的转录；或基于免疫检测方法检测样品中brd9表达情况的物质。
48.本发明的又一具体实施方式中，可以采用包括但不限于液相杂交、northern杂交方法、mirna表达谱芯片、核酶保护分析技术、rake法、原位杂交检测样品中brd9的转录；采用包括但不限于elisa、胶体金试纸条、蛋白芯片检测样品中brd9表达情况。
49.所述样品可以为受试者血液相关样品，如受试者外周血。
50.所述产品可以为试剂盒。
51.本发明的又一具体实施方式中，提供一种用于诊断、检测、监测或预测慢性淋巴细胞白血病的进展的系统，所述系统包括：
52.i)分析模块，所述分析模块包含：用于确定受试者的待测样品中选自上述brd9编码基因及其表达产物表达水平的检测物质，以及；
53.ii)评估单元，所述评估单元包含：根据i)中确定的所述brd9编码基因及其表达产物的表达水平判断所述受试者患病情况；
54.其中，所述brd9编码基因及其表达产物均可为人源，所述brd9编码基因的表达产物可以包括其转录产物和翻译产物，如brd9 mrna和brd9蛋白。
55.所述受试者患病情况至少包括对受试者是否患有cll进行诊断以及对患有cll的预后情况进行评估，所述预后情况包括cll患者的生存期。
56.本发明的又一具体实施方式中，提供抑制brd9编码基因及其表达产物和/或活性降低的物质在如下a1)-a4)至少一种中的应用：
57.a1)抑制慢性淋巴细胞白血病细胞增殖或制备抑制慢性淋巴细胞白血病细胞增殖的产品；
58.a2)促进慢性淋巴细胞白血病细胞凋亡或制备促进慢性淋巴细胞白血病细胞凋亡的产品；
59.a3)提高bcl-2抑制剂药物敏感性或制备提高bcl-2抑制剂药物敏感性的产品；
60.a4)治疗慢性淋巴细胞白血病或制备治疗慢性淋巴细胞白血病的产品。
61.抑制brd9编码基因及其表达产物和/或活性降低的物质包括但不限于针对brd9的rna干扰分子或反义寡核苷酸、小分子抑制剂(如i-brd9，cas：1714146-59-4)、sirna(所述sirna序列如seq id no.1-3所示)，实施慢病毒感染或基因敲除的物质以及针对brd9本身或其上下游分子的特异性抗体，如抗brd9抗体。
62.所述bcl-2抑制剂可以为维奈托克(venetoclax)，本发明通过研究发现，brd9敲除进行bcl-2抑制剂-venetoclax药物敏感性的影响，结果显示与对照组相比，brd9敲减mec-1细胞增殖能力明显下降，提示brd9在venetoclax药物敏感性中发挥着重要作用。
63.所述产品可以为药物或者实验试剂，所述实验试剂可供基础研究使用。
64.本发明的又一具体实施方式中，提供一种组合物，所述组合物其活性成分至少包括抑制brd9编码基因及其表达产物和/或活性降低的物质和其他化疗药物。
65.其中，所述抑制brd9编码基因及其表达产物和/或活性降低的物质包括但不限于针对brd9的rna干扰分子或反义寡核苷酸、小分子抑制剂(如i-brd9，cas：1714146-59-4)、sirna(所述sirna序列如seq id no.1-3所示)，实施慢病毒感染或基因敲除的物质以及针对brd9本身或其上下游分子的特异性抗体，如抗brd9抗体。
66.所述化疗药物包括bcl-2抑制剂，具体的，所述bcl-2抑制剂可以为维奈托克。
67.本发明的又一具体实施方式中，所述组合物由i-brd9和维奈托克组成。本发明通过探究药物联合对cll原代细胞增殖及凋亡功能的影响，药物联用组细胞生存率降低，凋亡比例明显增加，证明二者联用联用具有较强协同效应。
68.本发明的又一具体实施方式中，所述由i-brd9和维奈托克的摩尔比为8-12：1，优选为10：1。
69.上述组合物至少具有如下任意一种或多种应用：
70.a1)抑制慢性淋巴细胞白血病细胞增殖或制备抑制慢性淋巴细胞白血病细胞增殖的产品；
71.a2)促进慢性淋巴细胞白血病细胞凋亡或制备促进慢性淋巴细胞白血病细胞凋亡的产品；
72.a3)提高bcl-2抑制剂药物敏感性或制备提高bcl-2抑制剂药物敏感性的产品；
73.a4)治疗慢性淋巴细胞白血病或制备治疗慢性淋巴细胞白血病的产品。
74.所述产品可以为药物或者实验试剂，所述实验试剂可供基础研究使用。
75.根据本发明，当所述产品为药物时，所述药物还包括至少一种药物非活性成分。
76.所述药物非活性成分可以是药学上通常使用的载体、赋形剂及稀释剂等。而且，根据通常的方法，可以制作成粉剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、混悬剂、乳剂、糖浆剂、喷雾剂等的口服剂、外用剂、栓剂及无菌注射溶液形式的剂型使用。
77.所述可以包含的载体、赋形剂及稀释剂等非药物活性成分在领域内是熟知的，本领域普通技术人员能够确定其符合临床标准。
78.本发明的又一具体实施方式中，所述载体、赋形剂及稀释剂包括但不限于有乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯胶、藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石粉、硬脂酸镁和矿物油等。
79.本发明的又一具体实施方式中，本发明的药物可通过已知的方式施用至体内。例
如通过静脉全身递送。可选地经由静脉内、经皮、鼻内、粘膜或其他递送方法进行施用。这样的施用可以经由单剂量或多剂量来进行。本领域技术人员理解的是，本发明中有待施用的实际剂量可以在很大程度上取决于多种因素而变化，如靶细胞、生物类型或其组织、待治疗受试者的一般状况、给药途径、给药方式等等。
80.本发明的又一具体实施方式中，所述药物施用对象可以是人和非人哺乳动物，如小鼠、大鼠、豚鼠、兔、狗、猴、猩猩等，优选为人。
81.本发明的又一具体实施方式中，提供一种治疗治疗慢性淋巴细胞白血病的方法，所述方法包括向患者施用上述抑制brd9编码基因及其表达产物和/或活性降低的物质或上述组合物。
82.以下结合具体实例对本发明作进一步的说明，以下实例仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或按照销售公司所推荐的条件；在本发明没有特别限定，均可通过商业途径购买得到。
83.实施例
84.一、研究方法
85.1.患者信息收集及样本提取：从山东省立医院血液科慢性淋巴细胞白血病(sphcll)数据库中收集了77名初治的cll患者(年龄范围为32-82岁，中位数为62岁)的样本。通过ficoll密度梯度离心法分离患者外周血单个核细胞进行下一步实验。本研究已获得山东省立医院医学伦理委员会的批准。
86.2.细胞及细胞培养：p53缺失/突变型cll细胞系mec-1细胞从加州大学圣地亚哥分校moores癌症中心的陈立光教授处获赠。p53野生型eheb细胞购买自atcc。细胞在imdm(mec-1)和rpmi-1640(eheb和原代细胞)培养基中培养，并添加10％热灭活fbs(gibco,md,usa)，1％青霉素/链霉素混合物和2mm l-谷氨酰胺，并在37℃含5％二氧化碳的潮湿空气中培养。定期检查所有细胞的支原体感染情况。用于体外实验的药物i-brd9(mce，上海)和venetoclax(mce，上海)溶解于dmso(solarbio，北京)中储存。
87.3.慢病毒构建及转染：brd9 shrna的对照和慢病毒载体由吉凯基因构建，慢病毒转染按照制造商的使用说明进行。目标rnai序列如下：shbrd9#1gagcacacctattcagcaa(seq id no.1),shbrd9#2atgaagatacagctgttga(seq id no.2),shbrd9#3aatgacatacaataggcca(seq id no.3),。在细胞培养基中添加嘌呤霉素(sigma-aldrich,usa)以筛选稳定转染的细胞并维持72小时。
88.4.荧光实时定量pcr：trizol试剂(invitrogen)纯化总rna，反转录试剂盒(takara)反转录成cdna。在light cycler 480ii real-time pcr系统(罗氏)上进行荧光实时定量pcr实验，显影剂使用的是sybr green(ag)。每个样品的qpcr进行三次重复，实验结果使用graphpad prism 7.0版统计软件进行统计分析。
89.5.蛋白印迹实验：细胞裂解液使用蛋白裂解缓冲液和1
×
磷酸酶抑制剂(phosstop，罗氏)按照100：1比例制备，用于提取细胞中的总蛋白。使用的抗体如下：抗brd9(a303-781a-m,bethyl)，抗cleaved parp(5625，cst)，抗cycline(4136，cst)，抗cyclind(3300，cst)，抗bcl2(3498，cst)，抗bax(14796，cst)，抗erk(4695，cst)，和抗gapdh(ta-09，zsgb)。
90.6.细胞增殖实验：将细胞密度调整为1
×
104个细胞/100μl/孔，接种到96孔板中。
用cell counting kit-8(dojindo)试剂对细胞的存活率进行评估。即在每个孔中加入cck-8试剂并培养3小时后，使用spectramax m2酶标仪(molecular devices,ca,usa)读取各孔在450nm处的光度值以确定细胞增殖能力。
91.7.细胞凋亡检测：收集各组细胞并使用annexin v-pe/7aad细胞凋亡检测试剂盒进行细胞凋亡检测。使用navios流式细胞仪(beckman coulter，ca，usa)测量凋亡细胞百分比。三次/重复独立实验后分析统计学差异。
92.8.统计分析：所有数据的描述均为至少三次独立实验的平均值
±
sem。两组间的统计差异比较采用t检验，方差分析(anova)则用于多组比较。相关性分析采用spearman相关系数衡量。所有的统计学分析均采用spss 22.0和graphpad prism 7.0统计软件进行分析。
93.二、研究结果
94.通过qpcr检测对77例cll患者与17例健康供者在brd9基因的mrna表达进行比较，western实验对两组人群的brd9基因蛋白表达进行比较，发现cll患者的brd9转录(供者9.459e-2
±
4.121e-2，n＝17vs.cll患者1.089
±
0.022，n＝77，p《0.001，图1)及翻译水平(图2)均明显高于正常供者。
95.利用brd9表达水平的中位值将患者分为低表达和高表达组，对现有临床数据进行kaplan
–
meier生存曲线分析显示brd9高表达的患者os降低(图3)；采用fisher确切概率法对cll患者临床样本进行统计学分析，可看出brd9高表达与cll患者ighv未突变(p＝0.043)、血清乳酸脱氢酶(p＝0.01)及β2微球蛋白(p＝0.039)具有统计学相关性；随后进行进一步cox分析发现brd9表达水平是影响cll患者预后的独立因素(hr＝3.553,p《0.001)。
96.在细胞株及cll患者原代细胞中分别进行brd9靶向抑制剂i-brd9的cck-8增殖实验，发现i-brd9对两种cll细胞系(mec-1及eheb)及cll原代细胞均有显著的抑制作用，且呈时间-剂量依赖性(图4)。
97.为探究brd9对肿瘤细胞功能的影响，用慢病毒转染的方式敲减mec-1及eheb细胞株中brd9基因的表达，与转染阴性对照慢病毒的细胞相比，序列2及3病毒敲降效率可达到50％-60％(图5，图6)。随后对敲减细胞进行增殖、凋亡的检测。
98.与转染对照组相比，慢病毒转染mec-1细胞后，细胞增殖减慢(图7)；随后，应用westernblot技术及流式细胞术对mec-1细胞凋亡功能进行了检测。与转染对照组相比，流式结果显示慢病毒转染后凋亡细胞明显增加(图8)，westernblot显示凋亡相关蛋白表达显著变化，bcl-2蛋白表达下降，bax蛋白表达升高，提示brd9影响细胞凋亡(图9)。
99.同时在原代细胞中按一定浓度梯度加入抑制剂i-brd9，发现随药物浓度增大，细胞凋亡数量呈梯度增高。
100.鉴于brd9对于细胞凋亡功能的显著影响，探究brd9敲除进行bcl-2抑制剂—venetoclax药物敏感性的影响，结果显示与对照组相比，brd9敲减mec-1及eheb细胞增殖能力明显下降，提示brd9在venetoclax药物敏感性中发挥着重要作用(图10)。
101.随后探究药物联合对来自6位cll患者的原代细胞增殖及凋亡功能的影响，药物联用组细胞生存率降低，凋亡比例明显增加。应用chou-talal中效分析法，由compusyn软件计算出10μm的i-brd9与1μm的venetoclax联用后各ci值，说明两药联用具有较强协同效应。
[0102][0103]
以上所述仅为本技术的优选实施例而已，并不用于限制本技术，对于本领域的技术人员来说，本技术可以有各种更改和变化。凡在本技术的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本技术的保护范围之内。