一种长链非编码RNAlnc1267在调节细胞增殖与存活中的应用

一种长链非编码rna lnc1267在调节细胞增殖与存活中的应用
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一种长链非编码rna lnc1267在调节细胞增殖与存活中的应用。


背景技术：

2.长链非编码rna(long noncoding rna,lncrna)是由rna聚合酶ii(rna polymerase ii，pol ii)转录而来，长度大于200个核苷酸，通常不具有编码能力，其在多种细胞生物学过程中发挥着至关重要的作用。从第一个lncrna h19被发现，随着rna测序技术及基因芯片技术的进步，已有数以万计lncrnas被揭示，但由于实验验证方法的低通量，大部分lncrnas的功能仍然未知。在哺乳动物跨物种全基因组分析研究中，在同源和位置等效的位点上，与mrna相比，lncrna基因组一级结构保守性极低。从lncrna产生可以看出，产生的lncrna的序列保守性不是很严格，而这种产生的序列多样性使其能够广泛参与基因表达调控和生理代谢调控，但研究发现，少数被发现的跨物种保守lncrnas通常具有更强大的功能。
3.研究发现，lncrna作为重要的细胞功能调控分子，能够通过细胞凋亡、细胞增殖、细胞周期等相关信号通路参与对细胞增殖与存活的调控。例如lncrna dino结合和稳定p53，促进其转录活性，进而促进细胞周期停滞和响应dna损伤的细胞凋亡(an inducible long noncoding rna amplifies dna damage signaling)；lncrna bokas能够通过wnt/βcatenin信号通路抑制食管癌细胞增殖，促进放射诱导的细胞凋亡(targeting wisp1 to sensitize esophageal squamous cell carcinoma to irradiation)；lncrna βfaar通过与traf3ip2和smurf1互作激活nf-κb信号通路介导的β细胞凋亡，进而调节小鼠肥胖期间的胰岛β细胞功能和存活(the long non-coding rna βfaar regulates islet β-cell function and survival during obesity in mice)；lincrna-ror通过与异质核糖核糖核酸i的直接相互作用抑制p53翻译，从而抑制细胞周期停滞和凋亡(the human long non-coding rna-ror is a p53 repressor in response to dna damage)。因此，进一步挖掘lncrna的功能，对于研究细胞增殖和存活具有重要意义，而且对相关疾病的诊治具有重要的潜在价值。


技术实现要素：

4.为了研究长链非编码rna lnc1267潜在的生物学功能，通过在不同细胞中分别过表达及敲低人源lnc1267或小鼠源lnc1267，研究人源lnc1267及小鼠源lnc1267对细胞凋亡、细胞增殖和细胞克隆形成的调控作用。
5.本发明提供了敲低人源长链非编码rna lnc1267或者能够抑制人源长链非编码rna lnc1267表达的物质在促进细胞凋亡，或制备用于促进细胞凋亡的产品中的应用，所述人源长链非编码rna lnc1267的核苷酸序列如seq id no.1所示。
6.本发明还提供了敲低人源长链非编码rna lnc1267或者能够抑制人源长链非编码rna lnc1267表达的物质在抑制细胞增殖，或制备用于抑制细胞增殖的产品中的应用，所述人源长链非编码rna lnc1267的核苷酸序列如seq id no.1所示。
7.本发明还提供了敲低人源长链非编码rna lnc1267或者能够抑制人源长链非编码rna lnc1267表达的物质在抑制细胞克隆形成，或制备用于抑制细胞克隆形成的产品中的应用，所述人源长链非编码rna lnc1267的核苷酸序列如seq id no.1所示。
8.本发明还提供了过表达人源长链非编码rna lnc1267或者能够促进人源长链非编码rna lnc1267表达的物质在促进细胞增殖，或制备用于促进细胞增殖的产品中的应用，所述人源长链非编码rna lnc1267的核苷酸序列如seq id no.1所示。
9.本发明还提供了过表达人源长链非编码rna lnc1267或者能够促进人源长链非编码rna lnc1267表达的物质在促进细胞克隆形成，或制备用于促进细胞克隆形成的产品中的应用，所述人源长链非编码rna lnc1267的核苷酸序列如seq id no.1所示。
10.本发明还提供了敲低小鼠源长链非编码rna lnc1267或者能够抑制小鼠源长链非编码rna lnc1267表达的物质在促进细胞凋亡，或制备用于促进细胞凋亡的产品中的应用，所述小鼠源长链非编码rna lnc1267的核苷酸序列如seq id no.2所示。
11.本发明还提供了敲低小鼠源长链非编码rna lnc1267或者能够抑制小鼠源长链非编码rna lnc1267表达的物质在抑制细胞增殖，或制备用于抑制细胞增殖的产品中的应用，所述小鼠源长链非编码rna lnc1267的核苷酸序列如seq id no.2所示。
12.本发明还提供了敲低小鼠源长链非编码rna lnc1267或者能够抑制小鼠源长链非编码rna lnc1267表达的物质在抑制细胞克隆形成，或制备用于抑制细胞克隆形成的产品中的应用，所述小鼠源长链非编码rna lnc1267的核苷酸序列如seq id no.2所示。
13.本发明还提供了过表达小鼠源长链非编码rna lnc1267或者能够促进小鼠源长链非编码rna lnc1267表达的物质在促进细胞增殖，或制备用于促进细胞增殖的产品中的应用，所述小鼠源长链非编码rna lnc1267的核苷酸序列如seq id no.2所示。
14.本发明还提供了过表达小鼠源长链非编码rna lnc1267或者能够促进小鼠源长链非编码rna lnc1267表达的物质在促进细胞克隆形成，或制备用于促进细胞克隆形成的产品中的应用，所述小鼠源长链非编码rna lnc1267的核苷酸序列如seq id no.2所示。
15.本发明的有益效果：
16.本发明通过研究人源lnc1267及小鼠源lnc1267的表达水平对于细胞凋亡、细胞增殖能力及细胞克隆能力的影响发现：
17.(1)利用锁核苷酸lna分别在hela，hct116和mcf7细胞中敲低人源lnc1267能够显著诱发细胞的凋亡，并且抑制细胞的增殖和细胞克隆的形成；
18.(2)过表达人源lnc1267的慢病毒能够显著促进hela细胞的增殖和细胞克隆的形成。
19.(3)利用反义核苷酸序列aso在nih/3t3细胞中敲低小鼠源lnc1267能够显著诱发细胞的凋亡，并且抑制细胞的增殖和细胞克隆的形成；
20.(4)过表达小鼠源lnc1267的慢病毒能够显著抑制nih/3t3细胞的凋亡，并促进细胞的增殖和细胞克隆的形成。
21.本发明的研究内容提示，敲低人源lnc1267或者能够抑制人源lnc1267表达的物质
可用于促进细胞凋亡，或用于制备促进细胞凋亡的产品；敲低人源lnc1267或者能够抑制人源lnc1267表达的物质可用于抑制细胞增殖或抑制细胞克隆形成，或用于制备抑制细胞增殖或抑制细胞克隆的产品。过表达人源长链非编码rna lnc1267或者能够促进人源长链非编码rna lnc1267表达的物质可用于促进细胞增殖或促进细胞克隆形成，或用于制备促进细胞增殖或促进细胞克隆的产品。敲低小鼠源lnc1267或者能够抑制小鼠源lnc1267表达的物质可用于促进细胞凋亡，或用于制备促进细胞凋亡的产品；敲低小鼠源lnc1267或者能够抑制小鼠源lnc1267表达的物质可用于抑制细胞增殖或抑制细胞克隆形成，或用于制备抑制细胞增殖或抑制细胞克隆的产品。过表达小鼠源lnc1267或者能够促进小鼠源lnc1267表达的物质可用于促进细胞增殖或促进细胞克隆形成，或用于制备促进细胞增殖或促进细胞克隆的产品。
附图说明：
22.图1为rt-qpcr法检测在三种细胞系中敲低人源lnc1267效率的结果图；
23.图2为锁核苷酸lna敲低人源lnc1267后对hela，hct116，mcf7细胞凋亡率的影响结果图；
24.图3为锁核苷酸lna敲低人源lnc1267后对hela，hct116，mcf7细胞增殖能力的影响结果图；
25.图4为锁核苷酸lna敲低人源lnc1267后对hela，hct116，mcf7细胞克隆形成能力的影响结果图；
26.图5为rt-qpcr法检测稳定过表达人源lnc1267的hela细胞系中lnc1267表达水平结果图；
27.图6为过表达人源lnc-1267后cck8法检测hela细胞增殖能力的结果图；
28.图7为过表达人源lnc-1267后检测hela细胞克隆形成能力的结果图；
29.图8为rt-qpcr法检测反义核苷酸(aso)在nih/3t3中敲低小鼠源lnc1267效率的结果图，其中*p《0.0；**p《0.01；***p《0.001；
30.图9为反义核苷酸序列aso敲低小鼠源lnc1267后nih/3t3细胞凋亡率检测结果图；
31.图10为rt-qpcr法检测稳定过表达小鼠源lnc1267的nih/3t3细胞系中lnc1267表达水平结果图；
32.图11为敲低和过表达小鼠源lnc1267后cck8法检测nih/3t3细胞增殖能力的结果图，其中，图11中的a为敲低小鼠源lnc1267后cck8法检测nih/3t3细胞增殖能力的结果图；图11中的b为过表达小鼠源lnc1267后cck8法检测nih/3t3细胞增殖能力的结果图；
33.图12为敲低和过表达小鼠源lnc1267后检测nih/3t3细胞克隆形成能力的结果图，其中，图12中的a为敲低小鼠源lnc1267后检测nih/3t3细胞克隆形成能力的结果图；图12中的b为过表达小鼠源lnc1267后检测nih/3t3细胞克隆形成能力的结果图。
具体实施方式
34.以下结合具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明。本发明所使用的药品、试剂、仪器、设备等如无特殊说明，均可通过商业化途径购买获得，涉及的pcr扩增等分子生物学实验操作如无特殊说明，均为本领域常规实验操作或依照相应试剂的产品说明书
进行。
35.在本发明的前期研究中，我们通过对电离辐射后小鼠pbmc进行基因芯片检测，筛选出lncrna lnc1267，其中，人源lnc1267的核苷酸序列如seq id no.1所示，小鼠源lnc1267的核苷酸序列如seq id no.2所示。为了研究lncrna lnc1267潜在的生物学功能，通过在细胞中分别过表达及下调表达人源lnc1267或小鼠源lnc1267，检测lnc1267对细胞凋亡、细胞增殖和细胞克隆形成的调控作用。
36.本发明用到的细胞为：nih3t3细胞、hela细胞、hct116细胞和mcf7细胞均为实验室保存，lnc1267过表达病毒购自上海吉凯基因化学技术有限公司，敲低人源lnc1267的lna
tm longrna gapmers序列购自丹麦exiqon公司，敲低小鼠源lnc1267的aso序列购自广州锐博生物技术有限公司。
37.本发明涉及的引物序列见表1，敲低人源lnc1267的锁核苷酸序列见表2，敲低小鼠源lnc1267的smart silencer-lncrna序列见表3。
38.表1引物序列
[0039][0040]
表2敲低人源lnc1267的锁核苷酸(lna
tm longrna gapmers)序列
[0041][0042]
表3敲低小鼠源lnc1267的smart silencer-lncrna序列
[0043][0044]
本发明涉及的实验方法如下：
[0045]
1、细胞复苏及培养：
[0046]
(1)从液氮中取出细胞后迅速置于37℃恒温水浴锅中解冻；
[0047]
(2)将充分解冻后的细胞置于台式离心机中，1000rpm离心4min；
[0048]
(3)弃旧培养液，加入1ml预热的完全培养基(含10％fbs，100units/ml青霉素及100μg/ml链霉素)重悬细胞；
[0049]
(4)将细胞并移至10cm细胞培养皿中(10
×
10cm)，培养体系为10ml，轻轻摇匀；
[0050]
(5)将细胞置于细胞培养箱中培养(37℃，含5％co2)，第二天更换新鲜完全培养基，待细胞密度至90％时传代。
[0051]
2、细胞传代：
[0052]
(1)提前预热完全培养基、0.25％trypsin-edta和pbs缓冲液；
[0053]
(2)弃旧培养基，沿侧壁加入2ml pbs漂洗；
[0054]
(3)弃pbs，向皿中加入2ml 0.25％trypsin-edta，置于37℃培养箱中消化细胞；
[0055]
(4)待细胞消化完全后加入2ml完全培养基终止消化，用微量移液器将细胞转移至10ml离心管中，置于台式离心机中1000rpm离心4min；
[0056]
(5)弃上清，用相应的新鲜完全培养基重悬细胞后移至10cm培养皿中轻轻摇匀；
[0057]
(6)将细胞置于细胞培养箱中培养(37℃，含5％co2)，隔天传代。
[0058]
3、细胞接种：
[0059]
(1)取处于对数生长期的细胞，弃旧培养液，2ml pbs漂洗后加入2ml0.25％trypsin-edta于37℃培养箱中充分消化；
[0060]
(2)加入2ml完全培养基中和胰酶，用微量移液器将细胞转移至10ml离心管中，置于台式离心机中1000rpm离心4min；
[0061]
(3)弃上清，用适量完全培养基重悬细胞，使用血球计数板在倒置显微镜下进行细胞计数；
[0062]
(4)根据实验所需接种细胞数目计算所需细胞悬液体积及相应培养体系所需培养基体积(6孔板：2ml；12孔板：1ml；24孔板：500μl；96孔板：100μl)；
[0063]
(5)将细胞置于细胞培养箱中培养(37℃，含5％co2)。
[0064]
4、lna/aso转染：
[0065]
按lip2000转染试剂说明书进行转染。
[0066]
lna转染操作步骤如下：
[0067]
(1)铺板：将生长状态良好的细胞接种6孔板，接种2.5
×
105个细胞/孔；
[0068]
(2)24小时后观察：细胞长势状态良好，汇合度约60-70％，可进行转染；
[0069]
(3)将前一日接种的细胞培养板进行转染前换液，将2ml完全培养液更换为1.25ml的无抗含血清培养液，换液后约1小时进行转染；
[0070]
(4)配制转染混合液：每孔用4μl lna(50μm)加4μl lip2000，稀释液为rpmi1640培养液(无抗无血清)。先将lip2000稀释至124μl(120μl无抗无血清rpmi1640培养基+4μl lip2000)，室温放置5min；再将lna稀释至124μl，将稀释好的lip2000逐滴加入稀释好的lna中，轻轻混匀，室温放置15分钟；将混合液248μl/孔加入6孔板中轻轻晃匀。置于37℃、5％co2、饱和湿度的细胞培养箱中培养。
[0071]
aso转染操作步骤如下：
[0072]
(1)铺板：将生长状态良好的细胞接种12孔板，接种1.2
×
105个细胞/孔；
[0073]
(2)24小时后观察：细胞长势状态良好，汇合度约60-70％，可进行转染；
[0074]
(3)将前一日接种的细胞培养板进行转染前换液，将1ml完全培养液更换为0.625ml的无抗含血清培养液，换液后约1小时进行转染；
[0075]
(4)配制转染混合液：每孔用5μlaso(20μm)加5μl lip2000，稀释液为rpmi1640培养液(无抗无血清)。先将lip2000稀释至125μl，室温放置5min；再将aso稀释至125μl，将稀释好的lip2000逐滴加入稀释好的aso中，轻轻混匀，室温放置15分钟；将混合液250μl/孔加入12孔板中轻轻晃匀。置于37℃、5％co2、饱和湿度的细胞培养箱中培养。
[0076]
5、慢病毒感染：
[0077]
(1)从冰箱取出病毒，冰上缓慢融化。用无抗含10％血清培养基将病毒稀释至滴度为1
×
108tu/ml。人源lv-lnc1267原滴度为5
×
108tu/ml，lv-nc滴度为7.5
×
108tu/ml；小鼠源lv-lnc1267原滴度为4
×
108tu/ml，lv-nc滴度为3
×
108tu/ml；
[0078]
(2)查阅吉凯生物提供的moi表，hela、hct116两种细胞moi都为10，nih3t3细胞moi为20。采用hitransg p感染液，配制感染液：hct116感染4μl病毒/孔+20μl gp+476μl无抗含10％血清培养基，hela感染5μl病毒/孔+20μl gp+475μl无抗含10％血清培养基；nih3t3感染9ul病毒/孔+20ul gp+471ul无抗含10％血清培养基，轻轻混匀；
[0079]
(3)用感染液替换原来培养基，放入37℃培养箱培养24小时进行传代，待病毒感染72h后收取部分细胞鉴定过表达效率，进而获得过表达细胞系。
[0080]
6、细胞凋亡检测实验：
[0081]
(1)用去离子水将凋亡检测试剂盒中10
×
annexin v binding solution稀释为1
×
annexin v binding solution，每个样品中加入100μl轻轻混匀；
[0082]
(2)每个样本加入5μl annexin v/fitc结合物轻轻混匀，再加入5μl pi solution轻轻混匀后室温条件下避光孵育15min；
[0083]
(3)上机前加入300μl 1
×
annexin v binding solution混匀；
[0084]
(4)上机检测：除待分析实验样本外，需设置空白对照组、单染色细胞组(annexin v-fitc和pi组)，空白组及单染组细胞均用h2o2处理诱导细胞凋亡，用于流式细胞分析时调整荧光补偿。
[0085]
7、细胞克隆形成实验：
[0086]
(1)接种克隆：
[0087]
①
病毒感染后72小时或转染24小时后将细胞重新接种于6孔板中，400、800个细胞/孔，每组设置三个复孔；
[0088]
②
将细胞置于细胞培养箱中培养两周至克隆长至合适大小，期间每3-5天更换一次新鲜完全培养基；
[0089]
(2)细胞固定及染色：
[0090]
①
尽量弃旧培养基，加入1ml甲醇固定0.5-1小时；
[0091]
②
弃甲醇，加入1ml吉姆萨染液染色1小时；
[0092]
③
将吉姆萨回收，缓慢冲洗干净孔内残留的染液，自然晾干；
[0093]
④
手动计数克隆并统计，使用扫描仪扫描保存原始图片。
[0094]
8、细胞增殖实验：
[0095]
cck-8法检测细胞增殖：
[0096]
将敲低或过表达细胞系接种于96孔板，密切观察细胞生长状态，于接种后0天、1天、2天、3天、4天、5天，将10μl cck-8加入100μl细胞培养基中，将细胞置于细胞恒温培养箱中孵育3小时，利用酶标仪检测波长在450nm时的吸光度值检测细胞增殖。
[0097]
9、统计学分析：
[0098]
本章节实验数据以均数
±
标准差表示。数据经双侧student’s-t检验进行比较分析(*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001为有统计学意义，n.s.无统计学意义)。
[0099]
实施例1：敲低人源lnc1267后研究其表达变化对细胞凋亡的影响
[0100]
为了明确人源lnc1267功能，利用锁核苷酸lna分别在hela、hct116和mcf7细胞中敲低人源lnc1267后研究其表达变化对细胞凋亡的影响，rt-qpcr法检测三种细胞系敲低效率结果显示转染lna-lnc1267#248h后人源lnc1267表达较对照组分别下调0.69
±
0.09倍、0.494
±
0.0519倍、0.511
±
0.159倍，转染lna-lnc1267#348h后人源lnc1267表达较对照组分别下调0.57
±
0.06倍、0.549
±
0.146倍、0.745
±
0.0039倍(见图1)，而annexinv-fitc/pi检测细胞凋亡率结果显示转染lna-lnc1267#248h后细胞凋亡率分别为16.683
±
0.867％、48.70
±
4.92％、62.10
±
0.55％，转染lna-lnc1267#348h后细胞凋亡率分别为22.600
±
0.866％、43.59
±
4.97％、61.18
±
0.14％，分别较对照组lna-nc(7.963
±
0.697％、9.54
±
1.52％、7.37
±
0.92％)显著提高了细胞凋亡率(p《0.05)(见图2)。
[0101]
实施例2：敲低人源lnc1267后研究其表达变化对细胞增殖能力的影响
[0102]
利用锁核苷酸技术分别在hela、hct116和mcf7内敲低lnc1267，分析其表达下调对细胞增殖能力的影响。cck-8法检测细胞增殖结果显示对照lna-nc组及敲低组lna-lnc1267#2和lna-lnc1267#3在各时间点od
450
值均呈上升趋势，但1天各组之间od
450
值比较，差异无统计学意义(p》0.05)，但在第2-5天敲低组od
450
值均显著低于对照组，差异有统计学意义(p《0.05)，见图3，表明敲低人源lnc1267能显著抑制hela，hct116和mcf7细胞的增殖。
[0103]
实施例3：敲低人源lnc1267后研究其表达变化对细胞克隆形成能力的影响
[0104]
利用锁核苷酸技术分别在hela，hct116和mcf7三种细胞中敲低lnc1267，通过细胞克隆形成实验分析细胞存活能力。克隆形成实验检测结果显示(见图4)，对于hct116细胞，在初始接种800个细胞/孔中敲低组lna-lnc1267#2和lna-lnc1267#3克隆形成率分别为33.42
±
1.880％和37.167
±
1.665％，较对照lna-nc组80.042
±
2.425％显著减少，差异有统计学意义(p《0.05)；对于hela细胞，在初始接种800个细胞/孔中敲低组lna-lnc1267#2和lna-lnc1267#3克隆形成率分别为23.542
±
3.146％和20.625
±
5.449％，较对照lna-nc组42.542
±
2.602％显著减少，差异同样具有统计学意义(p《0.05)；对于mcf7细胞，在初始接种900个细胞/孔中敲低组lna-lnc1267#2和lna-lnc1267#3克隆形成率分别为3.111
±
0.294％和5.370
±
0.339％，较对照lna-nc组23.704
±
0.891％显著减少，差异有统计学意义(p《0.05)。上述结果表明下调lnc1267表达显著抑制hela、hct116和mcf7细胞克隆形成能力。
[0105]
实施例4：过表达人源lnc1267后研究其表达变化对细胞增殖能力的影响
[0106]
我们利用过表达病毒(lv-lnc1267)瞬时感染hela细胞上调lnc1267的表达，转染后对其瞬时过表达效率进行了验证。在实验中，我们设置了过表达病毒感染组(lv-lnc1267)和对照组(lv-nc)，并于感染后72h收获细胞，利用rt-qpcr实验技术检测lnc1267的表达水平，采用actin作为内参。实验结果显示，在hela中，过表达病毒(lv-lnc1267)能够
显著上调lnc1267的表达水平(见图5)。
[0107]
为了进一步确认lnc1267基因对细胞生长的影响，我们利用过表达病毒瞬时感染hela细胞，上调lnc1267的表达后进行细胞增殖实验。在细胞增殖实验中，接种相同数目的过表达lnc1267 hela细胞株(lv-lnc1267)以及对照hela细胞株(lv-nc)，检测第一天到第五天的od
450
值。实验发现，在hela细胞中，过表达lnc1267组od
450
值显著高于对照组(见图6)，表明过表达lnc1267在hela细胞中能够显著增强细胞增殖能力。
[0108]
实施例5：过表达人源lnc1267后研究其表达变化对细胞克隆形成能力的影响
[0109]
为了进一步证实lnc1267基因对细胞生长的影响，我们在hela细胞中上调lnc1267的表达并进行了克隆形成分析实验，研究其相对表达量变化对克隆形成的影响。我们在实验组和对照组中均接种相同数目的细胞，接种24h后用相同的方法进行过表达病毒(lv-lnc1267)感染或对照病毒感染(lv-nc)，感染72h后将实验组(lv-lnc1267)和对照组(lv-nc)重新接种相同数目细胞于六孔板中，将细胞置于细胞培养箱培养，每3-5天更换新鲜培养液，两周后进行克隆形成率的统计。实验发现，上调lnc1267表达后hela细胞的克隆形成明显高于对照组：在hela细胞中，lv-lnc1267克隆形成率为对照组lv-nc的1.36倍(见图7)。上述结果表明，在hela细胞中过表达lnc1267能够明显增强细胞克隆形成能力。
[0110]
实施例6：敲低小鼠源lnc1267后研究其表达变化对细胞凋亡的影响
[0111]
首先我们在nih/3t3细胞中分别转染aso-nc和aso-lnc1267后，检测aso-lnc1267对nih/3t3细胞的敲低情况。于转染后48h收集细胞，用rt-qpcr鉴定aso-lnc1267在nih/3t3细胞的敲低效率。实验结果表明，在小鼠nih/3t3细胞中，我们转染aso-lnc1267后lnc1267表达量为对照aso-nc组的0.597
±
0.166倍，差异具有统计学意义，该结果提示针对lnc1267设计的敲低的序列能够有效的敲低lnc1267的表达，可用于后续的功能研究(见图8)。
[0112]
为了明确lnc1267功能，我们还利用反义核苷酸序列aso在nih/3t3中敲低lnc1267后研究其表达变化对细胞凋亡的影响，结果显示转染aso-lnc126748h后细胞凋亡率为26.757
±
3.206％，较对照组lna-nc(16.023
±
2.013％)显著增加了细胞凋亡率(p《0.05)(见图9)。
[0113]
实施例7：敲低或过表达小鼠源lnc1267后研究其表达变化对细胞增殖能力的影响
[0114]
稳定过表达lnc1267 nih/3t3细胞系构建及过表达效率鉴定：我们将lnc1267全长序列克隆到慢病毒载体(携带嘌呤霉素抗性基因)上，并包装入慢病毒，获得过表达lnc1267病毒，然后感染细胞后利用嘌呤霉素筛选，用rt-qpcr法鉴定lnc1267表达水平，最终获得稳定过表达lnc1267的细胞系。结果发现，稳定过表达lnc1267的细胞系中lnc1267表达水平是感染对照病毒lv-nc细胞系的18.46
±
3.87倍(见图10)，表明稳定过表达lnc1267的nih/3t3细胞系构建成功，可以用于后续实验。
[0115]
在nih/3t3细胞中过表达或敲低小鼠源lnc1267后，利用cck-8方法对过表达或敲低lnc1267的细胞检测细胞增殖能力，分析lnc1267表达对小鼠nih/3t3细胞增殖的影响。结果显示敲低lnc1267后，细胞的增殖能力显著抑制，而在过表达lnc1267后显著增强细胞增殖能力，表明lnc1267表达能够显著促进细胞增殖(见图11)。
[0116]
实施例8：敲低或过表达小鼠源lnc1267后研究其表达变化对细胞克隆形成能力的影响
[0117]
在nih/3t3细胞中过表达或敲低小鼠源lnc1267后，对过表达或敲低lnc1267的细
胞进行细胞克隆形成率的检测。结果显示在敲低lnc1267后aso-lnc1267组的克隆形成能力相较于aso-nc组显著降低(见图12中的a)。而过表达lnc1267后克隆形成能力明显增强(见图12中的b)。表明lnc1267促进nih/3t3细胞的克隆形成能力。
[0118]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。