一类氮杂吲哚半花菁类染料、其合成方法和应用

1.本发明属于有机染料技术领域，涉及一类氮杂吲哚半花菁类荧光化合物、其合成方法，以及在生物和医药领域的应用。


背景技术：

2.花菁(cyanine，简称cy)染料是一类重要有机小分子染料，其历史可以追溯到十九世纪五十代。自1856年greville williams报道合成了第一种花菁染料奎林蓝以来，花菁染料的相关研究迅速发展起来，各种各样不同结构的花菁染料及其衍生物材料不断被合成出来。人们通过对花菁染料中大的π共轭体系和离域的电子分布的调控，设计、制备具有特殊的光物理和光电学性质的有机染料，从而满足不同的应用需求。目前菁染料的研究应用受到广泛重视是其应用于生物识别成像、核酸标记、dna测序等领域以及肿瘤光动力和光热治疗等方面。
3.由于很多染料的吸收和发射波长较短，而短波长的光在进入生物组织内部时较为困难，同时生物样品中某些成分的自发荧光形成很强的背景干扰，使生物体内深层成像和光动力等方面的效率大大降低。目前，调节花菁染料分子的最大吸收和发射波长最主要的方式是通过调节其共轭骨架中甲川链的长短。然而，在花菁染料的研究中发现，分子的共轭甲川链越长，染料最大吸收和发射波长越长，但染料的光稳定性也越差。在实际的光化学应用中，染料需要具备较高的光稳定性，而花菁染料的最大问题就是染料在光照下容易产生光漂白现象，花菁染料相较于其他染料较差的光稳定性限制了其应用。
4.因此，研究开发具有较长的吸收和发射波长的同时，还具有优良的光稳定性，且对特殊细胞具有选择性并且毒性小的新型花菁类染料具有重要意义。


技术实现要素：

5.为解决上述问题，本发明提供了一种长波长的近红外氮杂吲哚半花菁类染料、其合成方法以及其在生物和医药领域的应用。
6.本发明的染料具有更长吸收和发射波长以及更好的光稳定性良好的生物相容性和较低的细胞毒性，可以用于生物和医药领域当中。
7.本技术的技术方案如下：
8.本技术的第一方面在于保护一类氮杂吲哚半花菁类荧光化合物，所述的染料具有通式i的结构：
[0009][0010]
通式i中，
[0011]
r1和r3选自氢、卤素、具有1-18个碳的烷基、具有1-18个碳的羧烷基、芳基、烷基磺酸根、芳基磺酸根、烷基磺酸盐或芳基磺酸盐中的一种；更优选自氢、卤素、具有1-8个碳的羧烷基、烷基磺酸根中的一种；最优选自氢。
[0012]
r2选自氢、具有1-18个碳的烷基、具有1-18个碳的羧烷基、具有1-18个碳的烷基磺酸根、具有1-18个碳的烷基磺酸盐、芳基、烷基磺酸根、芳基磺酸根、烷基磺酸盐或芳基磺酸盐中的一种；更优选自氢、具有1-18个碳的烷基、具有1-18个碳的烷基磺酸根、具有1-18个碳的烷基磺酸盐中的一种；更优选自氢、芳基、具有1-8个碳的烷基磺酸盐中的一种；最优选自氢、具有1-18个碳的烷基。
[0013]
r4选自氢、氰基、羧基及具有1-8个碳的酯中的一种；最优选自氰基、羧基及具有1-8个碳的酯。
[0014]
r5选自卤素、具有1-18个碳的烷氧基磺酸根、芳氧基磺酸根、烷氧基磺酸盐、芳氧基磺酸盐、具有1-18个碳的烷基亚胺基、芳基亚胺基中的一种；更优选自卤素、苯氧基磺酸根、具有1-8个碳的烷基亚胺基中的一种；最优选自卤素。
[0015]
本技术的第二方面在于保护一类氮杂吲哚半花菁类荧光化合物的合成方法，包括以下步骤：
[0016]
(1)在有机溶剂中，60-90℃下，含r1取代的2,3,3-三甲基-3h-吡咯并[2,3-b]吡啶y-1与n烷基化试剂r2取代的卤代烷烃反应，反应3-24h，转变为含n-r2取代侧链的y-2。化合物y-1和n烷基化试剂的摩尔比为1:1-10，更优摩尔比为1:2-5。化合物y-2经有机溶剂重结晶得纯品。
[0017]
(2)在0-30℃下，将相应的三卤氧磷缓慢滴加到dmf和二氯甲烷的混合溶液中，dmf和二氯甲烷的体积比为1:1-5，搅拌0.5-3h，至室温，加入r3取代的环己酮，升温回流反应5h后中和反应，得到中间产物s-1。
[0018]
(3)将中间产物y-2和中间产物s-1加入到有机溶剂中，升温至80-130℃回流反应1-3h，旋蒸除去溶剂，并经硅胶柱纯化得到中间产物y-3。中间产物y-2和中间产物s-1摩尔比为1:1-3。
[0019]
(4)将中间产物y-3和氰类化合物溶于甲醇中，加入少量哌啶作为催化剂，室温搅拌反应5h，过滤得到中间产物y-4。中间产物y-3和氰类化合物的摩尔比为1:5-10。
[0020]
(5)将中间产物y-4溶于有机溶剂中，加入相应的r5侧链和碳酸钠在25-80℃下反应，得到氮杂吲哚半花菁类荧光化合物i。
[0021][0022]
进一步优选的，在上述步骤(1)中，有机溶剂选自乙醇、苯、甲苯、邻二氯苯中的至少一种。重结晶溶剂选自甲醇、乙醇、乙腈、乙酸乙酯、乙醚、丙酮、丙醇的任意一种或几种组合的混合溶剂。
[0023]
进一步优选的，在上述步骤(3)中，有机溶剂选自苯、甲苯、邻二氯苯、甲醇、乙醇、丙醇、丁醇的任意一种或几种组合的混合溶剂。
[0024]
进一步优选的，在上述步骤(4)中，氰类化合物选自乙腈、丙二腈、氰基乙酸或具有1-8个碳的氰基乙酸酯的任意一种。
[0025]
进一步优选的，在上述步骤(4)中，有机溶剂选自甲醇、乙醇、乙腈、乙酸乙酯的任意一种或几种组合的混合溶剂。
[0026]
进一步优选的，在上述步骤(5)中，有机溶剂选自甲醇、乙醇、乙腈、二氯甲烷的任意一种或几种组合的混合溶剂。
[0027]
进一步优选的，在上述步骤(5)中，若基团r5选自卤素，则获得氮杂吲哚半花菁类荧光化合物i。
[0028]
本技术的第三方面在于保护一类氮杂吲哚半花菁类荧光化合物的应用，所述的氮杂吲哚半花菁类荧光化合物作为半花菁染料，用于细胞成像、蛋白标记、抗体的特异性识别、核酸标记、dna测序方面以及用于制备肿瘤光动力及光热治疗的制剂等技术领域。
[0029]
进一步优选的，本发明所述的氮杂吲哚半花菁类荧光化合物在检测应用时荧光成像发射波长为600-950nm。
[0030]
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0031]
(1)本发明所述的氮杂吲哚半花菁类染料具有更长的吸收和发射波长。
[0032]
本技术实施例制备的化合物1具有近红外光吸收，最大吸收和发射波长分别为711nm和733nm，相较于同类型的传统吲哚半花菁类染料化合物3的最大吸收和发射波长630nm和693nm分别红移了81nm和40nm。该类氮杂吲哚半花菁类染料相较于传统吲哚半花菁类染料的最大发射波长大幅度红移，使该类染料更适合应用于长波长吸收和发射的场景，可以很好的用于深层生物体内成像和肿瘤治疗领域当中。
[0033]
(2)本发明所述的染料相较于传统半花菁染料光稳定性较好。本发明实施例在乙醇中测定了浓度为4μmol/l的化合物1和化合物2在氙灯光源照射下的光稳定性，2h内吸收强度无明显下降，表明这类氮杂吲哚半花菁染料具有良好光稳定性。
[0034]
(3)本发明所述的染料具有良好的生物相容性。本发明实施例中使用最大浓度为32μmol/l的化合物1和化合物2培养mcf-7细胞24h后，细胞仍然显具有较好的存活率，说明这类氮杂吲哚半花菁染料具有非常好的生物相容性，在工作浓度范围内不会对细胞产生毒副作用。
附图说明
[0035]
图1是化合物1的高分辨质谱图；
[0036]
图2是化合物2的质谱图；
[0037]
图3是化合物3的高分辨质谱图；
[0038]
图4是化合物1-3在乙醇中的归一化吸收光谱图；
[0039]
图5是化合物1-3在乙醇中的归一化荧光光谱图；
[0040]
图6是化合物1和2在乙醇中2h内的光稳定性；
[0041]
图7是化合物1和2的mtt实验图。
具体实施方式
[0042]
以下，进一步对本发明进行详细说明。
[0043]
除另有说明外，本文中使用的术语具有以下含义。
[0044]
本文中使用x表示术语“卤素”，包括氟、氯、溴和碘。
[0045]
本发明中使用的术语“mtt”指的是一种检测细胞存活和生长的方法。
[0046]
本发明中使用的术语“烷基”包括直链烷基和支链烷基。
[0047]
实施例中所采用的仪器和设备：
[0048]
本发明柱层析过程中，采用购于青岛美高集团有限公司的200-300目、100-200目柱色谱硅胶和购于天大化学试剂厂的20-40目分析纯石英砂。
[0049]
在检测化合物过程中，质谱仪器用美国waters公司的synapt g2-si hdms高分辨质谱仪，采用双喷针电喷雾离子源，对化合物进行正负模式检测。
[0050]
染料的吸收、发射光谱以及光稳定性用agilent公司的cary 60紫外可见分光光度计和cary eclipse荧光分光光度计测得。
[0051]
细胞毒性试验用美国thermofisher公司的varioskan lux multimode microplate reader仪器测得。
[0052]
实施例1制造化合物1
[0053]
化合物1的结构式：
[0054][0055]
实施例1.1
[0056][0057]
将2,3,3-三甲基-3h-吡咯[2,3-b]吡啶(1g,6.2mmol)和碘甲烷(1.70g,12mmol)加入含20ml丙酮的反应瓶中，在氮气气氛下回流24h。冷却至室温后，使用50ml乙酸乙酯洗涤、干燥，得到棕色固体粉末化合物实施例1.1(1.79g,5.9mmol,y＝95％)。
[0058]
实施例1.2
[0059][0060]
将三氯氧磷(15.6g,101.8mmol)加入到含有混合均匀的15ml dmf与15ml二氯甲烷的反应瓶内，在氮气气氛及冰浴下搅拌30min后，加入环己酮(5g,50.9mmol)并在80℃下回流5h，冷却至室温后，将反应液滴入冰水中，抽滤，得黄色固体化合物实施例1.2(8g,46.5mmol,y＝91.3％)。
[0061]
实施例1.3
[0062][0063]
将化合物实施例1.1(1g,3.3mmol)和化合物实施例1.2(0.85g,5.0mmol)加入到含有混合均匀的10ml正丁醇与4ml甲苯的反应瓶内，在110℃回流反应2h，旋蒸除去溶剂，并经硅胶柱纯化得到化合物实施例1.3(0.2g,0.6mmol,y＝18％)。
[0064]
制造化合物1
[0065]
将化合物实施例1.3(0.2g,0.6mmol)和丙二腈(0.4g,6mmol)加入到10ml甲醇的反应瓶内，然后加入0.1ml哌啶，室温过夜搅拌，抽滤，得到化合物1(0.113g,0.3mmol,y＝50％)。
[0066]
实施例2制造化合物2
[0067]
化合物2的结构式:
[0068][0069]
将化合物实施例1.3(0.15g,0.4mmol)和氰基乙酸叔丁酯(0.56g,4mmol)加入到8ml甲醇的反应瓶内，然后加入0.1ml哌啶，室温过夜搅拌，抽滤，得到化合物2(0.08g,0.18mmol,y＝43％)。
[0070]
实施例3制造化合物3
[0071]
化合物3的结构式：用于作为对比例
[0072][0073]
实施例3.1
[0074][0075]
将2,3,3-三甲基-3h-吲哚(1g,6.3mmol)和碘甲烷(1.70g,12mmol)加入含20ml丙酮的反应瓶中，在氮气气氛下回流24h。冷却至室温后，使用50ml乙酸乙酯洗涤、干燥，得到淡粉色固体粉末化合物实施例3.1(1.85g,6.2mmol,y＝98％)。
[0076]
实施例3.2
[0077][0078]
将化合物实施例3.1(1g,3.3mmol)和化合物实施例1.2(0.85g,5.0mmol)加入到含有混合均匀的10ml正丁醇与4ml甲苯的反应瓶内，在110℃回流反应2h，旋蒸除去溶剂，并经硅胶柱纯化得到化合物实施例3.2(0.26g,0.79mmol,y＝24％)。
[0079]
制造化合物3
[0080]
将化合物实施例3.2(0.2g,0.6mmol)和丙二腈(0.4g,6mmol)加入到10ml甲醇的反应瓶内，然后加入0.1ml哌啶，室温过夜搅拌，抽滤，得到化合物3(0.15g,0.4mmol,y＝66％)。
[0081]
实施例4对化合物1、2和3的紫外可见吸收光谱和荧光光谱测定
[0082]
用万分之一天平精确称量经过真空干燥后的染料，配制2mmol/l的dmf染料母液于棕色样品瓶中，在4℃冰箱中保存备用。
[0083]
测试紫外可见吸收光谱和荧光光谱时，使用移液枪量取6μl的染料母液，并将其溶于含有3ml待测溶剂的石英比色皿中，混合均匀，得到染料的浓度为4.0μmol/l，用于吸收光谱和荧光发射光谱的测试。所有测试均在25℃下完成。
[0084]
如图4所示，通过在乙醇里对吸收光谱的测试结果可知，化合物1的最大吸收波长为711nm，达到了近红外区(650-900nm)，相较于对比分子化合物3最大吸收波长630nm而言，吸收光谱红移高达81nm。
[0085]
如图5所示，通过在乙醇里对发射光谱的测试结果可知，化合物1的最大发射波长为733nm，达到了近红外区(650-900nm)，相较于对比分子化合物3最大发射波长693nm而言，发射光谱红移高达40nm。
[0086]
同时，如图4和图5所示，分子2的最大吸收和发射波分别为620nm和734nm，在拥有较长的吸收和发射波长的同时，其stokes位移高达114nm，而普通的染料stokes位移一般都小于30nm。大的stokes位移可以极大的减少染料用于荧光成像时的信噪比和荧光自猝灭，可以很好的用于生物体内。
[0087]
实施例5对化合物1和2进行光稳定性测试
[0088]
用由实施例4中的母液，使用移液枪量取6μl的染料母液，并将其溶于含有3ml待测溶剂的石英比色皿中，混合均匀，得到染料的浓度为4.0μmol/l，用于光稳定性的测试。所有测试均在25℃下完成。
[0089]
如图6所示，化合物1和2在氙灯光源照射下，2h内吸收强度未发生明显下降，表明该类化合物具有良好的光稳定性。相较于传统的大部分菁染料，如已经商品化的吲哚菁绿(icg)，其在光照2h内吸收强度就会发生明显降低。使得该类染料可以很好的应用于生物识别成像以及肿瘤光动力和光热治疗等领域。
[0090]
实施例6化合物1和2的细胞毒性实验
[0091]
染料分子对细胞的毒性通过mtt测定评估。其原理为：活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性mtt还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲臜(formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜(dmso)能溶解细胞中的甲臜，用酶标仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。
[0092]
在96孔板中接种mcf-7细胞，经过一段时间培养后分别向不同孔中加入一定浓度的化合物1和2，使化合物浓度分别为0-32μmol/l，继续孵育细胞24h后通过mtt实验检测细胞活性。实验数据如图7所示，即使使用最大浓度32μmol/l的化合物1和2培养mcf-7细胞24h后，细胞仍然显示出良好的存活率，说明这类氮杂吲哚半花菁染料具有非常好的生物相容性，在工作浓度范围内不会对细胞产生毒副作用，因此可以应用于生物和医药领域中。
[0093]
以上内容是结合本发明具体的优选实施例对本发明做的进一步阐述，不能认定本发明的具体实施只限于这些说明。对于任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的技术范围内，做出些许变动或者修饰，均将被视为涵盖在本发明的权利要求之内。